Abstract
خلال التنمية، تنشأ الخلايا المكونة للدم من مجموعة فرعية متخصصة من الخلايا البطانية، البطانة مكون للدم (HE). تطوير النمذجة سعادة في المختبر أمر ضروري للدراسات الميكانيكية للانتقال-البطانية المكونة للدم ومواصفات المكونة للدم. هنا، نحن تصف طريقة لتحريض الفعال للسعادة من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) عن طريق overexpression من مجموعات مختلفة من عوامل النسخ. يتم استخدام مزيج من ETV2 وGATA1 أو GATA2 TFS للحث على سعادة مع إمكانية عموم الدم النخاعي، في حين أن مجموعة من GATA2 وعوامل النسخ TAL1 يسمح لإنتاج سعادة مع محمر وإمكانات النواءات. إضافة إلى LMO2 GATA2 والجمع بين TAL1 يسرع إلى حد كبير التمايز ويزيد إنتاج خلايا محمر والنواءات. يوفر هذا الأسلوب وسيلة فعالة وسريعة لسعادة تحريض من hPSCs ويسمح لمراقبة البطانية-hematopoietiج الانتقالية في صحن الثقافة. ويتضمن البروتوكول إجراءات hPSCs تنبيغ وتحليل ما بعد تنبيغ معالي والأسلاف الدم.
Introduction
قدرة فريدة من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) لتجديد الذات والتمايز إلى خلايا الطبقات الجرثومية الثلاث، بما في ذلك الدم، وجعلها أداة قيمة للدراسات الميكانيكية للتنمية المكونة للدم، والنمذجة من أمراض الدم، وفحص المخدرات، دراسات السمية، وتطوير العلاجات الخلوية. لأن تشكيل الدم في العائدات الجنين من البطانة مكون للدم (HE) من خلال الانتقال للدم البطانية 1،2، وتوليد سعادة في الثقافات سيكون ضروريا لدراسة الآليات الجزيئية التي تنظم البطانية إلى الانتقال للدم ومواصفات المكونة للدم. وتستند الأساليب الحالية للدراسات سعادة على تحريض التمايز hematoendothelial في المجاميع (EBS) مع إضافة السيتوكينات المكونة للدم 3-5، وcoculture من hPSCs مع خلايا انسجة-تكون الدم داعمة 6،7 أو في الثقافات ثنائية الأبعاد مع خارج الخلية المصفوفات وجytokines 8،9. وتستند هذه الأساليب التمايز الكلاسيكية على إدخال الإشارات الخارجية المؤثرة على سطح الخلية وبدء مجموعات من المسارات الجزيئية التي تؤدي في نهاية المطاف إلى تفعيل برنامج النسخي توجيه التنمية hematoendothelial. وهكذا، فإن كفاءة hPSCs التفرقة في هذه الأنظمة تعتمد على الاستقراء الفعال لتلك الإشارات، نقل الإشارة إلى النواة، وتفعيل الناتجة من المنظمين النسخي محددة. وبالإضافة إلى ذلك، ودراسة سعادة في الثقافات التمايز التقليدية تتطلب خطوة إضافية لعزل سعادة الخلايا باستخدام فرز الخلايا. هنا، نحن تصف بروتوكول بسيط للتحريض مباشر من معالي والدم عن طريق overexpression من عوامل النسخ المكونة للدم. يسمح هذا الأسلوب للتحريض الفعال للسعادة في طبق والملاحظة المباشرة من البطانية على الانتقال للدم دون الحاجة لعزل سعادة باستخدام إجراء فرز الخلايا المرهقة.
تشكيل معالي والدم من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان يمكن أن يتسبب بكفاءة عن طريق overexpressing عدد قليل من عوامل النسخ (TFS). الجمع الأمثل للTFS قادرة على إحداث قوية على عموم النخاعي تكون الدم من hPSCs يشمل ETV2 وGATA1 أو GATA2. في المقابل، مزيج من GATA2 وTAL1 يدفع erythromegakaryocytopoiesis 10. برمجة hPSCs من خلال overexpression من هذه العوامل يفرق hPSCs مباشرة إلى VE-نذل + CD43 - CD73 - سعادة الخلايا التي يكتسب تدريجيا النمط الظاهري للدم الذي حدده التعبير في وقت مبكر للدم علامة CD43 7. هذا الأسلوب القائم على lentiviral للبرمجة مباشرة لالبشري المحفزة طريقة الخلايا الجذعية ينطبق على الجيل معالي وخلايا الدم للدراسات الميكانيكية، دراسات البطانية إلى الانتقال للدم، وتنظيم النسخي التنمية المكونة للدم والمواصفات. على الرغم من أن جيصف بروتوكول urrent إنتاج الدم باستخدام التعبير التأسيسي للالجينات المحورة، يمكن الحصول على نتائج مماثلة باستخدام تعديل مرنا 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الاستعدادات الفيروسات والنسخ عامل دمج
- إعداد الحلول مع pSIN-EF1α lentiviral التعبير البلازميد التي تحتوي على الحمض النووي تشفير البروتين لETV2، GATA1، GATA2، TAL1 وLMO2 (الجدول 1).
- قياس تركيز ونقاء الاستعدادات البلازميد المستخدمة لإنتاج lentiviral عن طريق تسجيل امتصاص الأشعة فوق البنفسجية مع معمل في 230 نانومتر و 260 نانومتر، و 280 نانومتر. تعتبر التحضيرات DNA مما يدل A260 / 280 و A260 / 230 القيم أكبر من 1.8 عموما نوعية جيدة: مذكرة. قد يشير انخفاض A260 / 280 القيم تلوث البروتين، في حين انخفضت A260 / 230 القيم تشير الشوائب مع أملاح أو بعض المذيبات مثل الفينول. الموصى بها تركيز البلازميد هو 1-3 ميكروغرام / ميكرولتر.
- إنتاج lentiviruses لtransductions كما هو موضح في البروتوكولات التي تم نشرها مسبقا 11. تحريض سعادة مع إمكانية عموم الدم النخاعي يتطلب شارك في التعبير عن ETV2 وGATA1، أو ETV2 وGATA2.تحريض سعادة مع إمكانية erythro- والنواءات يتطلب GATA2 وTAL1. إضافة LMO2 تحسن كبير في العائد من الخلايا erythro النواءات من hPSCs بحضور GATA2 وTAL1 10.
2. بروتوكول الثقافة hPSCs
- تنمو الخلايا الجذعية المحفزة في مستعمرات ضيقة مع حواف حادة إلى 70-80٪ confluency قبل subculturing. المستعمرات علامة وإزالة متباينة بشكل عفوي قبل الركض الخلايا.
- تمييع التجاري جل المصفوفة خارج الخلية (انظر الجدول 2) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وألواح معطف 6 جيدا بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، أو لمدة ساعة واحدة على الأقل في 37 ° C قبل استخدامها. قبل الركض الخلايا، ونضح المصفوفة، إضافة 2 مل من culturemedium كاملة تجارية جديدة (انظر الجدول 2) والحفاظ على لوحات في 37 ° C، 5٪ CO 2 حتى الخلايا جاهزة للزرع.
- hPSCs مرور
- ASPIRAالشركة المصرية للاتصالات المتوسطة من بئر واحد متكدسة لوحة 6 جيدا مع hPSCs وإضافة 1.5 مل من قبل تحسنت Dispase حل II (2 ملغ / مل في DMEM / F12، تعقيمها عن طريق الترشيح من خلال 0.22 ميكرون مرشحات). احتضان لمدة 5-7 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 حتى حواف المستعمرات تبدأ لرفع من على سطح الأرض.
- حل نضح Dispase الثاني وبعناية غسل المستعمرات مرتين عن طريق إضافة وثم الشفط 2 مل من الطازجة المتوسطة DMEM / F12. ثم، وذلك باستخدام 5 مل المصلية ماصة الزجاج، فصل hPSCs مع 3 مل من جديد التجاري مستنبت كاملة (انظر الجدول 2) من قبل pipetting تعليق الخلية صعودا وهبوطا عدة مرات.
- إضافة 0.5 مل من خلية إلى تعليق كل بئر من لوحة 6 جيدا تحتوي على 1.5 مل من التجاري مستنبت كاملة (انظر الجدول 2). تستنهض الهمم لوحة ذهابا وإيابا واليمين إلى اليسار عدة مرات لضمان توزيع الخلية موحدة عند توضيع لوحة في الحاضنة. حفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 ل 18-24 ساعة.
- القادم المتوسطة التغيير يوم لالعذبة التجاري مستنبت كاملة (انظر الجدول 2) ودراسة hPSCs التشكل. النتائج الركض الناجحة في مستعمرات صغيرة تعلق جيدا الاحتفاظ hPSC التشكل. يجب أن تغذى hPSCs مع 2.5-3 مل freshmedium لكل بئر على أساس يومي وpassaged كل 4-5 أيام في ما لا يزيد عن 70-80٪ التقاء.
ملاحظة: إذا كان الحفاظ على hiPSCs على الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFS)، فإنها تحتاج إلى أن يتم تحويلها إلى ظروف خالية من تغذية وpassaged 2-3 مرات قبل تنبيغ لضمان كفاءة التمايز.
3. تحريض Hematoendothelial Pprecursors من hPSCs (اليوم 0، تنبيغ من hPSCs)
- لإعداد رد فعل المتوسطة الجمع بين 1.3 مل من التجاري الكامل المصل خالية المتوسطة (انظر الجدول 2)، فيروس، polybrene، وY27632 ROCK المانع (الجدول 1): إضافة 1.3 ميكرولتر من 10 ملي ROCK المانع إلى 1.3 مل المتوسطة إلى concentra النهائينشوئها من 10 ميكرومتر، وpolybrene إلى النهائي تركيز 6 ميكروغرام / مل.
- إضافة كمية مناسبة من التركيز الفيروسي (ق) بتركيز نهائي من 0،5-1،0 زارة الداخلية (تعدد العدوى) من كل فيروس لكل خلية. الحفاظ على رد فعل المتوسطة على الجليد أو على 4 درجات مئوية حتى تعليق خلية واحدة مستعدة لذلك.
ملاحظة: نفس الكمية من وزارة الداخلية لكل الفيروس في GATA1 / ETV2، GATA2 / TAL1، وأخلاط GATA2 / TAL1 / رد فعل LMO2 هو الأمثل لتحريض التمايز. الثقافات ومع ذلك، في ETV2 / GATA2 transduced مضاعفة وزارة الداخلية لGATA2، نسبة إلى ETV2، يعزز التمايز. ويوصى 2 لوزارة الداخلية ETV2 و1 وزارة الداخلية GATA2 (على سبيل المثال إذا يقدر التركيز الفيروسي حوالي 6.8 × 10 7 الجسيمات / مل، إضافة 10 ميكرولتر من ETV2 و 20 ميكرولتر من GATA2 مركزات الفيروسية إلى: ذلك، لهذه الثقافات، ونسبة 1 0.68 × 10 6 خلايا في رد الفعل ETV2 / GATA2 واحد في 35 ملم بئر من لوحة 6 جيدا).
- إضافة كمية مناسبة من التركيز الفيروسي (ق) بتركيز نهائي من 0،5-1،0 زارة الداخلية (تعدد العدوى) من كل فيروس لكل خلية. الحفاظ على رد فعل المتوسطة على الجليد أو على 4 درجات مئوية حتى تعليق خلية واحدة مستعدة لذلك.
- إعداد hPSCs في المعل خلية واحدةension.
- تنمو hPSCs في ظروف خالية من وحدة التغذية كما هو موضح في القسم 2. في يوم 4 بعد مرور الماضي، نلاحظ كثافة الخلايا والتشكل تحت مجهر مقلوب. يجب hPSCs تنمو في مستعمرات ضيقة مع حواف حادة مع عدم وجود التمايز عفوية وتصل ~ 60-70٪ confluency في يوم تنبيغ.
- نضح المتوسطة، إضافة 1.5-2 مل من تفكك خلية التجاري كاشف (الجدول 1) لكل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية مع CO 2 5٪ لمدة 5-7 دقيقة.
- جمع الخلايا في كميات متساوية من المتوسط كاملة التجاري (أنظر الجدول 2) مع 10 ميكرومتر من ROCK المانع، عد الخلايا وتحديد الجدوى. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق ثم الخلايا resuspend في المتوسط كاملة التجاري مع 10 ميكرومتر من ROCK المانع إلى تركيز من 3،4-5 × 10 6 خلايا لكل مل.
ملاحظة: بقاء الخلية أمر بالغ الأهمية لنجاح تنبيغ الفيروسية والتمايز لاحق.عادة، يجب أن بقاء الخلية قبل تنبيغ تتجاوز 90٪.
- إضافة 200 ميكرولتر من تعليق الخلية، التي تحتوي على ،68-1 X10 6 خلايا، إلى 1.3 مل من وسط التفاعل أعد في 3.1.
- نضح حل مصفوفة من بين عشية وضحاها المغلفة لوحة 6 جيدا أعد في 2.2.، نقل خليط التفاعل إلى بئر واحدة من لوحة 6 جيدا وتوزيع الخلايا بالتساوي. احتضان عند 37 درجة مئوية مع CO 2 5٪ لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة يجب أن ترفق لا يقل عن 80٪ من الخلايا إلى المصفوفة.
4. تحريض Hematoendothelial السلائف من hPSCs (يوم 07/01)
- 24 ساعة بعد تنبيغ، وإزالة المتوسطة المحتوية على الفيروس وغسل الخلايا المرفقة مع التجاري مستنبت خلايا غير مكتملة (انظر الجدول 1) ثم قم بإضافة 3 مل لكل بئر من التجاري مستنبت خلايا غير مكتملة تحتوي على السيتوكينات المكونة للدم: SCF 100 نانوغرام / مل، TPO 50 نانوغرام / مل، bFGF 20 نانوغرام / مل (يشار إليها فيما 3F المتوسطة).
- استبدال مجموع المتوسطة مع الطازجة 3F المتوسطة في أيام 2 و 3 و 4 يوم لإزالة الخلايا الميتة والحطام. بعد يوم 4، عندما العائمة الخلايا المكونة للدم في الظهور، استبدال نصف 3F المتوسطة كل يوم مع الحفاظ على الحجم الإجمالي في 4 مل.
ملاحظة: pSIN-EF1α البلازميدات التعبير lentiviral تتضمن بوروميسين الجينات المقاومة مما يسمح لاختيار الإيجابية للخلايا transduced. 1 ميكروغرام / مل من بوروميسين يمكن أن تضاف إلى متوسطة خلال 1-2 أيام الأولى من التمايز للقضاء على أي hPSCs غير متمايزة المتبقية. - مراقبة مورفولوجيا الخلايا في يوم 4 تحت مجهر مقلوب: مجموعات ضيقة من الخلايا البطانية مع التشكل نموذجية تبدأ في الظهور (أرقام 2A، 3A). خلايا الدم مستديرة تظهر من يوم 5 إلى يوم 7 من التمايز، في حين أن بعض المناطق قد تحتفظ hPSCs التشكل. تحليل معالي والتمايز للدم كما هو موضح أدناه.
ملاحظة: تختلف hematoendothelial الناجحالنتائج ينتقم في إنتاج خلايا الدم التي تظهر خلايا الجولة سهل الانكسار كما فضفاضة يعلق على الخلايا البطانية مسطحة الأساسية. هذه الخلايا تتكاثر بنشاط تشكيل مجاميع صغيرة، وأخيرا فصل وتعويم (أرقام 2A و 3A). خلايا الدم الحية يمكن تمييزها بصريا من الخلايا الميتة والموت على أساس قدرتها على عكس ضوء وتوسيع في ظروف الثقافة.
5. تحليل مكون للدم البطانة Endothelium (HE) مرحلة التمايز.
- الكشف عن تشكيل سعادة بين أيام 3 و 4 من التمايز عن طريق الملاحظة المجهرية للخلايا مع التشكل البطانية. لا توجد العائمة خلايا الدم في الثقافة في هذه المرحلة من التمايز. ويمكن التأكد بحضور سعادة التي كتبها تلطيخ مناعي وتحليل تدفق cytometric باستخدام VE كادهيرين، CD73، CD43 CD226 والأجسام المضادة.
- لتقييم تشكيل سعادة بواسطة تدفق cytometric الخلايا استخدام التحليل في اليوم 3ويوم 4 من تجربة واحدة. جمع الخلايا التي يحتضنها الثقافات مع التجاري تفكك خلية الكاشف (انظر الجدول 1) لمدة 5-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 ثم استخدام ما يصل إلى 1 × 10 5 خلايا لكل رد فعل تلطيخ (التدفق الخلوي الإجراء تلطيخ هو موضح في 12).
ملاحظة: VE كادهيرين + HE خلايا اكتساب التعبير في وقت مبكر للدم علامة CD226، ولكنها تفتقر إلى التعبير عن CD73 CD43 و6. في المقابل، خلايا غير HE-التعبير عن CD73 (أرقام 2B، 3B).
- لتقييم تشكيل سعادة بواسطة تدفق cytometric الخلايا استخدام التحليل في اليوم 3ويوم 4 من تجربة واحدة. جمع الخلايا التي يحتضنها الثقافات مع التجاري تفكك خلية الكاشف (انظر الجدول 1) لمدة 5-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 ثم استخدام ما يصل إلى 1 × 10 5 خلايا لكل رد فعل تلطيخ (التدفق الخلوي الإجراء تلطيخ هو موضح في 12).
- تلطيخ المناعي للhPSC المستمدة-HE.
- غسل أحادي الطبقة تعلق الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ثم إصلاح الخلايا في 4٪ امتصاص العرق 30-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الخلايا مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني ثم permeabilize باستخدام 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الخلايا في PBS 2-3 مرات ثم احتضان فيعازلة تمنع تتألف من برنامج تلفزيوني مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، لمدة 30 إلى 120 دقيقة.
- يعد حل تلطيخ، تحتوي على كل الأجسام المضادة الأولية (1: 1000 تمييع) الماوس CD43 مكافحة الإنسان والأرنب مكافحة البشرية VE كادهيرين في برنامج تلفزيوني مع 5٪ FBS، (الجدول 1).
- نضح عازلة تمنع من الخلايا وإضافة 1 مل لكل بئر من العازلة تلطيخ مع الأجسام المضادة الأولية المضافة؛ احتضان 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- غسل الخلايا ثلاث مرات عن طريق إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني مع 5٪ FBS.
- إعداد العازلة تلطيخ الثاني، التي تحتوي على الأجسام المضادة الثانوية في 1: 500 التخفيف في برنامج تلفزيوني مع 5٪ FBS: حمار المضادة للأرنب مترافق مع صبغة الفلورسنت الأخضر، ومكافحة فأر مترافق مع صبغ أحمر فلوري (الجدول 1). إضافة 1 مل لكل بئر من العازلة تلطيخ الثانوي ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني دون المصل. خلايا صمة عار مع حل 300 نانومتر دابي العمل في DH2 O لمدة 10-15 دقيقة.
- غسل الخلايا مع PBS مرتين وإضافة 2-3 مل من برنامج تلفزيوني إلى الخلايا بشكل جيد مع الملون. مراقبة مضان مع الأخضر والأحمر والأزرق مرشحات المجهر.
6. تحليل المستحثة لدم السلائف
- الحفاظ على الثقافات تمايز الخلايا العائمة حتى تتوسع بشكل ملحوظ، ما يصل الى 10-14 يوما، وتغيير نصف 3F المتوسطة، كما هو موضح في 3.1، كل يومين.
- فصل وجمع تمييز الطبقات الوحيدة من الخلايا عن طريق علاج الخلايا مع كاشف تفارق خلية التجاري (انظر الجدول 1) لمدة 5-10 دقيقة عند 37 ° C، 5٪ CO 2.
- أداء التدفق الخلوي باستخدام مكافحة VE كادهيرين، CD43 CD45 والأجسام المضادة لتقييم تكون الدم في الثقافات 12. لاحظ أن جزء كبير من الخلايا، وتصل إلى 40٪ من الخلايا ETV2 وGATA2 transduced، وشارك في يعبر عن VE-نذل وCD43. الأجسام المضادة التالية يمكن أن تستخدم لكشف الأنساب الخلية المحددة التالية هxpansion أو تمايز الناجم عن الأسلاف الدم: CD235a (خلايا محمر)، CD41a (النواءات)، CD32 (جميع أنواع خلايا الدم النخاعي)، CD66b (العدلات) وCD163 (الضامة).
- أداء CFC-فحص باستخدام وسيلة مولد الرمع التجاري (الجدول 1) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- نقل 1-2 × 10 4 خلايا في 3 مل من المتوسط مولد الرمع التجاري (أنظر الجدول 3) لتقييم عدد من الخلايا المكونة للمستعمرة وأنواع المستعمرات المكونة للدم. كثافة البذر مثلى تسمح لتحديد وعزل المستعمرات واحد التي تنمو بشكل منفصل عن بعضها البعض وتتداخل لا. قد تختلف كثافة بذر بين التجارب اعتمادا على كفاءة التمايز، ولكن يجب أن لا تتجاوز 1 × 10 4 خلايا لكل 1 مل من المتوسط مولد الرمع التجاري.
- خلط الخلايا في المتوسط مولد الرمع التجاري من قبل vortexing لطيف، ونقل 3 مل من تعليق لمدة 35 ملم أطباق مرفق منخفضة للغايةلفحص مركبات الكربون الكلورية فلورية، 1.5 مل من التعليق على كل طبق. توزيع بالتساوي المتوسطة واحتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 14 يوما. تجنب إزعاج الأطباق. مراقبة تشكيل مستعمرة في يوم 7 ويوم 10 من الفحص.
- تحديد والاعتماد المستعمرات المكونة للدم وفقا لالأشكال التضاريسية بها في يوم 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يظهر الرسم التخطيطي للسعادة وتحريض الدم من hPSCs التي كتبها overexpression من عوامل النسخ في الشكل 1. ETV2 مع GATA1 أو GATA2 مزيج يدفع تكون الدم عموم النخاعي، في حين أن GATA2، TAL1 +/- مزيج LMO2 يدفع في الغالب تكون الدم erythro-النواءات. كلا مجموعات TF يسببها مباشرة خلايا سعادة التي حولت لاحقا إلى الأسلاف الدم مع مجموعة متميزة من التمايز للدم. تمايز hPSCs من الدولة المحفزة للدم ينتج سعادة يأخذ في المتوسط 4 أيام. خلايا الدم الجولة الأولى ظهرت من يوم 5 من التمايز. وفي وقت لاحق، تظهر العديد من خلايا الدم العائمة والتوسع في الثقافات. لزيادة عدد العائمة خلايا الدم والثقافات في مرحلة ما بعد تنبيغ يمكن أن تطول إلى 10-14 يوما. النسب المطلوب من الخلايا يمكن توسيعها في الخافت ملتصقة مع توليفة مناسبة من السيتوكينات المكونة للدم الشكل 2 ماركاonstrates تحريض الدم من hPSCs باستخدام ETV2 وGATA1 أو GATA2 TFS. بعد تنبيغ مع ETV2 وGATA2، والخلايا تكتسب التشكل البطانية نموذجي يوم 4 من التمايز، وتتحول في النهاية إلى خلايا الدم ذهابا (6-8 اليوم التمايز (الشكل 2A). الخلايا التي تم جمعها في الأيام 3-4 من التمايز عرض نموذجي VE كادهيرين + CD226 + CD73 - سعادة النمط الظاهري (الشكل 2B، 3B) حسب اليوم 7 التمايز أكثر من 50٪ من VE كادهيرين خلايا + اكتساب CD43 المكونة للدم + النمط الظاهري (الشكل 2C) CFC-المقايسات من GATA2 / ETV2. تكشف خلايا يسببها أن مستعمرات تتألف من ارتفاع التكاثري المحتملين (HPP) مركبات الكربون الكلورية فلورية، محمر (E) مركبات الكربون الكلورية فلورية، الضامة (M) مركبات الكربون الكلورية فلورية، والمحببة (G) مركبات الكربون الكلورية فلورية (الشكل 2E). والتمايز hematoendothelial في hPSCs يلي overexpression من GATA2 و TAL1 وحدها أو معيظهر LMO2 في مرحلة الشكل 3. سعادة هو تحديد افضل في الثقافات مع GATA2 وTAL1. إضافة LMO2 يسرع التمايز والعقود التي ملحوظ المرحلة. مزيج GATA2 وTAL1 وحدها أو مع LMO2 يوضح التمايز ونضوج أسلاف الدم إلى معظمها خلايا محمر والنواءات الشكل 3D و3E. ويبين الشكل 4 الأمثل من الكفاءة تنبيغ في H1 hESCs باستخدام GFP الفيروسة البطيئة (A) وموت الخلايا وكفاءة التمايز في ثقافات transduced مع GATA2 / TAL1 / LMO2 في ارتفاع وانخفاض وزارة الداخلية.
ويحدد رسم تخطيطي للبروتوكول تحريض خلايا البطانة والدم مكون للدم عن طريق التعبير القسري للTFS الكرتون الخطوات التجريبية الرئيسية والجداول الزمنية: الرقم 1. وبعد إعداد تعليق خلية واحدة، وtransduced hPSCs مع TFالمصنف الصورة وعلى مصفوفة كاملة في المصل خالية التجاري المتوسطة. وفي اليوم التالي، يتم استبدال المتوسطة مع عامل النمو المتوسطة التجاري الحر تستكمل مع bFGF، TPO وSCF (3F المتوسطة). بعد 3-4 أيام من الثقافة، ويتم تشكيل سعادة. وفي وقت لاحق، سعادة يخضع البطانية إلى الانتقال للدم مع تكوين خلايا الدم متعددة.
الشكل 2: ETV2 / التي يسببها GATA2 تمايز hPSCs (A) صور المرحلة النقيض من ETV2 / التي يسببها GATA2 التمايز في H1 hESCs في أيام 2 و 4 و 6 و 8 بعد تنبيغ. شريط النطاق، 100 ميكرون. (B) تحليل تدفق cytometric من ETV2 / الخلايا التي يسببها GATA2 تمر البطانية إلى الانتقال للدم في يوم 3 من التمايز: VE كادهيرين + HE خلايا التعبير عن CD226 وتفتقر إلى التعبير عن CD73. وهناك نسبة صغيرة من الخلايا البطانية تعبر عن CD73 (غير HE-). (C) تدفق cytometric لnalysis من ETV2 / GATA1- وETV2 / التي يسببها GATA2 H1 hPSCs يوم 7 بعد تنبيغ. (D) تحليل تدفق cytometric من ETV2 / الخلايا المكونة للدم التي يسببها GATA2 الموسعة في المتوسط تستكمل مع FBS وSCF، IL3، IL6، GM-CSF، G-CSF وEPO لمدة 14 يوما. (E) أنواع من المستعمرات المكونة للدم تشكلت من ETV2 / GATA2 الخلايا transduced في CFC-الفحص والمقابلة cytospins رايت الملطخة تمثل محمر (E)، الضامة (M)، المحببة (غرام) والعالية التكاثري المستعمرات المحتملة (HPPs). أشرطة النطاق لCFC-الفحص، 250 ميكرون، لcytospins، 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: GATA2 / TAL1 وGATA2 / TAL1 / التي يسببها LMO2 تمايز hPSCs (A) صور المرحلة النقيض من GATA2 / TAL1 / LMO2التمايز يسببها في hESCs H1 في أيام 2 و 4 و 6 و 8؛ شريط النطاق، 100 ميكرون. (B) تحليل تدفق cytometric من GATA2 / خلايا TAL1 التي يسببها تمر البطانية إلى الانتقال للدم في يوم 3 من التمايز: VE كادهيرين خلايا + اكتساب التعبير معالي علامة CD226. وهناك نسبة صغيرة من الخلايا البطانية تعبر عن CD73 (غير HE-). (C) تلطيخ مناعي من GATA2 / التمايز TAL1 التي يسببها في H1 HESC، يوم 5؛ VE كادهيرين + الخلايا (الأخضر) يكتسب التعبير المكونة للدم CD43 علامة (الأحمر). (D) تحليل تدفق cytometric من GATA2 / TAL1 / LMO2 يسببها- الثقافات المكونة للدم في التعليق على يوم 14 بعد تنبيغ التالية التوسع في المصل خالية المتوسطة تستكمل مع SCF، TPO، EPO وbFGF. (E) أنواع من المستعمرات المكونة للدم تشكلت في CFC-فحص من قبل GATA2 / TAL1 / LMO2 متباينة cellsand cytospins رايت الملطخة تمثل محمر (E)، الضامة (M)، وM المقابلةegakaryocytes (مر). أشرطة النطاق لCFC-الفحص، 250 ميكرون، لcytospins، 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4: تحسين فعالية إجراءات lentiviral تنبيغ (A) تنبيغ من H1 hESCs مع وزارة الداخلية مختلفة من GFP الفيروسة البطيئة. (B) بقاء الخلية وكفاءة التمايز في الثقافات transduced مع GATA2 / TAL1 / LMO2 عند أدنى (1 لكل الفيروسات) وعالية (2 لكل الفيروسات) وزارة الداخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقة المبين أعلاه للدم تمايز hPSCs التي كتبها overexpression من TFS، يمثل نهجا السريع والفعال للجيل معالي والنخاعي وerytho magakaryocytic الأسلاف من hESCs وiPSCs، مما يسمح للإنتاجية تصل إلى 30 ملايين خلايا الدم من مليون الخلايا الجذعية المحفزة 10. هذه الطريقة تعرض التمايز المستمر في عدة HESC وiPSCs خطوط 10. خلال التمايز التي كتبها ETV2 وGATA2، والعوامل GATA1 وكذلك GATA2 وTAL1 العوامل، تشكل خلايا البطانة الدم المنتجة، ومعالي وتخضع لالبطانة إلى الانتقال للدم. ويلاحظ عادة تشكيل سعادة بين أيام 3 و 4 من التمايز. إضافة LMO2، المشارك في عامل النسخي من TAL1، إلى GATA2 والجمع بين TAL1، زيادة كبيرة في قوة التمايز، في حين أصبحت المرحلة سعادة التعاقد بشكل ملحوظ.
نجاح فارق الموجهةنشوئها hPSCs عوامل النسخ يعتمد أساسا على (ط) تسليم فعال من الأحماض النووية في خلايا (ب) بقاء الخلية التالية التلاعب الجيني، و (iii) ترجمة فعالة للمحاضر الخارجية داخل الخلية.
واحدة من الخطوات الرئيسية لطريقة وصفها هو إنتاج وحدات lentiviral فعالة، والتي تعتمد على درجة الحموضة عازلة دقيقة لكلوة 293T ترنسفكأيشن الخلية، وعدم وجود ملوثات الذيفان الداخلي في جميع مراحل الإنتاج والتجارب تنبيغ الفيروسية. سلامة جميع التراكيب، بما في ذلك التعبئة والمغلف البلازميدات، يجب التحقق إذا لا توجد مؤشرات على إنتاج الفيروسي في الخلايا 293T كلوة لوحظ 13.
يجب تصميم بروتوكول التمايز باستخدام مزيج من عوامل النسخ النظر في العديد من المتغيرات. ارتفاع كفاءة تنبيغ الفيروسية مهمة للتمايز ناجحة. منذ الكفاءة تنبيغ تعتمد على الطريقة المستخدمة للفيروسإنتاج وتنقية، وتحسين hPSC تنبيغ باستخدام ناقلات GFP lentiviral غير موصى بها (الشكل 4A). ينبغي التحقق الفيروسي التكامل تنبيغ التالية باستخدام الجيني PCR مع الاشعال التحوير محددة (الجدول 3). وينبغي أن تتضمن التمايز الأمثل أيضا تعديل تركيز lentiviral في خليط التفاعل. A كمية قليلة نسبيا من الفيروس، وزارة الداخلية من 0.5-1، غير قادرة على إحداث hPSC التمايز. في حين أن وزارة الداخلية ارتفاع يزيد من كفاءة التمايز، لأنه يزيد أيضا موت الخلية (الشكل 4B). ويمكن أن تشمل الخطوة الأمثل إضافية MOI نسبة التعديل لكل الفيروس في خليط التفاعل. في GATA2 / ETV2 transduced الثقافات، ومضاعفة وزارة الداخلية لGATA2، نسبة إلى ETV2، ويزيد من فعالية التمايز. لGATA1 / ETV2، GATA2 / TAL1 وGATA2 / TAL1 / LMO2 متساوية وزارة الداخلية لكل الفيروس هو الأمثل.
بعد تنبيغ مع TFS، والغالبية العظمى من الخلايا underwوالأنف والحنجرة التمايز angiohematopoietic بينما احتفظت سوى عدد قليل جدا من الخلايا في التشكل غير متمايزة. منذ pSIN-EF1α ناقلات lentiviral تتضمن مقاومة المضادات الحيوية والعلاج من الثقافات مع بوروميسين يمكن استخدامها للقضاء على خلايا غير متمايزة المتبقية.
تشكيل الخلايا مع الأشكال التضاريسية البطانية مميزة، وخلايا الدم الجولة اللاحقة، تشير إلى وجود تمايز ناجحة. في المتوسط، والجمع GATA2 / ETV2 تنتج 40-50٪ من CD43 + VE كادهيرين خلايا الدم +/- يوم 10/9 التمايز مع ما يصل إلى 30٪ الخلايا المتبقية VE كادهيرين + CD43 -. GATA1 / مزيج ETV2 يدفع CD43 التعبير بشكل أسرع ويولد عدد أكبر من CD43 + الخلايا بالمقارنة مع مزيج GATA2 / ETV2. في هذه الثقافات، والغالبية العظمى من الخلايا CD43 + coexpress VE كادهيرين. في الثقافات transduced مع GATA2 / TAL1، وعدد من CD43 + الخلايا تصل عادة 40-50٪. إضافة إلى LMO2 GATA2 / TAL1 يسرع إلى حد كبير، ويعزز إنتاج الدم، والعقود بشكل ملحوظ في المرحلة البطانية للتنمية.
وينبغي أن تستخدم المقايسات تشكيل مستعمرة لتحديد وتيرة ونوع من الأسلاف المكونة للدم التي يسببها. ويمكن التأكد من طبيعة الخلايا المكونة للمستعمرة من خلال إعداد cytospins رايت الملطخة من المستعمرات الفردية. hPSCs transduced مع ETV2 وGATA2 تنتج في الغالب كبيرة (أكثر من 0.5 مليمتر في القطر) عالية المحتملة (HPP) مستعمرات الدم النخاعي التكاثري تتألف من المحببات غير ناضجة والخلايا الوحيدات، مع بعض خلايا الدم النخاعي ناضجة ومحمر في بعض الأحيان والخلايا النواءات. في المتوسط أكثر من 80٪ من مركبات الكربون الكلورية فلورية في GATA2 / ثقافات ETV2 transduced هي HPPs النخاعي. بالإضافة إلى ذلك، هذه الثقافات تولد محمر والبلاعم مستعمرات (الشكل 2E)، والتي تتكون عادة أقل من 20٪ من إجمالي مركبات الكربون الكلورية فلورية. hPSC تنبيغ مع ETV2 وGATA1 يزيد بشكل ملحوظ عشره نسبة CFC-E لتصل إلى 50٪. TAL1 وGATA2 الثقافات transduced تنتج في الغالب محمر (أكثر من 80٪ من إجمالي مركبات الكربون الكلورية فلورية) والمستعمرات النواءات (أكثر من 10٪ من إجمالي مركبات الكربون الكلورية فلورية) مع عدد قليل جدا من مستعمرات البلاعم (أقل من 5٪ من إجمالي مركبات الكربون الكلورية فلورية). إضافة LMO2 إلى TAL1 والجمع بين GATA2 يزيد بشكل كبير من تواتر الخلايا المكونة للمستعمرة مع erythro النواءات احتمال 10. نمط النشاط CFC التالية تنبيغ مع مجموعات وصفها من عوامل النسخ يتسق بين HESC مختلفة وخطوط hiPSC 10.
باختصار، overexpression بوساطة lentiviral في hPSCs هو أداة سريعة وفعالة نسبيا للتحريض معالي والدم باستخدام TFS. ويمكن أيضا أن هذا النظام أن تستخدم لتقييم قدرة التفريق بين TFS الأخرى وتحديد تلك التي مطلوبة من أجل البطانية ومواصفات المكونة للدم. ومع ذلك، فإن البروتوكول الحالي له فائدة محدودة للدراسات السابقينtracellular اشارة تشارك في تحريض HE، كما أنه يستخدم TFS لتجاوز السطح بوساطة مستقبلات الإشارات. على الرغم من أن البروتوكول الحالي يصف إنتاج الدم باستخدام التعبير التأسيسي من التحوير، ويمكن الحصول على نتائج مماثلة باستخدام من mRNAs تعديل 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
IS هو أحد المساهمين المؤسسين ومستشار لCynata.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells. |
|||
| pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61061 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61063 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61064 | Lentiviral Vector |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Cationic polymer used to increase the efficiency of infection |
| Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | Cell Dissociation Reagent |
| Incomplete (growth factor- free) culture medium mTeSR1 Custom formulation | WiCell Research Institute (Madison, WI) | MCF | Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb |
| human SCF | Peprotech | 300-07 | Premium grade |
| human TPO | Peprotech | 300-18 | Research grade |
| human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Premium grade |
| CD144 (VE-cad) FITC | BD Biosciences | 560411 | Endothelial marker (FACS) |
| CD226 PE | BD Biosciences | 338305 | Hematopoietic (FACS) |
| CD43 PE | BD Biosciences | 560199 | Hematopoietic (FACS) |
| CD73 APC | R&D Systems | FAB5795A | Endothelial marker (FACS) |
| CD45 APC | BD Biosciences | 555485 | Hematopoietic (FACS) |
| 7AAD | Life Technologies | A1310 | Live/Dead assay (FACS) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Cell fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | Permeabilization |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007003 | Fetal bovine serum |
| Mouse anti-human CD43 | BD Biosciences | 551457 | Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining |
| Rabbit anti-human VE-cadherin | BenderMedSystem | BMS158 | Primary (IF) |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated | JacksonResearch | 715-486-152 | Secondary (IF) |
| Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated | JacksonResearch | 715-516-150 | Secondary (IF) |
| DAPI nucleic acid stain | Life Technologies | D1306 | Live/Dead assay (IF) |
| Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched | STEMCELL Technologies | 4435 | CFC-assay |
| Wright Stain solution | Sigma -Aldrich | 32857 | Staining cytospins |
Table 2. hPSCs culture. |
|||
| Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) | WiCell Research Institute (Madison, WI) | hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells | hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers |
| Complete serum-free medium for culture of hPSCs mTeSR1 media | WiCell Research Institute (Madison, WI) | M500 | Serum-free medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs |
| Matrigel | BD Biosciences/ Corning | 356234 | Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs |
| DMEM/F-12, powder | Life Technologies | 12500-062 | Basal Medium |
| HyClone Dulbecco's PBS powder | Fisher Scientific | dSH30013.04 | PBS |
| Dispase II, powder | Life Technologies | 17105-041 | Neutral protease, Cell dissociation |
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration. |
|||
| Primer's Name | Forward (Fwd) 5’ -->3’ | Reverse (Rev) 5’-->3’ | Discription |
| pSIN EF1a Fwd | TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA | -- | EF1a promoter sequence |
| GATA1 Rev | -- | TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC | Coding Region |
| GATA2 Rev | -- | GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG | Coding Region |
| TAL1 Rev | -- | AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT | Coding Region |
| LMO2 Rev | -- | GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC | Coding Region |
| ETV2 Rev | -- | GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC | Coding Region |
References
- Zape, J. P., Zovein, A. C. Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology. Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).
- Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. A short history of hemogenic endothelium. Blood Cells, Mol & Dis. 51, 206-212 (2013).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 1722-1735 (2012).
- Wang, L., et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21, 31-41 (2004).
- Rafii, S., et al. Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition. Blood. 121 (5), 770-780 (2012).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 553-567 (2012).
- Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108, 2095-2105 (2006).
- Wang, C., et al. TGFbeta inhibition enhances the generation of hematopoietic progenitors from human ES cell-derived hemogenic endothelial cells using a stepwise strategy. Cell Res. 22, 194-207 (2012).
- Uenishi, G., et al. Tenascin C promotes hematoendothelial development and T lymphoid commitment from human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Stem Cell Rep. 3, 1073-1084 (2014).
- Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 23, Unit 23.6 (2007).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Mol Imgn and Biol. 12, 15-24 (2010).
