Wir beschreiben ein Immunhistochemie Protokoll, um das Profil Hippocampus-Neuronen Aktivierung nach Exposition gegenüber einer räumlichen Lernaufgabe in einem Maus-Modell gekennzeichnet durch kognitive Defizite der Neuroentwicklungs Ursprung zu studieren. Dieses Protokoll kann sowohl genetische oder pharmakologische Mausmodellen, gekennzeichnet durch kognitive Defizite angewendet werden.
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Methodenartikel
Immunhistochemische Visualisierung von Hippocampus-Aktivität nach Spatial Learning in einem Mausmodell für neurologische Entwicklungsstörungen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Induktion der extrazellulären phosphoryliert-regulierten Kinase (pERK) ist ein zuverlässiges Auslesen der molekularen Lernabhängige neuronale Aktivierung. Hier beschreiben wir ein Perk Immunhistochemie Protokoll, um das Profil Hippocampus-Neuronen Aktivierung nach Exposition gegenüber einer räumlichen Lernaufgabe in einem Maus-Modell gekennzeichnet durch kognitive Defizite der Neuroentwicklungs Ursprung zu studieren. Genauer gesagt, haben wir pERK Immunfärbung auf neuronale Aktivierung zu studieren folgenden Morris-Wasserlabyrinth (MWM, ein klassisches Hippocampus-abhängige Lernaufgabe) in Engrailed-2-Knockout (En2 - / -) Mäusen, einem Modell des Autismus-Spektrum-Störungen (ASD). Im Vergleich zum Wildtyp (WT) steuert, En2 - / - Mäuse zeigten eine signifikante räumliche Lernen Defizite in der MWM. / - - Nach MWM wurden signifikante Unterschiede in der Anzahl von pERK-positiven Neuronen in spezifischen Unterfelder hippocampalen En2 detektiert Mäusen im Vergleich zu WT-Tieren. So kann unser Protokoll robust Schiede erkennenpERK-positiven Neuronen zu Hippocampus-abhängige Lernwertminderung in einem Mausmodell der ASD verbunden. Allgemeiner kann unser Protokoll angewandt werden, um das Profil des Hippocampus Aktivierung sowohl genetische oder pharmakologische Mausmodellen, gekennzeichnet durch kognitive Defizite zu untersuchen.
Einleitung
Neurologische Entwicklungsstörungen umfassen eine große und heterogene Gruppe von Erkrankungen wie das Down-Syndrom, fragile X-Syndrom (FXS), Rett-Syndrom, Neurofibromatose, tuberöser Sklerose und ASD, in dem die Entwicklung und Reifung des zentralen Nervensystems (ZNS) wird früh während gestört der pränatalen Phase 1. Diese Entwicklungsfunktionsstörungen des Gehirns können tiefe, lebenslange Auswirkungen auf die Motorik, Sprache, Lernen und Gedächtnis-Prozess führen. Eine Vielzahl von genetischen und Umweltfaktoren bei der Pathogenese von Störungen der neurologischen Entwicklung während der letzten Jahre 2,3 gebracht. Auch wenn die molekularen ....
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Protokoll
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der EG-Richtlinie 2010/63 / EU durchgeführt und wurden von der italienischen Gesundheitsministerium genehmigt.
1. Tierpflege, Wohnen und Behandlung
- Führen Sie alle Versuchsprotokolle unter Verwendung von Mäusen in Übereinstimmung mit den Richtlinien der jeweiligen institutionellen Tierpflege.
- Pflegen Tiere in einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus mit Futter und Wasser ad libitum zur Verfügung.
- Haus die Mäuse in Gruppen von 2-4, in Standardgröße Polycarbonat Mauskäfige mit Sägemehl und Einstreu werden wöchentlich gewechselt.
- Verwenden Alter un....
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Ergebnisse
Das hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um sichtbar zu machen, mittels Immunhistochemie die Expression eines spezifischen Marker der Hippocampus-Neuronen-Aktivität nach MWM in einem Mausmodell für neurologische Entwicklungsstörungen. Alle hier gezeigten experimentellen Daten wurden von unserer jüngsten Arbeiten 7 übernommen. Männliche und weibliche WT und En2 - / - gleichaltrigen Erwachsenen Wurfgeschwistern (3-5 Monate alt, Gewicht = 25-35 g) aus heterozygoten Verpaarungen erhalten ver.......
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Diskussion
Hier stellen wir ein Protokoll für die Immunhistochemie pERK enthüllt neuronale Aktivierung folgt MWM in En2 - / - Mäuse, ein Mausmodell für neurologische Entwicklungsstörungen. / - - Erniedrigte pERK wurden in der CA3 Teilgebiet der En2 erkannt Mutanten im Vergleich zu WT. Anders, als in CA3 Unterfeld, eine allgemeine Erhöhung der pERK-positiven Neuronen beobachtet stattdessen sowohl hilus erkannt und GCL von En2 - / - Mäusen im Vergleich zu WT. Eine mögliche Erklärung für diese gegenlä.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren
Danksagungen
Wir möchten für die Unterstützung danken, die Verwaltungspersonal CIBIO (Universität Trient) und CNR Neuroscience Institute. Giovanni Provenzano wird von einem Post-Doc-Stipendium Fondazione Veronesi (Mailand, Italien) unterstützt. Diese Arbeit wurde durch das italienische Ministerium für Universität und Forschung (PRIN 2008 Grant # 200894SYW2_002 und PRIN 2010-2011 Stipendium # 2010N8PBAA_002 zu YB), Universität Trento (CIBIO Gründungszuschuss zu YB) und Telethon Foundation (Grant # GGP13034 finanziert YB).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| EthoVision XT 8 | Noldus Informationstechnologie | Diese Softwareplattform ist keine Voraussetzung – es gibt viele andere Verhaltenssoftware auf dem Markt. | |
| Temperafarbe | Giotto - Fila Group Unternehmen Weiß | und flüssig, ungiftig. Wird verwendet, um undurchsichtiges Wasser im Wasserlabyrinth von Morris zuzubereiten. | |
| Vibratome | Leica | VT1200 | Es können gleichwertige Modelle anderer Hersteller verwendet werden. |
| 24-Well-Platte | Sigma | CLS3524 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Wird verwendet, um einen Ethanolgradienten für die Dehydrierung vor der Montage des Objektträgers herzustellen. |
| Xylol | VWR | 66004-950 | Giftig - zur Verwendung unter der Motorhaube. Wechseln Sie das Xylol jeden Monat je nach Verbrauch. |
| Natriumazid | Sigma | S2002 | |
| PBS | Sigma | P3813-10PAK | |
| ddH2O | |||
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Wasserstoffperoxid | Sigma | H1009-100ML | |
| Normales Ziegenserum | Abcam | G9023-10ML | |
| ABC Kit Vectastain | Vector Laboratories | PK-6100 | Geben Sie in einem Volumen von 5 ml PBS 2 Tropfen Reagenz A hinzu, mischen Sie und fügen Sie dann 2 Tropfen Reagenz B hinzu und mischen Sie. |
| DAB-Peroxidase-Substrat | Vector Laboratories | SK-4100 | Geben Sie ein Volumen von 5 ml ddH2O hinzu: 2 Tropfen Pufferlösung und mischen; 4 Tropfen DAB und mischen; 2 Tropfen H2O2 und mischen. |
| [header] | |||
| pERK Antikörper | Zellsignaltechnologien | 4370 | Verdünnung 1:500 |
| Biotinylierte Ziege Anti-Kaninchen IgG Antikörper | Vektor Laboratorien | BA-1000 | Verdünnung 1:250 |
| SuperFrost Folien | Carl Roth | 1879 | |
| Deckgläser | Fisher | 12-548-B | |
| DPX | Sigma | 317616 | Eindeckmedium für Dias. Es kann ein gleichwertiges Eindeckmedium verwendet werden. |
| Mikroskop | Zeiss | kann ein gleichwertiges Mikroskop mit Axio | Imager.M2 |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | Zum Zusammenfügen von Bildern. | |
| ImageJ Software | National Institute of Health | Kostenlose Software kann heruntergeladen werden unter http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat Software Inc. (USA) | Gleichwertige Software für statistische Analysen kann verwendet werden. | |
| Prism 6 | GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA) | Gleichwertige Software für statistische Analysen kann verwendet werden. |
Referenzen
- Castren, E., Elgersma, Y., Maffei, L., Hagerman, R. Treatment of neurodevelopmental disorders in adulthood. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14074-14079 (2012).
- Ehninger, D., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
