Abstract
Saggi digitali sono potenti metodi che permettono il rilevamento di cellule rare e il conteggio delle singole molecole di acido nucleico. Tuttavia, i saggi digitali sono ancora abitualmente applicata, a causa del costo e attrezzature specifiche associati ai metodi disponibili in commercio. Qui vi presentiamo un metodo semplificato per la lettura di saggi gocciolina digitali utilizzando uno strumento di PCR in tempo reale convenzionale per misurare la fluorescenza massa di saggi digitali basate goccioline-.
Abbiamo caratterizzare le prestazioni del test lettura bulk utilizzando miscele gocciolina sintetici e digitale dosaggio gocciolina multiple displacement amplification (MDA). Quantitative MDA particolare beneficia di un formato di reazione digitale, ma il nostro nuovo metodo si applica a qualsiasi dosaggio digitale. Per i protocolli di analisi digitali affermati come la PCR digitale, questo metodo serve ad accelerare e semplificare test di lettura.
La nostra metodologia di massa lettura porta i vantaggi di partitionesaggi d senza la necessità di strumentazione lettura specializzata. I principali limiti del metodo di lettura bulk sono ridotte gamma dinamica rispetto piattaforme gocciolina di conteggio e la necessità di un campione standard, anche se i requisiti di questo standard sono meno rigorosi per un esperimento in tempo reale convenzionale. Quantitative intero amplificazione del genoma (WGA) viene utilizzato per verificare contaminanti nei reazioni WGA ed è il modo più sensibile per rilevare la presenza di frammenti di DNA con sequenze sconosciute, dando il metodo grande promessa in diverse aree applicative, tra cui il controllo farmaceutico di qualità e astrobiologia.
Introduction
Saggi digitali per la quantificazione degli acidi nucleici (PCR digitale) 1-4 e la base ordine (sequencing) sono fortemente incidono le scienze della vita e la medicina. Saggi digitali forniscono quantificazione dei conteggi molecolari su scala assoluta (non relativo a un controllo), fornendo l'alta sensibilità, consentendo facili confronti di tutti gli esperimenti, e, soprattutto, permette la costruzione di grandi banche dati contenenti dati comparabili 5 (Tabella 1).
Negli ultimi 15 anni, tutto l'amplificazione del genoma (WGA) è emersa accanto PCR come uno strumento generale per l'amplificazione degli acidi nucleici. Come PCR, WGA è utile per le applicazioni analitiche e preparative amplificando elementi minuto di campionamento fino a un livello che può essere facilmente individuata o utilizzati per le successive analisi, come il sequenziamento di base. A differenza di PCR, WGA non è specifico per un particolare locus DNA, piuttosto che permette l'amplificazione di tutte le sequenze del campione, tra le sequenze sconosciute.Questa differenza fondamentale tra PCR e WGA rende i metodi complementari tra loro e dà luogo a diversi problemi nella loro applicazione.
L'alto rendimento di reazioni WGA 6 consente l'amplificazione di routine di DNA genomico da molecole singole 7, celle singole 8 e altri campioni a bassa biomassa 9 per la quantificazione e ulteriori analisi. Le sfide principali associate alla WGA chimica sono la sua estrema sensibilità ai contaminanti e l'amplificazione irregolare attraverso singole molecole modello 6. Tuttavia, WGA sta guadagnando popolarità come il sequenziamento di singole cellule è emerso come il "killer application" della tecnologia WGA 10, e il modello di quantificazione da WGA è importante in molti campi di applicazione 7.
Strumentazione per il digitale quantificazione di acidi nucleici è stata precedentemente descritta in una varietà di con valvola e senza valvole forma microfluidicats 11-14, tra saggi basati gocciolina-15,16 (Tabella 2). Tuttavia, i sistemi microfluidici commerciali per l'analisi digitale richiedono attrezzature specializzate per la configurazione di reazione e la rilevazione dei prodotti 17. Microfluidica personalizzati valvolati sono flessibili, ma richiedono precisione microfabbricazione e sistemi di controllo pneumatici 18. Mentre è relativamente semplice da fare monodisperse micro-goccioline di emulsione a base-saggi digitali 19,20, lettura digitale è tecnicamente gravoso, che richiede sia su larga scala di immagini a grande campo (simile alle famose tecnologie di sequenziamento di prossima generazione) o 21,22 ad alta velocità del flusso basato sul rilevamento delle gocce 23-25. Idealmente, un saggio digitale sarebbe semplice dal set-up di lettura, riducendo la necessità di strumentazione complessa e consentendo un gran numero di campioni da leggere rapidamente. Qui si descrive un metodo semplificato per la lettura dei saggi goccioline digitali che utilizza un convenzionale PCR in tempo reale iNstrument per misurare la fluorescenza massa di saggi digitali basate goccioline-.
Mentre il nuovo approccio può essere applicato a PCR digitali, è particolarmente vantaggioso per le analisi WGA digitali che analogici dosaggi di amplificazione in tempo reale (che danno risultati eccellenti per PCR) sono problematici. WGA è comunemente applicato a campioni con molecole modello eterogenee in sequenza, lunghezza, e il contenuto di base. Queste diverse molecole modello vengono amplificati a tassi differenti 6, rendendo necessario l'uso di un riferimento ("standard") campione con caratteristiche corrispondenti. Spesso, tale standard è disponibile, o le caratteristiche dei campioni in ingresso sono sconosciute. L'eterogeneità del materiale in ingresso e la proprietà lunghezza-dipendente delle farmacie WGA 26 inoltre complicare l'interpretazione dei risultati creando ambiguità quanto viene quantificato - la massa di ingresso, il numero di molecole di ingresso, una combinazione dei due, o nessuno. Finalmente, la sequenza non specificità rende quantitativo spostamento amplificazione multipla (MDA) più sensibili alla contaminazione di PCR quantitativa in quanto le molecole contaminanti di qualsiasi sequenza hanno un potenziale di interferire. Saggi digitali microfluidica affrontare la contaminazione separando le molecole di modello e di ridurre i volumi di reazione in modo tale che un minor numero di agenti inquinanti vengono campionati.
Qui usiamo un popolare metodo di WGA isotermico, MDA 27. Da segnalare, diversi altri chimiche WGA tra cui PicoPlex e MALBAC 28 dipendono in modo cruciale passi iniziali di spostamento isotermico filo. Passi isotermici aggravano la sfida di applicare analisi real-time quantitativa analogici per WGA. WGA può essere né impossibilitato durante l'installazione, con conseguente indesiderato variabile pre-amplificazione, né discretizzato ("ciclato") in un modo in cui la replica di molecole eterogenee può essere guidato a completamento e fermato prima del ciclo successivo come PCR 11 (Figura 1). Un formato digitale per test WGA accoglie tipiche procedure di impostazione reazione dovuta alla segregazione di ogni molecola per il conteggio a livello di endpoint del test (in modo pre-amplificazione non influenza il risultato) di lettura originale significa accuratezza sarebbe in gran parte indipendente di variazione in termini di efficienza di amplificazione.
Il dosaggio dipende goccioline nell'olio con volumi uniformi, come il livello del segnale per droplet alla endpoint dosaggio dipenderà dal volume delle gocce, e non vogliamo la coerenza dei risultati dipendono da una media attraverso una distribuzione di dimensioni delle gocce. Fare goccioline monodisperse ora è una procedura standard (circa 3.500 documenti gocciolina monodisperse sono stati pubblicati dal 2013), ma richiede strumentazione microfluidica 25. In realtà, più di sei aziende hanno sviluppato prodotti commerciali indipendenti che si basano sulla produzione di tali goccioline, e chip microfluidici-gocciolina fare sonocommercialmente disponibile 23,29. Per questo studio, abbiamo utilizzato dispositivi microfluidici personalizzato autoprodotti (vedi Protocol). Siringa Pompe per guidare il flusso attraverso i dispositivi sono anche disponibili in commercio, ma in alternativa, può essere sostituito con una singola siringa monouso per flusso guidato-vuoto per ridurre i costi 30.
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Protocol
Nota: Realizzazione del dispositivo microfluidico non è necessario per questo test, come goccioline di questo protocollo possono essere formati con i responsabili gocciolina commerciali esistenti 23,29.
1. Effettuare il Droplet formano dispositivo a microfluidi
- Preparare stampo master per i canali con il protocollo SU-8 master Fabrication delineato in precedenza 31, ma con un modello di maschera generatore gocciolina 32.
- Realizzare dispositivi in PDMS utilizzando le tecniche della litografia soffice 32,33.
2. Preparare miscela di reazione per Bulk Droplet lettura
Nota: Il protocollo può essere utilizzato per quantificare gli acidi nucleici utilizzando molti tipi di reazioni di amplificazione. Come esempio, i reagenti necessari per MDA di diverse concentrazioni di DNA Lambda sono dati. Dettagli dei reagenti sono elencati nella tabella dei reagenti specifici. La distribuzione del modello nelle goccioline dipende sufficient miscelazione del campione.
- Ottenere o polimerasi Purificare Phi29 DNA.
- Purificare Phi29 come descritto in precedenza 7, o acquistare da fornitori. Il Phi29 utilizzato per esperimenti mostrati stato purificato.
- Preparare 10 ml di denaturazione tampone, comprensivi di 65 KOH mM, 1.65 mM EDTA, e DTT 14 mm.
- Preparare 10 ml di tampone di neutralizzazione, comprensivi di HCl 65 mM, 0,21 M Tris-Cl pH 7,0, e 9 Tris-Cl mM pH 8.0.
- Preparare due standard, uno nessun controllo template (NTC), come l'acqua priva di nucleasi, e una alta concentrazione di modello (circa 4 pg / ml DNA Lambda). Denaturare 3.3 ml di ogni campione con 3,3 ml di denaturazione tampone in una provetta qPCR. Incubare a temperatura ambiente per 3 min. Placare ciascuno con 3,3 ml di neutralizzazione Buffer.
- Denaturare 3.3 ml di modello di interessi con 3,3 ml di denaturazione tampone in una provetta qPCR. Incubare a temperatura ambiente per 3 min. Placare con 3.3 mldi neutralizzazione Buffer.
- Preparare 11 ml di miscela maestro per campione sul ghiaccio. La miscela di maestro di reazione 2x MDA è composto da 2x DNA a doppia elica (dsDNA) tintura legame, tintura di riferimento 2x qPCR, 50 micron oligo randomizzato, 2 mg / ml BSA, 2x Phi29 DNA polimerasi tampone di reazione, 4.8 dNTP mM, acqua priva di nucleasi , e 40 mg polimerasi / ml Phi29 DNA. Aggiungere DNA polimerasi Phi29 ultimo a garantire la polimerasi non incontrare livelli di pH molto superiore o inferiore 7.5.Mix bene.
- Opzionale: Per un minor numero di falsi positivi, esporre master mix con la luce UV prima di formare goccioline 34.
- Preparare 10 ml di pre-miscela per campione in 0,5 ml o 1,5 ml tubo trasparente su ghiaccio. La pre-mix è composto da 55 micron oligo randomizzato, 2,2 mg / ml BSA, 1.1x Phi29 DNA polimerasi tampone di reazione, 5,3 mM dNTP, e l'acqua priva di nucleasi.
- Porre il tubo in acqua su ghiaccio, come descritto 34 ed esporre alla luce UV (254 nm) a un accuDose cumulati di 5,7 J / cm 2.
- Aggiungere colorante dsDNA vincolante a 1x, riferimento tintura a 1x, e Phi29 a 40 mg / ml nel pre-miscela. Mescolare bene.
- Combina 10 ml di template denaturato o standard e di 10 ml di miscela master. Mescolare bene.
3. Droplet Formazione
Nota: Goccioline possono essere molto sensibili all'elettricità statica e sforzo di taglio. Rimuovere i vestiti che possono causare elettricità statica, e statica del corpo prima di formare goccioline. Maniglia tubi di emulsione dalla sommità del tubo, per quanto dall'emulsione possibile. Emulsioni pipette molto lentamente, preferibilmente con una punta larga foro pipetta. Per la dispensazione da un puntale, vedere l'emulsione sul lato della punta per determinare la velocità di pipettaggio.
- Goccioline modulo. Per gli esperimenti mostrati, il dispositivo microfluidico presenta un ingresso e due insenature olio acquose con una giunzione a flusso focalizzazione per generare goccioline. Utilizzare due SyriPompe ESN per controllare le portate di 55 ml di olio con un tensioattivo e 20 pl di miscela di reazione attraverso il chip microfluidico per generare 20.000 1 goccioline nl.
- Nota: E 'possibile produrre goccioline con molti tipi di olio con tensioattivo, ma la composizione influisce notevolmente stabilità gocciolina a temperature elevate e nel tempo. Una combinazione possibile è olio fluorurato HFE 7500 con un tensioattivo anionico 19,35.
- Produrre goccioline in qualsiasi formato con qualsiasi metodo 13,36, ma la variabilità dimensioni della popolazione gocciolina influenzerà la fluorescenza massa, e quindi la precisione del dosaggio. Per esperimenti mostrati, goccioline erano monodisperse con un volume di 1 nl.
- Raccogli tutte le goccioline e olio in provette PCR. Per ciascun campione, un'aliquota di 30 ml di olio in provette per PCR freschi con tappi ottici e trasferire 20 ml di goccioline sopra dell'olio. I volumi consistenti assicurano il saggio è come accurare il più possibile.
- Chiudi tubo tappi ermeticamente, come tappi sciolti permetterà l'olio di evaporare.
4. isotermica Amplificazione
- Utilizzando un termociclatore PCR, qPCR termociclatore, o piastra, incubare i campioni a 30 ° C per 7 ore, e inattivare per 1 min a 75 ° C. I tubi di goccioline possono essere lasciati in frigorifero coperto con un foglio per alcune ore a questo punto.
5. Acquisizione dati e analisi
- Subito dopo l'inattivazione reazione, misurare i livelli di fluorescenza di coloranti per tutti i campioni che utilizzano il termociclatore qPCR. Impostazioni del filtro ottimale dipenderà tintura di eccitazione e spettri di emissione. Per questo esempio, utilizzare il 492 nm-516 nm filtro impostato per la tintura dsDNA vincolante, e il filtro nm 585 nm-610 impostato per la tintura di riferimento. Altre tecniche di misura fluorescenti possono essere utilizzati per quantificare la fluorescenza.
- Per ciascun campione, dividere l'intensità di fluorescenza del colorante dsDNA vincolante byl'intensità di fluorescenza del colorante di riferimento. Sottrarre la fluorescenza di fondo, o la fluorescenza normalizzata del controllo NTC, da tutti i campioni.
- Creare una curva standard lineare utilizzando le misure di fluorescenza corrette dalle norme. Lo standard NTC rappresenta la fluorescenza per un campione con goccioline fluorescenti 0% ("tutto negativo"), e la misurazione di fluorescenza di alta concentrazione modello è la fluorescenza atteso per un campione con goccioline fluorescenti 100% ("tutti positivi"). Utilizzando la curva standard corrispondente, prevedere i rapporti intermedi di goccioline positivi e negativi in base alla loro fluorescenza bulk.
6. Produrre Droplets per Principio Proof-of-Misure
- Fai fluorescenti (positive) le goccioline: Preparare una miscela di reazione PCR costituita da 0,1 ng DNA Lambda, colorante 1x dsDNA vincolante, colorante riferimento 1x, 1,5 unità Taq DNA polimerasi, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0.2 mM dNTP, e 0,5 mM primers. Thermocycle La miscela 30 volte (95 ° C per 20 sec, 55 ° C per 20 sec, 72 ° C per 1 minuto), quindi formare goccioline come descritto sopra.
- Rendere non fluorescenti gocce (negativo): Preparare una miscela di reazione di PCR che consiste di colorante 1x dsDNA vincolante, tintura di riferimento 1x, 1,5 unità Taq DNA polimerasi, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0.2 mM dNTP, e 0,5 micron primer. Thermocycle La miscela 30 volte (95 ° C per 20 sec, 55 ° C per 20 sec, 72 ° C per 1 minuto), quindi formano goccioline.
- Formare rapporti goccioline premiscelati
- Distribuire 20 ml di olio fluorurato in tubi qPCR, coprire con un cappuccio ottica per evitare l'evaporazione.
- Pipettare delicatamente 10 ml di goccioline ben mescolato in positivi desiderati: rapporti negativi sopra dell'olio. Nei risultati mostrati, positivi: rapporti gocciolina negativi erano 1 (tutti positivi), 0.8, 0.5, 0.2, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, e 0 (tutto negative).
- Misurare i livelli di colorante di fluorescenza per tutti i campioni utilizzando il termociclatore qPCR. Per questo protocollo, utilizzare il 492 nm-516 nm filtro impostato per la tintura dsDNA vincolante, e il filtro nm 585 nm-610 impostato per la tintura di riferimento.
- Normalizzare dsDNA vincolante fluorescenza colorante con riferimento colorante fluorescente. Ulteriori normalizzare la fluorescenza del "tutto positivo" campione.
- Creare una curva standard lineare utilizzando le misure di fluorescenza normalizzati dai "tutti positivi" e "negativi" tutti i campioni. Utilizzando la curva standard corrispondente, prevedere i rapporti intermedi di goccioline positivi e negativi in base alla loro fluorescenza bulk.
- Ripetere l'esperimento per ciascun rapporto (n = 3) con la formazione di goccioline indipendente e miscelazione per ogni replica.
7. La prova di principio MDA Experiment
- Misurare la concentrazione di soluzione di DNA Lambda con una specificatrophotometer.
- Calcolare la concentrazione modello necessario per medie molecole 10 template per goccia. Per questo protocollo, assumono volumi di goccioline sono 1 nl e 1 ng di DNA Lambda contiene circa 1,9 x 10 7 copie. Pertanto, 10 modelli per ogni gocciolina saranno 10 copie per nl, o 526 fg DNA Lambda per microlitri. Il modello sarà diluito ~ 6x quando si formano goccioline, quindi la concentrazione iniziale più alto modello sarà 3,2 pg / ml.
- In serie diluire il DNA Lambda di 3,2 pg / ml con tampone di denaturazione e volume uguale neutralizzazione Buffer. Per un fattore di diluizione di 0,1, unire campione di 10 microlitri con 45 ml di tampone di denaturazione e incubare a temperatura ambiente per 3 min. Aggiungere 45 lL di neutralizzazione tampone per placare.
- Ulteriori diluire il campione come descritto al punto 7.2 per rendere il resto dei campioni per l'esperimento. Le concentrazioni modello iniziale nelle reazioni indicate erano 3,2 pg, 320 fg,160 fg, 32 fg, 16 fg, 3.2 fg, e 1,6 fg per microlitro.
Nota: Le concentrazioni modello finali dopo mastermix Inoltre erano 526 fg, 52.6 fg, 26.3 fg, 5.26 fg, 2.63 fg, 526 ag, e 263 ag per microlitro. 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 e attesi copie Lambda per gocciolina, rispettivamente. - Generare e analizzare le goccioline di ogni campione come descritto nei passaggi 2.5-5.3.
- Acquisire le immagini mostrate fluorescenza (Figura 2,3) utilizzando una fotocamera digitale montata a un microscopio a fluorescenza con un obiettivo 10x a temperatura ambiente. Acquisire dodici campi di vista per ogni campione. Immagini di fluorescenza Correggere un'immagine di sfondo ottenuta con uno scivolo a fluorescenza.
- Utilizzare una camera di contenuto per l'imaging 37 come l'olio di emulsione evapora rapidamente.
- Analizzare singole intensità gocciolina utilizzando una macro ImageJ (file di codice supplementare).
- Scegliere un'intensità di fluorescenza soglia che meglio separa le goccioline non fluorescenti in NImmagini TC delle gocce fluorescenti nelle immagini ad elevata concentrazione di template. Per ciascun campione sconosciuto, calcolare la frazione di goccioline con una intensità di fluorescenza di sopra della soglia.
8. Le reazioni alla rinfusa PCR e MDA
- Preparare reazione PCR.
- Serialmente diluire DNA templato con un fattore di diluizione di 0,1. Per ogni diluizione, unire 10 ml di modello con 45 ml di tampone di denaturazione e incubare a temperatura ambiente per 3 min. Unire la diluizione con 45 ml di neutralizzazione Buffer.
- Preparare 20 ml di PCR mastermix per campione. La miscela di reazione maestro 1.1x PCR è costituito da 60 unità / microlitri DNA polimerasi Taq, 11 mm Tris-HCl, 55mm KCl, 1.65 mM MgCl 2, 0,22 mM dNTP, tintura, 1.1x tintura di riferimento, e 550 nm 1.1x dsDNA vincolante ogni primer.
- Unire 2 ml di modelli diluiti e 20 ml di Mastermix.
Nota: Le concentrazioni del modello finale in tegli Pcr reazioni mostrate erano 50 pg, 5 pg, 500 fg, 50 fg, 5 fg, 500 ag, e 0 g di DNA lambda per microlitro, e sono stati eseguiti in triplicato. - Reazione Thermocycle PCR in macchina qPCR con il seguente programma. Eseguire 40 cicli di 95 ° C per 30 sec, 57 ° C per 20 sec, 72 ° C per 30 sec prima 2 min a 72 ° C per 2 min e mantenimento a 4 ° C.
- Normalizzare dsDNA legame colorante fluorescente con colorante fluorescente di riferimento prima di ulteriori analisi.
- Preparare reazione MDA.
- Diluire i campioni come descritto al punto 8.1.1.
- Preparare 11 ml di miscela maestro per campione sul ghiaccio. La miscela di maestro di reazione 2x MDA si compone di tintura 2x dsDNA vincolante, tintura di riferimento 2x, 50 micron oligo randomizzato, 2 mg / ml BSA, 2x phi29 DNA polimerasi tampone di reazione, 4.8 dNTP mM, acqua priva di nucleasi, e 40 mg / ml Phi29 polimerasi del DNA.
- Aggiungere la DNA polimerasi Phi29 a 40 mcg / ml durare per garantire la polimerasi dOES non incontrare livelli di pH molto superiore o inferiore a 7,5. Mescolare bene.
- Denaturare 3.3 ml di modello diluito con 3,3 ml di denaturazione tampone in una provetta qPCR. Incubare a temperatura ambiente per 3 min. Aggiungere 3.3 ml di neutralizzazione Buffer.
- Combinare 10 ml di modello denaturato e 10 ml di miscela master. Mescolare bene.
- Eseguire reazione MDA in macchina qPCR con il seguente programma.
- Tenere a 30 ° C per 4 ore, misurare la fluorescenza ogni 7,5 min.
- Inattivare a 75 ° C per 1 min.
- Normalizzare dsDNA vincolante fluorescenza colorante con riferimento colorante fluorescente. Ulteriori normalizzare per la fluorescenza massima per ogni campione.
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Representative Results
Mentre letture di massa convenzionale / in tempo reale possono essere utilizzati sia per la PCR quantitativa e saggi WGA quantitativi (figura 1), analisi quantitative digitali forniscono vantaggi (Tabella 1). Nel metodo descritto, andremo a leggere saggi digitali in formato micro-goccia con una semplice misura endpoint bulk (Figura 2). Anche se questo metodo è ampiamente applicabile, ci si concentra sulla quantitativa WGA (MDA) perché questo metodo presenta sfide particolari per i tradizionali test in tempo reale.
Per verificare se il nostro strumento PCR in tempo reale in grado di rilevare diverse frazioni di microgocce fluorescenti dispersi in olio, abbiamo misurato la fluorescenza massa di miscele sintetiche di fluorescente e goccioline non fluorescenti (Figura 2). La fluorescenza bulk e conta gocciolina positivi (valutate in modo indipendente mediante microscopia a fluorescenza) scala linearmente con la frazione di ingresso di gocce fluorescenti come previsto (Figura 3A). L'esperimento è stato eseguito per tre volte, con la formazione di goccioline indipendente e miscelazione per ogni insieme.
Per valutare le prestazioni teoriche quantificazione di campioni "sconosciuti", abbiamo stabilito curve standard lineari utilizzando campioni di controllo completamente positivi e negativi del tutto. Con tali curve standard droplet-specifico lotto, è stata calcolata la frazione di miscele sintetiche gocciolina positivi e negativi sulla base bulk fluorescenza di ciascun campione. I risultati mostrano una buona performance in gocciolina rapporto quantificazione attraverso due tronchi di gamma dinamica (R 2 = 0,984; Figura 3B). La concentrazione dell'analita ingresso viene facilmente calcolato dalla frazione di goccioline positivi o negativi 38.
Per testare il nostro metodo in una vera e dosaggio quantitativo WGA, abbiamo misurato i livelli di fluorescenza e frazione di goccioline positivi di una goccia digitale MDA test con il DNA Lambda attraverso una connessione wi de gamma di concentrazioni (Figura 4). Nella Figura 4B, sono mostrate immagini rappresentative fluorescenti delle goccioline. Sia fluorescenza massa e frazione gocciolina positivi dai campioni MDA digitali scalabili come previsto con il modello medio per gocciolina, indicando che la lettura di massa può catturare fedelmente il risultato di un test digitale (R 2 = 0,927). Abbiamo ripetuto l'esperimento per ogni concentrazione, formando goccioline indipendente e svolgimento WGA per ogni replica.
Tabella 1. Sintesi della real-time e saggi digitali. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Tabella 2. Sintesi dei metodi esistenti per la quantificazione degli acidi nucleici. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 1. Real-time PCR quantitativa e MDA di Lambda DNA. MDA non è discretizzate attraverso cicli di temperatura come PCR, ed è incline a preamplificazione se non preparato con cura sul ghiaccio. Qui, PCR quantitativa e MDA sono stati eseguiti con concentrazioni crescenti di DNA Lambda. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figure 2. Schema di lettura analogica di goccioline e immagini rappresentative. (A) goccioline positivi e negativi sono stati generati da reagenti fluorescenti e non fluorescenti in un dispositivo di microfluidica. Le goccioline sono stati pre-miscelati in diverse positivi: rapporti negativi. Livelli di fluorescenza Bulk sono state misurate con un tempo reale termociclatore standard e frazione di goccioline positivi è stata determinata mediante microscopia a fluorescenza. (B) fluorescente Rappresentante immagini di crescenti rapporti di goccioline positivi (scala bar = 200 micron) sovrapposte. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Bulk fluorescenza e frazione fluorescente di combinazioni di preparati separatamente drople positivo e negativots. (A) fluorescente (positivo) e non fluorescente (negativi) goccioline sono stati pre-miscelati in rapporti diversi. Confronto della frazione di ingresso di goccioline positive con la fluorescenza misurata massa e frazione gocciolina positivo misurato (n = 3, barre rappresentano +/- SD). La linea tratteggiata rappresenta la frazione fluorescente previsto in una relazione lineare. (B) Confronto di rapporti previsti sulla base di standard per la frazione di ingresso fluorescente previsto. La linea indica il valore atteso dato una relazione lineare. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Bulk fluorescenza e frazione fluorescente di una goccia test MDA digitale. Digital MDA è stata eseguita con increconcentrazioni Asing di modello Lambda DNA (n = 3, barre di errore rappresentano SD) e misurata come descritto nella Figura 2A. La linea indica la frazione fluorescente previsto utilizzando la distribuzione di Poisson per modellare i dati dal nostro esperimento. b) fluorescente Rappresentante sovrapposto immagini di goccioline dopo inattivazione di reazione (scala bar = 200 micron) per aumentare attesi molecole di DNA Lambda per gocciolina (NTC, 0.005, 0.05, 0.5, e 10). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .
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Discussion
Saggi digitali sono potenti metodi che consentono il rilevamento di cellule rare e conteggio dei singoli di molecole di acido nucleico. Tuttavia, i saggi digitali non sono ancora applicati routinariamente nei laboratori di analisi, in parte a causa del costo di attrezzature specializzate associati ai metodi disponibili in commercio. Qui si descrive un saggio digitale endpoint per quantificare gli acidi nucleici con una lettura analogico semplificata utilizzando un real-time quantitativa macchina PCR standard. Questo metodo è rapido set-up, e la lettura è molto più semplice rispetto ai metodi di conteggio delle gocce.
La nostra analisi perde la singola molecola (singolo-droplet) sensibilità delle singole misurazioni goccioline per la semplicità di massa endpoint misurazione utilizzando strumentazione standard. Nel nostro esperimento MDA digitale, non siamo riusciti a distinguere meno di 1 gocciolina positivo per 200 goccioline negativi da sfondo, nonostante la conferma mediante microscopia a fluorescenza che il reale fraction di goccioline positivi è stato come previsto (Figura 4). La sensibilità e sfondo nel limite di misura di fluorescenza quantitativa, la sensibilità del test misura massa per frazioni a basso gocciolina positivi. Se è richiesta maggiore sensibilità, si raccomanda una lettura digitale. Le differenze nei livelli di olio o volumi di goccioline di massa possono influenzare notevolmente i dati di esempio di fluorescenza. Anche la normalizzazione con un colorante di riferimento non può compensare le differenze di volumi di olio fanno della fluorescenza legge. È possibile che l'ottimizzazione del volume dosaggio, parametri di acquisizione strumento, geometria micropozzetti, o filtri ottici può migliorare le prestazioni del dosaggio.
La sensibilità e la gamma dinamica di test digitali rinfusa può anche essere migliorata ottimizzando la dimensione della partizione. Gocce più grandi producono una maggiore quantità di prodotti fluorescenti da ogni molecola di modello, che può aiutare a superare sfondo strumentale e migliorare la sensibilità per le concentrazioni di ingresso basse. SuD'altra parte, gocce più piccole consentono l'isolamento di più molecole per volume dosato. Se la concentrazione template è altamente variabile di tutti i campioni, entrambe le reazioni piccoli e grandi goccioline possono essere eseguite in parallelo per ampliare la gamma dinamica del test 39.
Volumi gocciolina coerenti sono necessarie per la misurazione precisa anche. Esistono molte soluzioni microfluidici personalizzato per rapidamente formando goccioline monodisperse da un campione, sia in serie ed in parallelo 19,40 41,42. Mentre alcuni consentono la generazione droplet da diversi campioni separati in parallelo, semplici modifiche ai disegni esistenti consentirebbero generazione gocciolina simultaneamente qualsiasi numero di campioni. Ad esempio, il sistema ddPCR Bio-Rad 23 applica una pressione uniforme agli ingressi di una serie di accessori per gocciolina indipendenti, consentendo la formazione di goccioline simultanea campioni multipli.
La nostra metodologia di massa lettura accede chiavevantaggi del test digitali partizionati senza la necessità di specializzazione lettura strumentazione e ben si presta per quantitativa WGA. Qui, ci siamo concentrati sulla quantitativa WGA, che è altamente suscettibile di contaminanti di fondo a causa della sua mancanza di specificità di sequenza 7. Inoltre, la distribuzione del peso molecolare sconosciuto e potenzialmente ampia di prodotti provenienti in tempo reale saggi quantitativi WGA rendere difficile interpretazione in applicazioni in cui il numero di modelli originali è di interesse. Indirizzi di formattazione test digitali entrambi i problemi. I contaminanti sono contenute all'interno partizioni reazione individuale, impedendo il predominio di analiti a basso peso molecolare a contaminanti alto peso molecolare come avverrebbe in un test in tempo reale convenzionale. Nelle figure 2B e 4B, possibili contaminanti, visti come punti luminosi all'interno delle gocce, sono segregati e non amplificare o contribuire in modo sostanziale a fluorescenza generale. Inoltre, lasegnale generato in saggi digitali è proporzionale al numero di modelli, non la dimensione dei modelli o loro tasso di amplificazione. Anche se il nostro metodo si basa su standard per calibrare la misura digitale rinfusa, la necessità di abbinare campione e caratteristiche standard può essere attenuata significativamente.
Quantitative WGA è comunemente utilizzato per quantificare i contaminanti nelle reazioni WGA 7,34, ed è il metodo più sensibile noto per quantificare la presenza di DNA di sequenza non nota, dando il metodo grande promessa in aree di applicazione diversi come il controllo di qualità farmaceutica, medicina legale, e astrobiologia. Bulk lettura digitale può beneficiare altri protocolli di analisi digitale, come la PCR digitale, accelerando, parallelizzazione, e semplificando test di lettura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Evagreen Dye | Biotium | 31000 | |
| Bovine serum albumin | New England Biotechnologies | B9000S | |
| Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer | New England Biotechnologies | B0269S | Vortex periodically until aggregate dissolves |
| Lambda DNA | New England Biotechnologies | N3011S | Heated to 50 oC and quenched on ice prior to dilution |
| Randomized MDA oligos | Integrated DNA Technologies | 5'-NNNNN*N-3' | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’ | |
| UltraPure Nuclease-free water | Life Technologies | 10977-015 | UV-treated for 30 min in Stratalinker 2400 before use (optional) |
| ROX reference dye | Life Technologies | 12223-012 | |
| PCR optical strip caps | Life Technologies | 4323032 | |
| PCR tubes | Agilent Technologies | 401428 | |
| dNTP (25 micromolar each) | Agilent Technologies | 200415 | |
| Thermocycler - Mx3000P qPCR system | Agilent Technologies | 401403 | |
| Barrier pipette tips | VWR | 89003-046 | |
| Bio-rad oil for evagreen | Bio-rad | 186-4005 | |
| JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P2893-100RXN |
References
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