여기에서는 가장 다양한 영역을 가진 동물을 면역화한 다음 사전 흡착으로 교차 반응성 항체를 제거하여 고도로 보존된 단백질 계열의 특정 구성원에 대한 항체를 선택적으로 표적으로 합니다.
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방법 논문
그 닫기 동족체, NOR1 및 Nur77에 대하여 교차 반응의 Nurr-1 특정 클론 항체 무료 제작
이 논문에서
요약
초록
핵 수용체 아족 4(NR4A)는 DNA 결합 도메인(DBD)과 리간드 결합 도메인(LBD)을 공유하는 3개의 관련 단백질로 구성됩니다. 핵 수용체와 관련된 1 개의 단백질 (Nurr1 또는 NR4A2)은 도파민 시스템의 유지에 중요한 역할을합니다. Nurr1 유전자와 관련된 도파민 기능 장애에는 파킨슨병, 정신분열증, 조울증 등이 있습니다. 또한 최근의 증거에 따르면 Nurr1은 해마와 같은 다른 뇌 영역에서도 발현되며 학습 및 기억에 중요한 역할을 합니다. 이 과의 다른 구성원은 신경 성장 인자 IB(Nur77 또는 NR4A1)와 뉴런 유래 고아 수용체 1(NOR1 또는 NR4A3)입니다. 도파민 및 기타 뇌 영역 관련 신경 기능 장애에서 Nurr1의 정확한 기능적 역할을 조사하기 위해 Nur77 및 NOR1에 대한 교차 반응이 없는 항체가 필요했습니다. 단백질은 DNA 결합 도메인보다 LBD에서 더 다양하기 때문에 정제된 LBD를 사용한 면역은 Nur77 및/또는 NOR1에 대한 최소한의 반응으로 Nurr1에 특이적인 항체를 생성해야 합니다. 항 Nurr1 항체가 성공적으로 생성되었지만, 이 항체는 가족의 다른 구성원에 대해 상당한 면역 반응을 보였습니다. 고정된 단백질 A에 대한 친화성 크로마토그래피에 이어 고정된 Nur77 및 NOR1 LBD에 대한 사전 흡착을 통해 교차 반응성이 없는 Nurr1 특이적 항체를 생성했습니다. 여기서, 우리는 가장 다양한 영역을 가진 동물을 면역화한 다음 사전 흡착으로 교차 반응 항체를 제거하여 고도로 보존된 단백질 계열의 특정 구성원에 대한 항체를 선택적으로 표적화합니다. 이 프로토콜의 목표는 교차 반응성 항원에 대한 사전 흡착을 통해 다클론 항체 특이성을 높이는 것입니다.
서론
전사 인자 Nurr1 및 동족체 (Nur77 및 NOR1은) 핵 수용체 아과의 4A (NR4A 1)에 속한다. 자신의 내인성 리간드는 아직 확인되지 않기 때문에 그들은 또한 고아 수용체이다. Nurr1 먼저 1992 년에 복제되고 알려져 있지만 뇌 2로 표현되는, 개발 및 중뇌 도파민 신경 세포의 유지 보수를 위해 자사의 중요한 역할은 녹아웃 마우스 연구 (3)에 의해 밝혀졌다. 또한, 중뇌 도파민 신경 세포의 유지에 대한 중요한 역할은 최근 조건부 녹아웃 공부 (4)에 의해 입증되었다. 인해 중뇌 도파민 뉴런 Nurr1의 중요한 역할을 나타내는 이들 고급 연구에 많은 후속 연구는 주로 도파민 뉴런 및 도파민 - 관련 신경 변성 질환에 초점을 맞추고있다 중뇌 파킨슨 병 (PD) 5.
특히, Nurr1은 중뇌 도파민 (MDA) 신경 세포뿐만 아니라, 다이에서뿐만 아니라 발현강하게 Nurr1 다양한 뇌 기능에 중요한 역할을한다는 것을 보여주는 최근의 연구에 의해 지원되는 많은 비 다 분야에서 기능적인 역할을 할 수 있음을 시사 구절 뇌 영역 2. 예를 들어, 이러한 학습으로 해당 메모리 유도 활동을 보였다, 또는 다른 해마에 ....
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프로토콜
주의 : 아래에 인용 된 모든 용액의 조성은 재료 / 장비 테이블에서 발견 될 수있다.
1. 단백질 열 항체 정제
- 단백질을 스핀 컬럼 이전 절차를 시작하기에 15 분 동안 실온에 필요한 모든 버퍼 평형.
- 면역 혈청 희석 1 : 1 단백질의 IgG는 버퍼를 바인딩. (혈청 5ml를 권장).
- 조심스럽게 뚜껑에 박혀 될 수있는 수지를 꺼 내려 단백질을 벤치 위에 스핀 열을 누릅니다. 상단 캡을 제거하고 부드럽게 바닥 폐쇄을 스냅. 15 ml의 수집 튜브에 열을 놓고 스토리지 솔루션을 배출 할 수 있습니다.
- 버퍼를 결합 단백질의 IgG 5 mL를 추가하고 솔루션을 배출 할 수 있습니다.
- 컬럼에 희석 면역 혈청을 적용하고 흐름을 통해 수집합니다. 최상의 결과를 위해 칼럼의 항체 - 결합 capacit의 80 % 미만의 농도로 항체를 포함하는 샘플 볼륨을 추가Y.
- 버퍼를 결합 단백질의 IgG의 15 ㎖로 또는 280 nm에서의 흡광도가 0.1 이하가 될 때까지 열을 씻으십시오.
- 다섯 라벨 수집 튜브에 중화 버퍼의 100 μl를 추가합니다.
- 단백질에 열을 IgG의 용출 버퍼 5 mL를 추가하고 중화 버퍼의 1....
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결과
단백질의 비교 Nur77 LBD 및 NOR1 LBD 컬럼을 통과 한 다음 정제 된 안티 Nurr1 항체가 알 수있는도 1.로 도시되어 단백질과 컬럼 정제 Nurr1 특이 항체, 단백질 A-정제 Nurr1 항체는 강한 결합을 나타내 Nurr1 LBD에. 그러나, 그것은 또한 Nur77 LBD와 NOR1 LBD에 결합 중요한 보였다. 단백질 정제 Nurr1 항체 더 Nur77 LBD와 NOR1 LBD, Nurr1 항체가 Nur77과 NOR1과의 교차 반응 이었다는 것을 보여주는, Nur77 LBD 또는 NOR1 LBD에 결합 탐지와 Nurr1 LBD에 특이 적으로 결합을 전시 정제 최종 친화력에 대해 정제 할 때 완전히 제거.
이 특이성은 더 전체 길이 Nurr1, NOR1, 또는 Nur77 단백질을 (그림 2) 태그 MYC 융합 운반하는 발현 벡터로 형질 전환 된 CHO 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석에 의해 입증되었.......
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토론
이 프로토콜의 성공은 관심의 단백질 가족의 특정 멤버에 대해 제기 항체의 특성 분석을위한 순수한 단백질의 가용성에 의존합니다. 그것은 명확히 ELISA 및 웨스턴 블롯에 의하여 상당한 교차 반응성이 있다는 것을 확립 될 때까지의 단백질 A / G를 사용하여 항체를 정제 할 필요가 없다.
본문에 언급 된 바와 같이, 이러한 트리스 나 글리신과 같은 아민 - 함유 버퍼 열로 가교 될 단백질 (들)을 현탁 피하는 것이 중요하다. 또한 가교 결합에 사용되는 최적의 단백질 농도는 실험적으로 결정되어야한다. 너무 작은 흡착 효율을 감소시킬 수있는 동안 너무 칼럼에 많은 단백질은 입체 장애의 원인이됩니다. 따라서, 좋은 방법은 2 내지 10 ㎎ / ㎖ 범위의 단백질 농도를 테스트하도록하고, 생성 된 항체의 질을 평가하는 것이다.
여러 가지 요인이 때 일 고려되어야한다기술은 매우 특이적인 항체를 생성하는 데 실패합니다. 이들은 다음을 포함.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
이 작업은 NIH 보조금(NS070577 및 NS084869)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Nurr1, Nor 1 및 Nur77 | 컬럼 저장 용액 | ||
| AminoLink 커플링 수지 및 키트 | Thermo Scientific | 44890 | |
| 단백질 A 스핀 컬럼 | Thermo Scientific | 89978 | |
| Dulbecco의 인산염 완충 식염수 | Corning | 21-031-CV | |
| 96 웰 플레이트-바닥 플레이트, 하이 플랜지, 330 &뮤; l | Thermo Scientific | 3455 | |
| 10% 일반 염소 세럼 | KPL | 50-675-69 | |
| 우유 희석제/ 차단 농축액 | KPL | 50-82-01 | |
| IgG 용리 완충액 | Thermo Scientific | 21004 | |
| Micro BCA 단백질 분석 키트 | Thermo Scientific | 23235 | |
| 말 무 과산화효소 접합 염소 항토끼 IgG (H+L) | Thermo Scientific | 31460 | |
| Ni-NTA 수지 | Thermo Scientific | 88221 | |
| 3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine | Thermo Scientific | 34028 | |
| 2N H2SO4Macron | Fine Chemicals | H381 05 | |
| Protein A IgG Binding Buffer | Thermo Scientific | 21001 | |
| IgG 용리 완충액 | Thermo Scientific | 21004 | |
| 컬럼 저장 용액 | Phosphate Buffered 0.02% 아지드화나트륨 | ||
| Spectra/Por 7 전처리 투석 튜브 | Spectrum Labs | 132128 | |
| 10ml 일회용 컬럼 | Thermo Scientific | 29924 | |
| AminoLink 커플링 버퍼 | 0.1M 인산나트륨, 0.05% NaN3, pH 7.0 | ||
| 담금질 버퍼 | 1M Tris. HCI, 0.05 % NaN3, pH 7.4 | ||
| 세척 용액 | 1M NaCl, 0.05 % NaN3 | ||
| ELISA 차단 버퍼 | 1 % 일반 말 혈청 (NHS), 1X KPL 우유 희석제에 1 % 일반 염소 혈청 (NGS) | ||
| 0.02 % 아지 화 나트륨 | 저장 용액 | ||
| 마이크로 피펫 : 10 μ l; 20 &뮤; l; 200 &뮤; l; 1000 &뮤; 엘 |
참고문헌
- Hawk, J. D., Abel, T. The role of NR4A transcription factors in memory formation. Brain Res. Bull. 85 (1-2), 21-29 (2011).
- Law, S. W., Conneely, O. M., DeMayo, F. J., O'Malley, B. W. Identification of a new brain-specific transcription factor, NURR1. Mol. Endocrinol.
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재인쇄 및 허가
