A base di seta-collagene Engineered Modello 3D del tessuto neurale polarizzata

Introduction

Il sistema nervoso centrale (CNS) può essere influenzata da una varietà di disturbi che coinvolgono vascolare, strutturale, funzionale, infettiva o degenerativa. Si stima che 6,8 milioni di persone muoiono ogni anno a causa di disturbi neurologici, che rappresenta un crescente onere socioeconomico in tutto il mondo ^1. Tuttavia, solo alcuni dei disturbi sono trattamenti disponibili. Pertanto, vi è una necessità critica per strategie terapeutiche innovative per i pazienti affetti da disturbi neurologici. Purtroppo, molte terapie CNS-mirate falliscono durante gli studi clinici, in parte a causa dell'utilizzo di modelli inadeguati di ricerca pre-clinica, che non consentono la valutazione degli impatti acuti e cronici con fisiologicamente rilevanti letture funzionali.

Nonostante i significativi sforzi di ricerca nel corso degli ultimi decenni, vi è una grande quantità sconosciuto circa la struttura e la funzione del sistema nervoso centrale. Al fine di acquisire maggiori conoscenze, i modelli animali sono spesso noied al modellare stati patologici, come i traumi cerebrali (TBI) o demenza, soprattutto in studi pre-clinici. Tuttavia, gli animali differiscono significativamente dagli esseri umani sia in anatomia del sistema nervoso centrale, nonché in funzione, l'espressione genica e metabolismo ^2-4. D'altra parte, culture 2D in vitro sono il metodo comune per indagare la biologia cellulare e sono abitualmente utilizzati per la scoperta di farmaci. Tuttavia, le colture cellulari 2D mancano della complessità e rilevanza fisiologica rispetto al cervello umano ^5-7. Mentre non vi è alcun sostituto per il basso costo e la semplicità di studi su colture cellulari in 2D o la complessità fornito da modelli animali, l'ingegneria dei tessuti 3D potrebbe generare modelli di ricerca migliorati per colmare il divario che esiste tra il 2D in vitro e in vivo approcci. Ingegneria dei tessuti 3D fornisce più fisiologicamente rilevanti condizioni sperimentali ottenuti da interazioni cellula-cellula 3D e segnali extracellulari forniti dalle impalcature biomateriale. Despite le prove significative dietro il valore delle culture in 3D, ci sono attualmente solo pochi modelli di tessuto 3D del sistema nervoso centrale, come staminali derivati ​​dalle cellule culture organoide ^8-10, neurospheroids ^{11 e} dispersi culture idrogel ^12,13. Modalità tecniche avanzate che includono multilayer litografia ^14, e la stampa 3D ¹⁵ sono stati utilizzati per lo studio del polmone, del fegato e tessuto renale. Tuttavia, vi è la mancanza di modelli 3D SNC che permettono la crescita neuronale compartimentato, come mimando l'architettura corticale e biologia. Separato crescita dei neuriti da corpi cellulari neuronali è stato precedentemente dimostrato nelle culture 2D utilizzando microfabbricazione ^16,17 permettendo lo studio di tracciato del tratto assoni, flusso di calcio, l'architettura di rete e attività. Questa idea ci ha ispirato a sviluppare un tessuto neurale polarizzata 3D in cui i corpi cellulari e tratti assonali sono situati in diversi comparti che mimano l'architettura a strati del cervello ¹⁸

Protocol

Il protocollo di isolamento tessuto cerebrale è stato approvato dal Istituzionale Cura e Comitato uso degli animali Tufts University ed è conforme con il National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio (Institutional Animal Care and Use Committee B2011-45).

1. Silk Scaffold Preparazione

1. Preparazione della soluzione da seta Bombyx mori bozzoli, come descritto in precedenza ^19,20.
   1. Tagliare ogni bozzolo in 8 pezzi uguali con le forbici. Usare circa 11 bozzoli per 5 g di bozzoli frammentati. (15 min)
   2. Preparare 2 L di 0,02 M _Na 2 _CO 3 soluzione e portarla a bollore con un piatto caldo. (15 min)
   3. Pesare 5 g di bozzoli frammentate e lessateli in _Na 2 CO ₃ soluzione per 30 minuti. Mescolare la seta bollente ogni paio di minuti con una spatola. Questa fase, detta anche de-gommatura, purifica fibroina di seta da proteine ​​idrofili, sericins. (30 min)
   4. Posizionare la fibroina bagnato su una capsula di Petri e asciugare l'estratto fibroina nella cappa a flusso O / N.
   5. Il giorno dopo pesare la massa fibroina secca e posizionare il fibroina in un bicchiere di vetro. (15 min)
   6. Per sciogliere la fibroina in soluzione 9,3 M LiBr, calcolare il volume necessario (ml) di LiBr moltiplicando la massa della fibroina secca per 4. Versare lentamente soluzione LiBr sul fibroina di seta e immergere tutte le fibre di fibroina utilizzando una spatola. Coprire il becher per evitare l'evaporazione e posizionarlo a 60 ° C per 4 ore per consentire alle fibre di sciogliere. (15 min)
   7. Usando la siringa, raccogliere la soluzione fibroina dal bicchiere e caricarlo nei MWCO 3.500 cassette di dialisi. Eseguire la dialisi contro acqua distillata per 48 ore. Cambiare l'acqua ogni due ore.
   8. Utilizzando la siringa, raccogliere la soluzione da fibroinale cassette in 50 ml provette coniche e centrifughi due volte a 9.000 giri (~ 12,700 xg) a 4 ° C per 20 min. Versare il surnatante in una nuova provetta dopo ogni fase di centrifugazione e scartare il pellet. (40 min)
   9. Misurare la concentrazione della fibroina stimando il peso secco. Versare 1 ml di soluzione di seta in una barca pesare. Essiccare il campione in stufa a 60 ° C per 2 ore. Pesare il fibroina di seta secca e calcolare la concentrazione della soluzione di fibroina di seta moltiplicando il peso ottenuto per 100. La concentrazione previsto di soluzione seta è 6-9% (w / v).
   10. Regolare la concentrazione di seta al 6% (w / v) diluendo in acqua distillata.
       Fermata: La fibroina seta liquida può essere conservato a 4 ° C fino ad un mese in un contenitore chiuso.
2. Preparazione di scaffold porosi di soluzione di seta.
   1. Setacciare la granulari NaCl per separare i granuli di dimensioni 500-600 micron, che verrà utilizzato nei passaggi successivi. Eliminare il granulos dimensioni di sotto di 500 micron e sopra 600 micron. (15 min)
   2. Versare 30 ml di soluzione di seta 6% nello stampo politetrafluoroetilene (PTFE) (Figura 1). Spargere delicatamente 60 g di NaCl setacciata sulla seta. Premere il contenitore per ottenere uno strato uniforme di sale. Incubare 48 ore a RT per polimerizzare la seta.
   3. Collocare lo stampo PTFE contenente scaffold in forno a 60 ° C per 1 ora per completare la polimerizzazione e far evaporare il liquido in eccesso.
   4. Posizionare il contenuto dello stampo PTFE in un bicchiere contenente 2 L di acqua distillata per 48 ore a percolare il sale. Cambiare l'acqua 2-3 volte al giorno. Rimuovere le impalcature spugna dagli stampi quando il sale è completamente colato fuori del punto finale:. Le spugne possono essere conservati immersi in acqua a 4 ° C in un contenitore chiuso per impedire scaffold disidratazione.
   5. Quando si è pronti, tagliare i ponteggi con diametro 5 mm biopsia. Pre-tagliare le impalcature per raggiungere circa 2 mm di altezza. PuNCH ​​il centro del ponteggio con il punzone di diametro biopsia 2 mm (Figura 2A). (1 ora)
   6. Autoclavare i ponteggi immersi in acqua per sterilizzarli (ciclo bagnato, 121 ° C, 20 min) del punto finale:. Le spugne possono essere conservati immersi in acqua a 4 ° C in un contenitore chiuso per impedire scaffold disidratazione.
   7. Prima della semina cellulare programmata, immergere i ponteggi in soluzione sterile 0,1 mg / ml di poli-D-lisina (PDL). Incubare per 1 ora a 37 ° C.
   8. Lavare i ponteggi 3x con tampone fosfato salino (PBS) per rimuovere PDL non vincolati. (30 min)

2. Isolamento di ratto neuroni corticali

1. Sezionare cortecce da giorno embrionale 18 ratti (E18) Sprague-Dawley come precedentemente descritto da Pacifici e Peruzzi ²⁷ dopo l'ottenimento del protocollo animale approvato. (2 ore)
2. Incubare 10 cortecce in 5 ml di 0,25% tripsina con 0.3% DNasi I (da pancreas bovino) per 20 min a 37 ° C.
3. Inattivare i tripsina aggiungendo uguale volume di 1 mg / ml di proteine ​​di soia.
4. Triturare le cortecce con 10 ml pipetta Pasteur pipettando su e giù per 20 volte fino a quando viene generato una sospensione singola cellula. Sii gentile e evitare la formazione di bolle d'aria. (10 min)
5. Centrifugare la sospensione cellulare a 127 xg per 5 min.
6. Risospendere il pellet cellulare in 10 ml di terreno di coltura (Neurobasal medio, 1x B27 supplemento, 1x Glutamax, 1% di penicillina / streptomicina). Contare le cellule. La concentrazione cellulare è di circa 2x10 previsto ^{7 /} ml. (20 min)

3. Costruire Montaggio e Cultura

1. Ponteggio semina con le cellule.
   1. Spostare i ponteggi sterili e tutti gli utensili necessari all'interno di una cappa di coltura cellulare. Con pinza sterile posto i ponteggi in un piatto di coltura cellulare a 96 pozzetti attribuzione di un ponteggio per pozzetto. (10 min)
   2. Immergere i ponteggi in terreno di coltura cellulare per equilibrare loro prima di logge dei semiing. Incubare per 1 ora a 37 ° C. (10 min)
   3. Aspirare l'eccesso del mezzo dalle impalcature.
   4. Applicare 100 ml di sospensione cellulare / patibolo. (10 min)
   5. Incubare le cellule a 37 ° CO / N per permettere l'adesione delle cellule al ponteggio.
   6. La mattina seguente aspirare le cellule non iscritti e applicare 200 pl / pozzetto di terreno di coltura fresco. (10 min)
2. Impalcatura embedding con matrice di collagene. (2 ore)
   1. Mettere 10x PBS, acqua, 1 N NaOH e coda di topo collagene sul ghiaccio. Preparare una soluzione di lavoro di collagene secondo le istruzioni del produttore. Mantenere in ghiaccio fino alle costruzioni cellulari-seeded sono pronti (fino a 1 ora).
   2. Rimuovere i costrutti di seta cellulari testa di serie dal termostato e aspirare l'eccesso di mezzo.
   3. Con pinza sterile trasferire i ponteggi nei pozzetti vuoti sulla piastra pozzo e immergono ogni impalcatura in 100 ml di 3 mg / ml soluzione di collagene. Posizionare la piastra di coltura tissutale indietroin incubatrice per 30 min per permettere la polimerizzazione del collagene.
   4. Applicare 100 ml di pre-riscaldato terreno di coltura cellulare / bene. Cultura i costrutti per uno settimana cambiando il mezzo ogni giorno sostituendo solo la metà del volume del mezzo.

4. Microscopia Analisi

1. Vivo colorazione / morti (1 ora)
   1. Preparare soluzione stock di ioduro di propidio (PI) 1 mg / ml (1,5 mm) in acqua distillata.
   2. Preparare soluzione stock di diacetato fluoresceina (FDA) 2 mg / ml in acetone.
   3. Preparare la soluzione di lavoro contenente 10 micron e 0,15 micron PI FDA diluito in PBS. Pre-riscaldare la soluzione a 37 ° C in un bagno d'acqua.
   4. Lavare le cellule con PBS preriscaldata a rimuovere le esterasi siero. Aspirare il PBS.
   5. Applicare la soluzione preriscaldata lavorando sulle cellule per 2 minuti e lavare con PBS.
   6. Utilizzare microscopio epifluorescente all'immagine delle cellule (PI ex λ = 490 nm, em λ = 570 nm; FDA ex λ = 490 nm, em λ = 514 nm). La macchia rimane stabile nel 40 min. Colorazione prolungata può causare macchie aspecifica risultante da PI captazione da parte delle cellule e co-localizzazione di PI / FDA in cellule.
2. Immunostaining
   1. Al punto di tempo desiderato della cultura fissare le cellule con 4% paraformaldeide (PFA) per 30 minuti a RT. A causa della tossicità dei fumi PFA la fase di fissaggio deve essere eseguito nella cappa.
   2. Lavare 3x ponteggi con PBS Fermata:. I costrutti PFA-fisse possono essere memorizzati in PBS a 4 ° C per diversi giorni prima di procedere con ulteriori passi.
   3. Incubare i ponteggi a 0,2% Triton, 0,25% di albumina sierica bovina (BSA) in PBS contenenti anticorpo primario O / N a 4 ° C.
   4. Il giorno seguente scartare la soluzione colorante e lavare i ponteggi 3 x 30 minuti con PBS per rimuovere l'anticorpo primario non legato.
   5. Incubare i campioni con anticorpo secondario diluito in 0,2% Triton, 0,25% BSA in PBS per 2ora a RT.
   6. Rimuovere la soluzione colorante e lavare i ponteggi 3 x 30 minuti con PBS per rimuovere l'anticorpo secondario non legato.
   7. Immagine i ponteggi utilizzando un microscopio confocale con obiettivo 20X prendendo 100 micron z-sezioni del campione con 1 micron passo. Per visualizzare le neuriti sottili la risoluzione dell'immagine dovrebbe essere di almeno 1.024 x 1.024 pixel.
3. RNA, DNA e isolamento delle proteine
   Nota: RNA, DNA e l'isolamento delle proteine ​​viene eseguita utilizzando un commerciale DNA AllPrep / RNA / proteine ​​Mini Kit secondo le istruzioni del produttore.
   1. Con pinza sterile trasferire i ponteggi di piastra di coltura di una provetta sterile 2 ml. Mettere una impalcatura per provetta.
   2. Aggiungere 200 ml di tampone RLT a ciascuna provetta.
   3. Interrompere il costrutto frammentando con microscissors sterili.
   4. Per omogeneizzare il tessuto perturbato, trasferire il contenuto del tubo alla colonna di spin. Spin per 2 minuti a tutta velocità in una microcentrifuga.Il lisato viene omogeneizzata che passa attraverso la colonna di spin.
   5. Raccogliere il flusso attraverso ed utilizzare immediatamente per isolare l'RNA, DNA e proteine ​​seguendo il protocollo del produttore.
   6. Quantificare la resa degli acidi nucleici qualsiasi altro metodo compatibile (ad esempio, NanoDrop).
   7. Quantificare la resa proteica tramite BCA Protein Assay secondo le istruzioni del produttore. Misurare i risultati di test con lettore di micropiastre alla lunghezza d'onda 562 nm.
      Nota: La resa prevista di acidi nucleici e proteine ​​per costrutto in relazione alla densità cellulare è mostrato in Figura 4.

Representative Results

Solid spugne seta pretagliato alla forma di ciambella rappresentano un'idea unica e semplice da realizzare un'architettura compartmentalized simile tessuto neurale (Figura 2A). La struttura altamente porosa del ponteggio con la dimensione dei pori di circa 500 micron risultati in eccezionalmente elevata area superficiale permettono la semina e la crescita di alta densità cellulare in un piccolo volume (2x10 ⁷ / ml) (Figura 2B). Inoltre, l'elevata porosità del patibolo permette per la diffusione illimitata di sostanze nutritive e di rifiuti con conseguente redditività superiore di colture cellulari dense un lasso di tempo prolungato. Dopo la semina i neuroni rapidamente ed uniformemente fissarle con la superficie dei pori ponteggio.

Dopo l'adesione cellulare è completa e le cellule sono in equilibrio sul substrato di seta, l'impalcatura spugna è riempito con la matrice di collagene morbido per fornire un ambiente 3D per la formazione della rete assonale (Figura 3 (Figura 3B). Al contrario, il gel di collagene fornisce un reticolo che supporta una vasta crescita degli assoni in 3D, mentre i corpi cellulari neuronali rimangono attaccate al ponteggio seta (Figura 3C). Questo modello di crescita porta a compartimentazione dei corpi cellulari e reti assonale puri (Figura 3D), che ricorda la materia grigia e bianca della corteccia del cervello.

Oltre microscopia, i costrutti possono essere valutati con una varietà di altri metodi ^18, a seconda della domanda dietro l'esperimento. Ad esempio, l'isolamento di DNA, RNA e di proteine ​​dei costrutti può essere facilmente realizzato utilizzando kit commerciali (Figura 4). La resa degli acidi nucleici e proteine ​​per costrutto dipende dal numero di cellule inizialmente seminate su scaffold seta. Più cellule seminate maggiore la resa di DNA, RNA e proteine.

Figura 1. stampo in PTFE utilizzati per la preparazione di spugna di seta patibolo le dimensioni:.. 10 cm di diametro, 2 cm altezza Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Modello 3D tessuto cerebrale-like. (A) poroso spugna seta patibolo. (B) Risultati in diretta colorazione / morti di neuroni al giorno 1 su semina sull'impalcatura di seta prima di collagene embedding (cellule verdi-live, le cellule rosse-morti). I pannelli sul lato destro mostrano la magnification di area catturata in cornici rosse. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. neuronale escrescenza compartimenti stagni nel modello di tessuto cerebrale 3D-like (A) scompartimenti impalcature:. Red-cell vano corpo, vano Blu-assonale. (B) modello di crescita neuronale al giorno 1 su semina prima collagene incorporamento. (C). Escrescenza neuronale al giorno 7 su seminare nel vano corpo cellulare. (D) escrescenza neuronale al giorno 7 su semina nel compartimento assonale. Verde -. ΒIIITubulin Cliccate qui per vedere una versione più grande di questofigura.

Figura 4. Rendimento atteso di (A) RNA e DNA, e (B) proteine ​​per costrutto in relazione alla quantità di cellule seminati per ponteggio (± SD, n = 5). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Na2CO3	Sigma-Aldrich	223530
LiBr	Sigma-Aldrich	213225
MWCO 3500 dialysis cassettes	Thermo Fisher	66110
Heating plate	Fisher Scientific	Isotemp
Centrifuge 5804 R	Eppendorf
Sieve	Fisher Scientific		No. 270, No. 35, No. 30
PTFE mold			made in house (Figure 1) 10 cm diameter, 2 cm height
NaCl	Sigma-Aldrich	71382
Biopsy Punch 5 mm	World Precision Instrument	501909
Biopsy Punch 2 mm	World Precision Instrument	501908
poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407-5MG	final concentration 10 μg/ml, dissolved in water
PBS	Sigma-Aldrich	D1283-500ML
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4049-500ML
DNase	Roche	10104159001	final concentration 0.3%
Soybean protein	Sigma-Aldrich	T6522-100MG	final concentration 1 mg/ml
Neurobasal medium	Gibco	21103049	warm up to 37 °C before use
B27 supplement 50x	Gibco	17504-044
Glutamax	Gibco	35050-061
Penicilin Streptomycin	Corning	30-002-CI
Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	final concentration 3 mg/ml
NaOH	Sigma-Aldrich	S2770	corrosive
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170-10MG	toxic
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378-5G
Olympus MVX10	Olympus
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	toxic, final concentration 4%
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-10G
anti-βIIITubulin antibody	Sigma-Aldrich	T2200	rabbit 1:500
anti-rabbit Alexa-546	Molecular Probes	A11010	goat 1:250
goat serum	Sigma-Aldrich	G9023-5ML
Leica SP2 confocal microscope	Leica		objective 20X
QIAshredder	Qiagen	79654
AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit	Qiagen	80004
Ethyl alcohol, Pure	Sigma-Aldrich	E7023
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	63689
NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific
BCA protein assay	Thermo Scientific	23225
Plate reader Spectramax M2	Molecular Devices		absorbance 562 nm
Micro Scissors, Economy, Vannas-type	TedPella	1346