Baseada em Silk-colágeno Engineered 3D Model of Tissue polarizada Neural

Introduction

O sistema nervoso central (SNC) pode ser afectada por uma variedade de desordens que envolvem vascular, estrutural, funcional, infecciosas ou degenerativas. Estima-se que 6,8 milhões de pessoas morrem a cada ano em conseqüência de distúrbios neurológicos, o que representa um fardo socioeconômico crescente em todo o mundo ^1. No entanto, apenas algumas das desordens têm tratamentos disponíveis. Portanto, há uma necessidade crítica de estratégias terapêuticas inovadoras para pacientes que sofrem de distúrbios neurológicos. Infelizmente, muitas terapias CNS segmentados falhar durante os ensaios clínicos, em parte devido à utilização de modelos de investigação pré-clínica inadequados, que não permitem a avaliação dos impactos agudos e crônicos com leituras funcionais fisiologicamente relevantes.

Apesar dos esforços de investigação significativos nas últimas décadas, há uma vasta quantidade desconhecida sobre a estrutura e função do SNC. A fim de ganhar mais conhecimento, modelos animais são freqüentemente nósEd para modelar estados patológicos, tais como lesão cerebral traumática (TBI) ou demência, especialmente em estudos pré-clínicos. No entanto, os animais a partir de seres humanos diferem significativamente tanto na anatomia do sistema nervoso central, bem como em função, a expressão do gene e metabolismo ^2-4. Por outro lado, in vitro, culturas 2D são o método mais comum para investigar a biologia celular e são rotineiramente utilizado para descoberta de drogas. No entanto, as culturas de células em 2D falta a complexidade e relevância fisiológica em comparação com cérebro humano ^5-7. Enquanto não há substituto para o baixo custo e simplicidade de estudos de cultura de células em 2D ou a complexidade fornecida por modelos animais, a engenharia de tecidos 3D poderia gerar melhores modelos de pesquisa para fechar a lacuna que existe entre o 2D in vitro e in vivo abordagens. Engenharia de tecidos 3D fornece condições experimentais mais fisiologicamente relevantes obtidos por 3D interacções célula-célula e sinais extracelulares previstos pelos andaimes biomaterial. Despite a evidência significativa por trás do valor das culturas 3D, existem atualmente apenas alguns modelos de tecido do sistema nervoso central, tais como 3D-tronco derivadas de células culturas organ�de ^8-10, neurospheroids ^{11 e} disperso culturas hidrogel ^12,13. Métodos de técnicas avançadas de multicamadas, incluindo a litografia ^14, e impressão em 3D ¹⁵ foram utilizados para o estudo do pulmão, fígado, rim e tecido. No entanto, existe a falta de modelos 3D do SNC que permitam o crescimento neuronal compartimentada, como imitando a arquitetura cortical e biologia. Separado do crescimento de neurites a partir de corpos de células neuronais foi anteriormente demonstrada em culturas 2D utilizando microfabricação ^16,17 permitindo que o estudo de rastreio tracto axónio, o influxo de cálcio, arquitetura de rede e actividades. Esta idéia nos inspirou a desenvolver um tecido neural polarizada 3D onde os corpos celulares e tratos axonais estão localizados em diferentes compartimentos imitando a arquitetura em camadas do cérebro ¹⁸

Protocol

O protocolo de isolamento tecido cerebral foi aprovado pelo Comitê da Universidade Tufts Animal Care Institucional e Use e está em conformidade com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Institutional Animal Care e do Comitê Use B2011-45).

1. Silk Andaime Preparação

1. Preparação de solução de seda Bombyx mori casulos como descrito anteriormente ^19,20.
   1. Corte cada casulo em 8 pedaços iguais usando uma tesoura. Use cerca de 11 casulos para 5 g de casulos fragmentados. (15 min)
   2. Prepare 2 L de 0,02 M _Na 2 _CO 3 solução e trazê-lo para ferver utilizando um prato quente. (15 min)
   3. Pesar 5 g de casulos fragmentados e ferve-las em Na ₂ CO ₃ solução durante 30 min. Agita-se a seda ferver a cada dois minutos com uma espátula. Esta etapa, também chamado de-resinagem, purifica fibroína de seda a partir de proteínas hidrófilas, sericins. (30 min)
   4. Coloque a fibroína molhado numa placa de Petri e secar o extracto de fibroína na câmara de fluxo S / N.
   5. No dia seguinte, pesar a massa seca fibroína e colocar a fibroína numa proveta de vidro. (15 min)
   6. A fim de dissolver a fibroína em 9,3 M solução de LiBr, calcular o volume necessário (em ml) de LiBr multiplicando a massa de fibroína seco por 4. verter lentamente sobre solução de LiBr a fibroína de seda e mergulhe todas as fibras de fibroína usando uma espátula. Tapar o copo para evitar a evaporação e colocá-lo a 60 ° C durante 4 horas para permitir que as fibras se dissolva. (15 min)
   7. Usando a seringa, recolher a solução fibro�a do copo e carregá-lo para os MWCO 3.500 cassetes de diálise. Executar a diálise contra água destilada durante 48 horas. Troque a água a cada duas horas.
   8. Usando a seringa, recolher a solução de fibroínaas cassetes em tubos de 50 ml de centrífuga cónicos e duas vezes a 9000 rpm (~ 12.700 xg) a 4 ° C durante 20 min. Verter o sobrenadante para um tubo fresco após cada passo de centrifugação e descarte do sedimento. (40 min)
   9. Medir a concentração de fibroína através da estimativa do peso seco. Despeje 1 ml de solução de seda em um barco pesar. Seca-se a amostra no forno a 60 ° C durante 2 horas. Pesar a fibroína de seda seca e calcular a concentração de uma solução de fibroína de seda, multiplicando o peso obtido por 100. A concentração esperada de solução de seda é de 6-9% (w / v).
   10. Ajustar a concentração de seda a 6% (w / v) diluindo-o em água destilada.
       Ponto de paragem: O líquido de fibroína de seda pode ser armazenado a 4 ° C durante até um mês em um recipiente fechado.
2. Preparação de matrizes porosas a partir de solução de seda.
   1. Peneirar o granulado de NaCl para separar os grânulos de tamanho 500-600 um, que será utilizado nas etapas posteriores. Descartar o grânulos dimensionados abaixo de 500 um e acima de 600 um. (15 min)
   2. Pour 30 ml de solução de seda 6% no molde de politetrafluoretileno (PTFE) (Figura 1). Delicadamente espalhar 60 g de NaCl peneirada sobre a seda. Toque no recipiente para se obter uma camada uniforme de sal. Incubar 48 horas à temperatura ambiente para polimerizar o seda.
   3. Coloque o molde de PTFE contendo andaime no forno a 60 ° C durante 1 h para finalizar a polimerização e evapora-se o líquido restante.
   4. Colocar o conteúdo do molde de PTFE num copo contendo 2 L de água destilada durante 48 horas para lixiviar o sal. Troque a água 2-3 vezes por dia. Remover os andaimes de esponja dos moldes quando o sal é completamente lixiviado para fora do ponto final:. As esponjas podem ser armazenadas imersas em água a 4 ° C num recipiente fechado para evitar que os suportes de desidratação.
   5. Quando estiver pronto, cortar os andaimes com 5 milímetros de diâmetro biópsia soco. Pré-cortar os andaimes para chegar a cerca de 2 mm de altura. PuNCH ​​para fora do centro do andaime com a 2 mm de diâmetro punção para biópsia (Figura 2A). (1 h)
   6. Autoclave os andaimes imersas em água para esterilizá-los (ciclo molhado, 121 ° C, 20 min) Ponto de paragem:. As esponjas podem ser armazenadas imersas em água a 4 ° C num recipiente fechado para evitar que os suportes de desidratação.
   7. Antes da sementeira celular prevista, imergir os suportes na solução estéril a 0,1 mg / ml de poli-D-lisina (PDL). Incubar durante 1 hora a 37 ° C.
   8. Lavar os andaimes 3x com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover PDL não ligado. (30 min)

2. Isolamento de Rato Os neurónios corticais

1. Dissecar córtices do dia embrionário 18 ratos (E18) Sprague-Dawley como previamente descrito por Pacifici e Peruzzi ²⁷ após protocolo de animais aprovado seja obtido. (2 h)
2. Incubar 10 córtices em 5 ml de 0,25% de tripsina com 0,3% de DNase I (a partir de pâncreas bovino) durante 20 min a 37 ° C.
3. Inactivar a tripsina por adição de igual volume de 1 mg / ml de proteína de soja.
4. Triturar os córtices usando 10 ml de pipeta Pasteur por pipetagem cima e para baixo 20 vezes, até uma suspensão única célula é gerada. Seja gentil e evitar a formação de bolhas de ar. (10 min)
5. Centrifugar a suspensão de células a 127 xg durante 5 min.
6. Re-suspender o sedimento celular em 10 ml de meio de cultura (meio Neurobasal, 1x suplemento de B27, 1x Glutamax, 1% de penicilina / estreptomicina). Contar as células. A concentração de células é de cerca de 2x10 esperado ⁷ / ml. (20 min)

3. Construa Assembleia e Cultura

1. Semeadura andaime com células.
   1. Mova os andaimes estéreis e todos os utensílios necessários dentro de uma capa de cultura de célula. Utilizando fórceps estéreis os colocar andaimes em uma placa de 96 poços de cultura de células alocar um andaime por poço. (10 min)
   2. Mergulhe os andaimes em meio de cultura de células para equilibrar-los antes para a célula de sementesing. Incubar durante 1 hora a 37 ° C. (10 min)
   3. Aspirar o excesso de a forma de andaimes.
   4. Aplicar 100 ul de suspensão de células / andaime. (10 min)
   5. Incubar as células a 37 ° CO / N para permitir a fixação de células ao andaime.
   6. Na manhã seguinte aspirar as células não ligadas e aplicar 200 ul / poço de meio de cultura fresco. (10 min)
2. Andaime com a incorporação de matriz de colagénio. (2 h)
   1. Coloque 10x PBS, água, NaOH 1 N e rato cauda I colágeno no gelo. Preparar uma solução de trabalho de colagénio de acordo com as instruções do fabricante. Manter em gelo até que as construções de células semeadas está pronto (até 1 hora).
   2. Retirar as construções de células-seda semeado da incubadora e aspirar o excesso de meio.
   3. Utilizando fórceps estéreis os andaimes para transferir os poços vazios na placa e assim imergir cada andaime em 100 ul de solução de colagénio de 3 mg / ml. Coloque a placa de cultura de tecidos de voltana incubadora durante 30 min para permitir a polimerização do colagénio.
   4. Adicionar 100 ul de meio de cultura de células pré-aquecido / poço. Cultura das construções durante uma semana de mudar o meio todos os dias, substituindo metade do volume do meio.

4. Análise de Microscopia

1. Coloração Live / mortos (1 hr)
   1. Preparar a solução de estoque de iodeto de propídio (PI) a 1 mg / ml (1,5 mM) em água destilada.
   2. Preparar a solução de estoque de diacetato de fluoresceína (FDA) de 2 mg / ml em acetona.
   3. Preparar uma solução de trabalho contendo 10 PI uM e 0,15 uM FDA diluído em PBS. Pré-aquecer a solução a 37 ° C num banho de água.
   4. Lavam-se as células com PBS pré-aquecido para remover as esterases do soro. Aspirar o PBS.
   5. Aplicar a solução pré-aquecida de trabalho sobre as células durante 2 minutos e lavá-lo com PBS.
   6. Uso de microscópio de epifluorescência a imagem das células (PI ex λ = 490 nm, em λ = 570 nm; FDA ex λ = 490 nm, em λ = 514 nm). A mancha permanece estável ao longo de 40 min. Coloração prolongado pode resultar em coloração inespecífica resultante da absorção pelas células PI e de co-localização de PI / FDA em células.
2. Immunostaining
   1. No ponto de tempo de cultura desejado fixar as células com paraformaldeído a 4% (PFA) durante 30 min à TA. Devido à toxicidade do PFA emanações o passo de fixação deve ser realizada na hotte química.
   2. Lavar 3x com PBS andaimes Ponto de paragem:. As construções de PFA-fixadas podem ser armazenadas em PBS a 4 ° C durante vários dias antes de prosseguir com outros passos.
   3. Incubar os andaimes em 0,2% de Triton, 0,25% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS contendo anticorpo primário O / N a 4 ° C.
   4. No dia seguinte descartar a solução de coloração e lavar os andaimes 3 x 30 min com PBS para remover o anticorpo primário não ligado.
   5. Incubar as amostras com anticorpo secundário diluído em 0,2% de Triton, 0,25% de BSA em PBS durante 2h à TA.
   6. Remover a solução de coloração e lavar os andaimes 3 x 30 min com PBS para remover o anticorpo secundário não ligado.
   7. Imagem andaimes utilizando um microscópio confocal com objetivo 20X, tendo 100 mm z-seções da amostra com 1 um passo. Para visualizar as neurites finas a resolução da imagem deve ser de no mínimo 1.024 x 1.024 pixels.
3. ARN, ADN e o isolamento das proteínas
   Nota: RNA, DNA e isolamento de proteínas é realizada utilizando um ADN comercial AllPrep / ARN / proteína Mini Kit de acordo com as instruções do fabricante.
   1. Utilizando uma pinça estéril transferir os andaimes de placa de cultura para um tubo de 2 ml estéril. Coloque um andaime por tubo.
   2. Adicionar 200 ul de tampão RLT a cada tubo.
   3. Disrupt a construção fragmentando-o com microtesoura estéreis.
   4. Para homogeneizar o tecido perturbado, transferir o conteúdo do tubo para a coluna de centrifugação. Girar por 2 min a toda a velocidade numa micro.O lisado é homogeneizado à medida que passa através da coluna de spin.
   5. Recolhe-se o fluxo através e utilizá-la imediatamente para isolar o ARN, ADN e proteína, seguindo o protocolo do fabricante.
   6. Quantificar a produção dos ácidos nucleicos de qualquer outro método compatível (por exemplo, NanoDrop).
   7. Quantificar a produção de proteína utilizando o BCA Protein Assay de acordo com as instruções do fabricante. Medir o resultado de ensaio usando leitor de microplacas a 562 nm de comprimento de onda.
      Nota: O rendimento esperado de ácidos nucleicos e proteínas, por construção, em relação à densidade de células é mostrada na Figura 4.

Representative Results

Sólido de seda esponjas pré-cortada com a forma de rosca representam uma ideia original e simples para conseguir uma arquitectura semelhante a tecido neural compartimentada (Figura 2A). A estrutura altamente porosa do andaime com o tamanho de poro de cerca de 500 um resultado em área superficial excepcionalmente elevada permitindo a sementeira e o crescimento de elevada densidade celular dentro de um pequeno volume (2x10 ⁷ / ml) (Figura 2B). Além disso, a elevada porosidade do andaime permite a difusão livre de nutrientes e resíduos que resultam em viabilidade superior de culturas celulares densas sobre quadros de tempo prolongado. Após a sementeira dos neurónios rápida e uniformemente aderem à superfície dos poros de andaime.

Após a fixação das células está concluída e as células são equilibradas sobre o substrato de seda, o andaime esponja é preenchido com a matriz de colagénio macio, a fim de proporcionar um ambiente 3D para a formação da rede axonal (Figura 3 (Figura 3B). Em contraste, o gel de colagénio proporciona uma malha que suporta grande crescimento axonal em 3D, enquanto que os corpos celulares neuronais permanecer ligado ao andaime de seda (Figura 3C). Este padrão de crescimento conduz a compartimentalização de corpos celulares axonais e redes puros (Figura 3D), o qual se assemelha a matéria cinzenta e branca do córtex do cérebro.

Além de microscopia, as construções podem ser avaliadas com uma variedade de outros métodos de ^18, dependendo da questão por trás do experimento. Por exemplo, o isolamento de ADN, ARN e proteína a partir das construções podem ser facilmente realizados utilizando kits comerciais (Figura 4). O rendimento de ácidos nucleicos e de proteínas PER construção depende do número de células inicialmente semeadas em andaimes de seda. Quanto mais células semeadas quanto maior o rendimento de ADN, ARN e proteína.

Figura 1. PTFE molde utilizado para a preparação esponja seda andaime As dimensões:.. 10 cm de diâmetro, a 2 cm de altura por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Modelo 3D tecido cerebral-like. (A) poroso esponja seda andaime. (B) Live / coloração de neurônios mortos no dia 1 após a semeadura na seda andaime antes de colágeno incorporação (células verdes-live, células red-mortos). Painéis sobre lado direito mostrar a magnification da área capturada em molduras vermelhas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Neuronal conseqüência compartimentada no modelo de tecido cerebral do tipo 3D (A) compartimentos: Andaime. Compartimento corpo de células Red, Blue-compartimento axonal. (B) padrão de crescimento neuronal no dia 1 após a semeadura antes incorporação de colágeno. (C). Crescimento neuronal no dia 7 após a sementeira no compartimento do corpo da célula. (D) excrescência Neuronal no dia 7 após a semeadura no compartimento axonal. Green -. ΒIIITubulin Por favor clique aqui para ver uma versão maior destafigura.

Figura 4. Rendimento esperado de (A) RNA e DNA, e proteínas (B) por construção em relação à quantidade de células semeadas por andaime (± SD, n = 5). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Na2CO3	Sigma-Aldrich	223530
LiBr	Sigma-Aldrich	213225
MWCO 3500 dialysis cassettes	Thermo Fisher	66110
Heating plate	Fisher Scientific	Isotemp
Centrifuge 5804 R	Eppendorf
Sieve	Fisher Scientific		No. 270, No. 35, No. 30
PTFE mold			made in house (Figure 1) 10 cm diameter, 2 cm height
NaCl	Sigma-Aldrich	71382
Biopsy Punch 5 mm	World Precision Instrument	501909
Biopsy Punch 2 mm	World Precision Instrument	501908
poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407-5MG	final concentration 10 μg/ml, dissolved in water
PBS	Sigma-Aldrich	D1283-500ML
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4049-500ML
DNase	Roche	10104159001	final concentration 0.3%
Soybean protein	Sigma-Aldrich	T6522-100MG	final concentration 1 mg/ml
Neurobasal medium	Gibco	21103049	warm up to 37 °C before use
B27 supplement 50x	Gibco	17504-044
Glutamax	Gibco	35050-061
Penicilin Streptomycin	Corning	30-002-CI
Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	final concentration 3 mg/ml
NaOH	Sigma-Aldrich	S2770	corrosive
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170-10MG	toxic
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378-5G
Olympus MVX10	Olympus
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	toxic, final concentration 4%
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-10G
anti-βIIITubulin antibody	Sigma-Aldrich	T2200	rabbit 1:500
anti-rabbit Alexa-546	Molecular Probes	A11010	goat 1:250
goat serum	Sigma-Aldrich	G9023-5ML
Leica SP2 confocal microscope	Leica		objective 20X
QIAshredder	Qiagen	79654
AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit	Qiagen	80004
Ethyl alcohol, Pure	Sigma-Aldrich	E7023
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	63689
NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific
BCA protein assay	Thermo Scientific	23225
Plate reader Spectramax M2	Molecular Devices		absorbance 562 nm
Micro Scissors, Economy, Vannas-type	TedPella	1346