Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Microfluidic genipin Deposition Teknik for Extended Culture of mikromønstrede Vaskulære Muskuløse Thin Films

Published: June 26, 2015 doi: 10.3791/52971
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota

Introduction

Vaskulære sygdomme, såsom cerebral vasospasme 1,2, hypertension 3, og atherosklerose 4, udvikler sig langsomt, er typisk kronisk karakter og involverer dysfunktionel kraft generation af vaskulære glatte muskelceller (VSMC). Vi sigter mod at studere disse langsomt fremadskridende vaskulære dysfunktioner anvender in vitro-metoder med finere kontrol af eksperimentelle betingelser end i in vivo modeller. Vi har tidligere udviklet vaskulære muskulære tynde film (vMTFs) til måling funktionel kontraktilitet af in vitro-manipuleret kardiovaskulære væv 5, men denne metode har været begrænset til relativt kortvarige studier. Her præsenterer vi et substrat modifikation teknik, der udvider vores tidligere vMTF teknik til langsigtede målinger.

Mens endotel er også kritisk i den samlede vaskulær funktion, manipuleret arteriel lameller giver en nyttig model system til at vurdere ændringer i vaskulærkontraktilitet under sygdomsprogression. At konstruere et funktionelt vaskulær sygdom vævsmodellen, både struktur og funktion af den arterielle lameller, den grundlæggende kontraktile enhed af fartøjet skal gengivet med high fidelity. Arteriel lamellerne er koncentriske, periferisk-aligned plader af kontraktile VSMC adskilt af plader af elastin 6. Microcontact trykning af ekstracellulær matrix (ECM) proteiner på polydimethylsiloxan (PDMS) substrater har tidligere været brugt til at give vejledning stikord til væv organisation at efterligne justeret kardiovaskulære væv 5,7-10. Men væv mønstrede hjælp microcontact udskrivning kan miste integriteten efter 3-4 dage i kultur, hvilket begrænser deres anvendelighed i kroniske studier. Denne protokol giver en løsning på dette problem ved at erstatte tidligere mikrokontakt trykteknikker med en ny microfluidic deposition teknik.

Genchi et al. Modificerede PDMS substrater med genipin og found langvarig levedygtighed myocytter op til en måned i kultur 11. Her bruger vi en lignende fremgangsmåde til at udvide kultur mønstrede vaskulære glatte muskelceller på PDMS. Genipin, en naturlig hydrolytisk derivat af gardenia frugt, er en ønskelig kandidat til substrat modifikation på grund af sin relativt lave toksicitet sammenlignet med lignende tværbindingsmidler og dens stigende anvendelse som et biomateriale på områderne vævsreparation 12,13 og ECM modifikation 14, 15.. I denne protokol, er fibronektin anvendes som en celle vejledning cue, som i tidligere mikrokontakt trykmetoder; imidlertid genipin afsat på PDMS substrater forud for fibronectin mønsterdannelse. Således som celler nedbryder den mønstrede matrix, kan nysyntetiserede ECM fra vedhæftede VSMC binde til genipin-coatede PDMS substrat.

Denne protokol udnytter en mikrofluid afgivelsesindretning til to-trins genipin og ECM deposition. Udformningen af ​​mikrofluidapparatet efterligner microcoNTACT trykning mønstre anvendes til manipuleret arteriel lameller i tidligere undersøgelser 16. Således forventer vi denne protokol til at give arteriel lameller efterligner, der med held rekapitulere højt justeret in vivo struktur og kontraktile funktion af arteriel lameller. Vi evaluerer også væv kontraktilitet at bekræfte, at genipin er et egnet substrat modifikation sammensatte for langsigtet in vitro vaskulære sygdomsmodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Målet med denne protokol er at konstruere og udnytte en vaskulær muskuløs tynd film (vMTF) med strukturen vist i figur 1 for at vurdere kontraktilitet under langvarig kultur af vaskulære glatte muskelceller (VSMC) på PDMS substrater. For at forlænge VSMC levedygtighed udnytter vi tværbinderen sammensatte genipin. De substrater for disse vMTFs er designet til at analysere væv kontraktilitet som er udviklet af Grosberg et al. 8 Andre vMTF metoder 5 maj også anvendes, med subtile ændringer i den præsenterede substrat fabrikation protokol.

1. Substrat Fabrication

  1. Coverslip Rengøring
    1. Placer 25 mm diameter dækglas i et dækglas farvning rack. Sæt risten i et stort bægerglas eller container (f.eks, en tom 100 -. 1.000 pi pipettespids container).
    2. Tilføje 70% ethanol til beholderen til fuldt ud at fordybe dækglassene. Sonikeres dem i mindst 30 min. </ Li>
    3. Fjerne dækglasset rille fra ethanolopløsning. Lad dækglas lufttørre ved at hænge stativet i en steril kultur hætte (for at forhindre partikel ophobning på dækglas) for 1- 2 timer.
      Bemærk: Dækglassene skal være helt tør før følgende trin.
  2. Poly (N-iso-propylacrylamid) (PIPAAm) Strip Isolation på dækglas
    1. Med tape, tape off siderne af en renset dækglas, hvilket efterlader en blotlagt strimmel centreret på dækglas (figur 1A). Ændre bredden på denne udsatte strimmel er baseret på anvendelse og / eller mikrofluid design.
    2. Mark kanterne af tape strimler på dækglasset ved anvendelse af en lab markør til senere brug (figur 1A).
    3. Skær langs kanten af dækglasset for at frigøre fra fadet (figur 1A, stiplet rød linje).
  3. Poly (N-iso-propylacrylamid) (PIPAAm) Coating
    1. Ved hjælp af en analytisk balance, vejer 1 g PIPAAm pulver. Brug ikke upolymeriserede N-iso-propylacrylamid, som er kræftfremkaldende.
    2. Overfør PIPAAm til et 50 ml centrifugerør. Der tilsættes 10 ml 1-butanol i en kemisk hætte til opnåelse af en 10% vægt / volumen opløsning. FORSIGTIG: flammepunkt 1-butanol er 37 ° C. Opbevar resulterende opløsning i en brændbar kabinet og undgå opvarmning.
    3. Tillad PIPAAm at opløse i 10 minutter. Hvis pulver er stadig synlige, blande opløsningen under anvendelse af en vortex-mixer, indtil alt pulveret er opløst.
      Bemærk: Følgende trin kræver brug af et spin coater. For hvert dækglas:
    4. Placer tapede dækglas på spin coater borepatron med pincet.
    5. Overføre 150 pi PIPAAm opløsningen på dækglasset ved at placere små dråber langs den udsatte glas i midten af ​​dækglasset. Sikre fuldstændig dækning af det udsatte område.
    6. Spin coat PIPAAm anvendelse af følgende opskrift:
      1. Rampe 10 sek til 3000 rpm. Bo i 5 sek.
      2. Rampe 10 sek til 6,000 rpm. Dvæle 60 sek.
      3. Rampe 10 sek til 3000 rpm. Bo i 5 sek.
    7. Placere dækglasset i en dækket petriskål med PIPAAm opad. Lad det lufttørre i mindst 15 min.
    8. Fjern forsigtigt klæbebånd fra alle dækglas og efterlod fuld dækglasset eksponeret, med et tyndt lag af PIPAAm belægning i et center strimmel.
  4. PDMS Coating
    1. Bland og afgasses 15 g PDMS i en 10: 1 basen: tværbinder ratio. Tilføje 7 - 8 dråber sonikerede 0,2 um fluorescerende mikroperler før blanding. Dæk kop PDMS med aluminiumsfolie, når den ikke er i brug for at forhindre støv og andre partikler i at forurene de PDMS.
      Bemærk: Følgende trin kræver brug af et spin coater. For hvert dækglas:
    2. Placer en PIPAAm-belagt dækglas på spin coater borepatron med pincet.
    3. Overførsel PDMS på dækglasset, der dækker mindst en tredjedel af dækglasset området.
    4. Spin pels ved hjælp af følgende Recipe:
      1. Rampe 5 sek til 500 rpm. Bo 5 sek.
      2. Rampe 5 sek til 1000 rpm. Bo 5 sek.
      3. Rampe 10 sek til 3000 rpm. Bo 10 sek.
      4. Rampe 10 sek til 4000 rpm. Dwell 60 sek.
      5. Rampe 10 sek til 2.000 rpm. Bo 15 sek.
      6. Rampe 10 sek til 1000 rpm. Bo 10 sek.
      7. Rampe 5 sek til 500 rpm. Bo 5 sek.
    5. Placere dækglasset i en dækket petriskål med PDMS opad. Registrere det tidspunkt, hvor dækglasset var spin-coated. Holde styr på den tid, der er forbundet med hver dækglas under hele forsøget til senere anvendelse ved bestemmelse af PDMS substrat tykkelse.
    6. Anbring petriskål indeholdende dækglassene i en 90 ° C varm ovn i mindst 1,5 time for at sikre korrekt PDMS hærdning. Hvis en ovn ikke er tilgængelig, lad dækglassene hærde i mindst 48 timer ved stuetemperatur.
    7. Fjern dækglas fra ovnen og gemme dem i et mørkt skuffe indtil den er klar til brug.
    8. Braklægning hver fjerde dækglas feller senere måling af substratets tykkelse, som en funktion af spin-coating tid, med en profilometer.

2. Mikrofluid mønster for Engineering Væv

  1. Fabrikation af mikrofluidapparater
    1. Design af Tissue Mikrofluid fotomaske
      1. Brug en passende computerstøttet design program til at designe mikrofluide mønstre. For arteriel lameller bestående af humane navlestrengen arterie vaskulære glatte muskelceller, bruge et skiftende mønster af 10 um kanaler med 10 um vægge.
      2. Anvende binær kanal forgrening om muligt 17, men andre branching motiver kan anvendes. Reducer bredden og længden af kanaler for hver forgrening iteration indtil nå det ønskede væv mønster afstand (vægge og kanaler, figur 1B).
      3. Design enheden at have en enkelt indgang til overfladebehandling løsning placering og et enkelt udløb for anvendelse af vakuum.
      4. Fabricate en fotomaske indeholdende mikrofluid design (er), som tidligere beskrevet 18.
    2. Fotolitografisk Wafer Fabrication
      Bemærk: Udfør fotolitografi i en egnet renrum eller lignende anlæg. At gøre silicium wafers med mønstre for blød litografisk fremstilling af væv mikrofluidenheder (~ 20-25 um kanal højde) ved anvendelse af fotolitografi:
      1. Rense en siliciumskive i acetone, methanol og isopropylalkohol i 1 min hver. Tør wafer med en nitrogen pistol.
      2. Prebake- skiven på en varmeplade i 5 minutter ved 115 ° C for at fjerne overskydende fugt.
      3. Spin belægge waferen med SU-8 3025 fotoresist anvendelse af den følgende opskrift til opnåelse indeholder 20-25 um i højden:
        1. Rampe 5 sek til 500 rpm. Bo 5 sek.
        2. Rampe 15 sek til 4000 rpm. Bo 15 sek.
      4. Blød bage skiven på en varm plade ved 95 ° C i 15 min.
      5. Læg en fotomaske, og udsætte tHan skive til 16 sek ved hjælp af et vakuum kontakt program på en kontakt maske aligner.
      6. Hårdt bage skiven på en varm plade ved 95 ° C i 4 min.
      7. Udvikle wafer i 6 min i udvikler. Derefter vaskes waferen to gange i 2 sek i frisk udvikler og skyl waferen med isopropylalkohol.
      8. Silanate den mønstrede wafer O / N ved at placere 2 - 3 dråber tridecafluoro-trichlorsilan i en tom skål i et vakuumtørreskab. Prop wafer op ved hjælp petriskåle så både bunden og toppen af ​​vaflen er udsat for.
        ADVARSEL: Tridecafluro-trichlorsilan er en brændbar og ætsende væske. Korrekt personlige værnemidler og punktudsugning er nødvendig til brug.
    3. Tissue mikrovæskeanordning Fabrication
      1. Placer en Silaneret, mønstrede wafer feature-side op i en petriskål.
      2. Bland og afgasses 100 g PDMS med en 10: 1 basen: tværbinder ratio. Hæld PDMS i fadet, fuldstændigt og jævnt dækker skiven.
      3. Placer fadet i vakuum, indtil alle luftbobler er fjernet fra de uhærdede PDMS, ca 30 min. Helbrede PDMS i skålen ved 90 ° C i mindst 1,5 time. Tid og temperatur kan justeres som dikteret af fremstilling retningslinjer for at opnå en fuldstændig helbredelse.
      4. Når PDMS er hærdet, skæres ud PDMS omkring skiven med et barberblad og omhyggeligt frigive PDMS-dækket wafer fra skålen. Fjerne overskydende PDMS nedenunder wafer og langsomt trække PDMS væk fra toppen af ​​skiven.
      5. Placer PDMS disk feature-side op i en ren skål og gemme wafer væk fra lys efter brug.
      6. Skær væk de overskydende PDMS fra omkring mønstre ved hjælp af et barberblad. Cut enheder i rektangulære former (figur 1C) for at lette afskalning af enhed fra substrater i senere trin. Præcise snit er ikke nødvendige, så længe der eksisterer rigelig plads til fjorden, udløb, og vævet mønster område (figur 1C).
      7. Punchindløbs- og ud- huller (Figur 1C) ved hjælp af en 1 mm kirurgisk biopsi punch.
  2. Mikrovæskeanordning Deposition
    Bemærk: I denne protokol, der mikrofluid levering bruges til at deponere mønstrede genipin, nøglen tværbindingsmidlet for langsigtet væv dyrkning, samt fibronectin. Trin før penicillin / streptomycin sterilisering (2.2.3) ikke behøver at finde sted i sterile forhold, men at begrænse forureningen og støvopsamling opfordres hele protokollen. Alle trin opstår efter dækglas sterilisering med penicillin / streptomycin (2.2.3) bør udnytte steril teknik. Bemærk: Denne del af protokollen skal startes en dag før celle såning.
    1. Substrat og mikrovæskeanordning Fremstilling
      1. Sonikeres de mikrofluidapparater i 70% ethanol i mindst 30 min.
      2. Tør sonikerede mikrofluidenheder hjælp af trykluft eller nitrogen, og placere dem i en petriskål with kanal har forsiden opad for at forhindre unødigt slid på funktioner.
      3. Placere op til 10 vMTF substrat dækglas i en UVO renere (dæksel fjernet på fad, så overfladen er funktionaliserede) i 8 min.
      4. Fjern UVO-behandlede dækglas, og placer mikrofluidenheder feature-side ned på hver slip én ad gangen (orientering bør svare til figur 1C). Tryk godt ned på enhederne for at sikre en tæt forsegling til PDMS-overtrukne dækglas.
    2. Aflejring af genipin og fibronectin
      1. Der fremstilles en 5 mg / ml genipin opløsning ved tilsætning af 1 ml sterilt Hedeselskabet 2 O til en 5 mg beholder med lyofiliseret genipin. Blande opløsningen under anvendelse af en vortex-blander. Braklægning ved stuetemperatur i mindst 30 min.
        Bemærk: Pulveret er vanskeligt at opløse ved stuetemperatur, så gentagne blanding i mindst et minut er ofte nødvendigt.
      2. Hurtigt, placere en dråbe af 70% ethanol ved indløbet til hver anordning til anordning priming. Bemærk: ethanol bør væge gennem enhederne.
      3. Efter 5 - 10 minutter, omhyggeligt aspirere overskydende ethanol ved indløbet, umiddelbart erstatte det med 1X phosphatpufret saltopløsning (PBS) ved indløbet. Fra dette punkt fremad, skal du ikke tillade indløb bliver helt tørt for at undgå introduktion af luft til enheden.
      4. Placer en vakuum aspiratorspids ved udløbet af hver enhed. Tegn 1X PBS gennem enheder at skylle ethanol væk. Efterlade en lille mængde 1X PBS ved indløbet. Bemærk: Hvis der indløb forekommer næsten tør, tilsættes mere 1X PBS.
      5. Aspirere overskydende 1X PBS, således at kun en lille mængde forbliver ved indløbet før påføring af genipin opløsning.
      6. Placer 60 pi af 5 mg / ml genipin opløsning ved hvert indløb (figur 1D). Tegn genipin opløsning gennem enhederne ved at placere en vakuum aspirator spids ved udløbet (figur 1D). Vær sikker på ikke at trække hele opløsningen igennem, efterlader en lille mængde af opløsning ved indløbet.
      7. Sted dråber (ca. skilling mellemstore) 1X PBS ved både indløb og udløb for at opretholde befugtning under inkubation. Flyt skål indeholdende enheder til en befugtet ovn eller inkubator (sterilt miljø er ikke nødvendigt) sat til 37 ° C, og der inkuberes i 4 timer. Skålen behøver ikke at være dækket.
      8. Under inkubation resuspender fibronectin til en koncentration på 50 ug / ml i sterilt Hedeselskabet 2 O på is i mindst 30 minutter før påføring på mikrofluidapparatet.
      9. Efter inkubationen af ​​genipin, suge alle resterende 1X PBS ved enheden forretninger. Fortsat anvende et vakuum aspirator på hver enhed stikkontakt, trækker gennem de resterende 1X PBS ved indløbet.
      10. Placer 100 pi 50 pg / ml fibronectin opløsning ved hvert indløb, tilsætning til en minimal mængde resterende 1X PBS ved indløbet (figur 1D).
      11. Tegn fibronectin opløsningen gennem enheder ved hjælp af et vakuum aspiratorspids ved udløbet (
      12. Flyt udækket skål indeholdende enhederne til en ovn eller inkubator indstillet til 37 ° C, og der inkuberes i 24 timer. Bemærk: fibronectin trin kræver ikke befugtning af indløbet og udløbet med 1X PBS. Den resterende pulje af fibronectin ved indløbet vil udtørre. Dette forventes.
    3. Sterilisering og Forberedelse til Cell Seeding
      1. Forbered en opløsning af penicillin / streptomycin til sterilisering af mønstrede vMTF dækglas. Der tilsættes 5 ml penicillin / streptomycin (10.000 enheder / ml; 10.000 ug / ml) til 500 ml sterilt 1X PBS.
      2. Placer skål indeholdende enhederne i en steril biosikkerhed hætte.
      3. Fjern forsigtigt enheder fra dækglassene ved langsomt skrælle enheden ved et hjørne, mens let fat dækglasset i modsatte hånd.Bemærk: Dette trin kræver øvelse at reducere dækglas skader i fjernelsen. Et alternativ er at bruge en sprøjte til at injicere 1X PBS ved indløbet og / eller udløbet til støtte i enheden frigivelse.
      4. Placer dækglassene i sterile seks brønde. Tilsæt mindst 5 ml penicillin / streptomycin-opløsning til hver brønd. Placer retter i en steril inkubator ved 37 ° C i mindst 30 minutter.
      5. Efter sterilisering opsug penicillin / streptomycin løsning, og frø dækglassene med dyrkede humane umbilical arterie vaskulær glat muskulatur cells19 (figur 1D). Koncentrationen af podning for VSMC'er er ~ 80.000 celler pr cm2. For at reducere antallet af celler, der er nødvendige for hver prøve, anvendes en reducering til at formindske seeding område. Et eksempel på en reducering er snittet toppen af ​​en 15 ml konisk rør fastgjort til dækglasset med sterilt vakuum fedt før podning.
      6. Inkubér podede dækglas i en steril inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 (figur 2A-B).
    4. Langsigtet vMTF Tissue Culture
      1. En dag efter såning, fjerne cellemediet og reduktionsgear. Skyl vævet med 1X PBS. Tilsæt 4 ml serumfrit cellemedium at inducere en kontraktile fænotype i VSMC 20.
      2. Gentag 1X PBS skylning og tilsætning af frisk serumfrit medium hver anden dag som ønsket for langtidsdyrkning.

Figur 1
Figur 1. Mikrofluid Protein Delivery Device. (A) Tapede off dækglas for PIPAAm belægning. Røde stiplede cirkel: opskæring vej til at frigive dækglas (B) Repræsentant AutoCAD tegning af væv mikrofluid maske mønster.. Indsat: Detalje af binær forgrening til ALTERNating 10 um x 10 um væv mønster. (C) Placering af mikrofluid enhed på et dækglas substrat med ind- og udløb er angivet. (D) Skematisk af mikrofluid protein mønster og levering. Venstre mod højre: scanning elektronmikroskop billede af mikrofluidkanaler (skala bar: 50 pm); Detaljeret skematisk af metode for protein deposition; Immunohistokemi farvede fibronektin (skala bar: 50 pm); Cellepodning med vaskulære glatte muskelceller. (E) Skematisk af fabrikeret væv. 1. indsatte: Detalje af lagdelte konstruktion. 2. Indsat: Detalje af genipin modifikation af PDMS substrat efter mikrofluid deposition. © IOP Publishing. Reproduceres og / eller modificeres med tilladelse. Alle rettigheder forbeholdes. 19 Klik her for at se en større version af dette tal.

3. Tissue Function Analysis med vMTF Kontraktilitet Assay

Bemærk: MTF kontraktilitet analysen præsenteres her er modelleret efter den teknik udviklet i Grosberg et al 8.

  1. vMTF Kontraktilitet Experiment
    1. Placer en vævsprøve i en 100 mm skål. Tilføj steril 1X Tyrodes solution8 ved pH 7,4 opvarmet til 37 ° C for at dække prøven.
    2. Bruge et barberblad til at foretage flere parallelle snit vinkelret på PIPAAm kant. Foretage nedskæringer på en måde, der giver bredere vævssnit, der vil være den vMTFs (med bredde ~ 2 mm) vekslende med tynde strimler (figur 3A, side cuts). At gøre rene snit, placere et barberblad i kontakt med prøven og fast træk til siden.
    3. Dreje skålen 90 ° og lave to lige, parallelle snit i midten af vævet, parallelt med striben af PIPAAm (figur 3A, endeudskæringer). Fjern og bortskaf den løse strimmel af væv mellem disse cuts og de tynde strimler i mellem vMTFs (skåret i det forrige trin) for at forhindre tilstødende film fra at kontakt.
    4. Lad prøven hvile ved stuetemperatur i 10 minutter, eller indtil al PIPAAm er opløst. Bemærk: Hvis PIPAAm forbliver i fremtidige skridt kan prøve returneres til skæring parabol at opløse resterende PIPAAm. En forsigtig skrabning af undersiden af ​​vMTF kan støtte i PIPAAm fjernelse, efter behov.
    5. Placere en lille prik af vakuum fedt i et rent 35 mm petriskål. Der tilsættes 5 ml frisk steril 1X Tyrode-opløsning ved 37 ° C. Overfør dækglasset med afskårne film fra 100 mm skål til 35 mm skål, og tryk på vakuum fedt at forhindre bevægelse af dækglasset.
    6. Placer fadet i en temperatur-kontrolleret platform på stereomikroskop scenen.
    7. Capture time-lapse sendes og fluorescerende lys billeder på ønskede intervaller (f.eks., 30 sek) under hele behandlingen assay.
    8. Serielt behandle vMTFs med 50 nM endotelin-1 i 20 min (induceret kontraktion) og 100 uM HA-1077 i 30 minutter (tissue afslapning). Tilføj koncentrerede opløsninger af hver behandling til den eksperimentelle skål indeholdende 5 ml steril 1X Tyrodes opløsning på bestemte tidspunkter, hvilket gav den ønskede koncentration behandling i 5 ml volumen. Foretag behandling Tilgang i intervallet mellem time-lapse billede opkøb for at undgå at fange pipette i billeder.
  2. vMTF Kontraktilitet Analysis
    1. Ved hjælp af dækglas afsat i 1.4.8, måle PDMS substrattykkelse med en profilometer21. Opret en tykkelse vs. spin-tidskurve for hvert sæt af dækglas. Brug denne kurve til at estimere vMTF tykkelse for hvert dækglas anvendes i et kontraktilitet eksperiment.
    2. Måle vMTF projection længder for hvert tidspunkt under forsøget, og beregne den tilknyttede krumningsradierne (figur 3B) under anvendelse af tidligere rapporterede fremgangsmåder 8.
    3. Beregn vMTF stress på hver gang point bruge tidligere vMTF metoder 5.
      Bemærk: Brug den anslåede vMTF tykkelse beregnet ud fra 3.2.1. Mål VSMC tykkelse ved hjælp af konfokale billeder, som tidligere rapporteret 9. Anskaf PDMS Youngs modul fra selskab datablade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det primære mål med dette arbejde var at udvide levedygtighed mikromønstrede VSMC på hydrofobe PDMS substrater. Dette blev opnået ved at inkorporere en mikrofluid leveringssystem til at deponere mønstrede genipin og fibronectin på PDMS (figur 1). Aflejring af ECM-proteiner under anvendelse af mikrofluid levering gav high fidelity overførsel af kanalen mønster med nøgne PDMS mellem linjer af genipin og fibronectin (figur 1D). De vedhæftede celler (figur 1E) formular konfluerende monolag efterligner in vivo struktur arteriel lameller (figur 2), svarende til forrige mikrokontakt trykmetoder 5,10,16. Disse væv gav responsive, kontraktile konstruktioner, hvis stress blev målt under anvendelse vMTF teknologi (figur 3).

Kvalitativ vurdering af væv levedygtighed i løbet af to uger viste minimal forringelse på genipin-modified substrater (figur 2A). Tissue sammenløb og tilpasning blev opretholdt over to uger (Figur 2B, 2C og 2D). To centrale stress-værdier blev beregnet for hver vMTF:. 1) basal tone og 2) inducerede kontraktilitet (figur 3C og 3D) Basal tone er stress vedligeholdes af ustimulerede VSMC ved ligevægt. Induceret kontraktilitet er den yderligere stress induceret ved stimulering med endothelin-1. Både basal tone og induceret kontraktilitet viste konsekvent opførsel over to-ugers tidsforløb, demonstrerer vasoaktive væv i hele (figur 3E og 3F). Den lille fald i væv kontraktilitet ved afslutningen af assayet er det direkte resultat af det reducerede antal celler der udgør vævet, idet serum-udsultede VSMC ikke prolifererer 19. Tilsætningen af ​​et minimalt basalt niveau af serum til dyrkningsmedium kan afhjælpe dette resultat i det fremtidige arbejde.

Figur 2. Væv forbliver levedygtige og held Mimic in vivo Arteriel lamelstruktur i to uger på genipin modificerede Substrater (A) Repræsentative fase kontrast billeder af væv ved aflivning tidspunkter i hele løbet af to uger (skala bar: 200 um).. (B) Repræsentative immunhistokemi billeder af væv fremstillet på genipin-modificerede substrater faste ved dag 1, dag 4, og dag 10 efter serumudsultning (grøn: f-actin filamenter, blå: kerner (vist til at etablere tilstedeværelse af celler), skala bar .: 100 um) (C) Procent sammenløb målt ved f-actin dækning (fejlsøjler: standardfejl, n = 3-7) (D) Tissue tilpasning målt ved f-actin orientering orden parameter (OOP) 22 (fejlsøjler. : standardfejl, n = 3-7). © IOP Publishing. Reproduceres og / eller modificeres med tilladelse. Alle rettigheder forbeholdes. Alle rettigheder forbeholdes. 19 Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Tissue Kontraktilitet opretholdes I løbet af to uger. (A) Repræsentant vMTF skæring ordningen. (B) Skematisk af cut vMTF. Efter afkøling under 32 ° C, PIPAAm opløses og frigiver vMTF. Stress i den aktive celle lag forårsager passive PDMS lag til at bøje. Måling af fremspring længde kan omdannes til en krumningsradius ifølge fremgangsmåder i Grosberg et al. 8 krumningsradius er anvendt til at beregne den gennemsnitlige tværsnit stress i vævet. (C) Sequential transmitteret light billeder af repræsentative kontraktilitet assay (skala bar: 1 mm). Væv nå ligevægt, stimuleres med endothelin-1, derefter behandlet med HA-1077 for at tillade fuldstændig afslapning. Nederst:. Skematisk af sidebillede af idealiserede væv i løbet af assayet (D) Repræsentativ stress kurve for kontraktilitet assay. To centrale stress værdier beregnes. Basal tone er forskellen mellem den ligevægt stress tilstand og den afslappede stress tilstand. Induceret kontraktilitet er ændringen i stress fra ligevægtstilstanden til endothelin-1 stimuleret tilstand (E) Basal tone (error bars: standardfejlen, n = 5 - 12) (F) Induceret kontraktilitet (error bars:.. Standardfejl, n = 5 - 12). © IOP Publishing. Reproduceres og / eller modificeres med tilladelse. Alle rettigheder forbeholdes. 19 Klik her for at se en større version afdette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her præsenterer vi en protokol, der bygger på tidligere udviklet vMTF teknologi, der giver udvidede eksperiment gange mere typisk for kroniske karsygdom veje 1,23,24. For at opnå dette, vi micropattern genipin, som tidligere er blevet vist at give langsigtet funktionalisering af PDMS substrater 11, under anvendelse af en mikrofluid deposition teknik til opnåelse manipuleret arteriel lameller med forbedret karvæv levedygtighed til brug i MTF kontraktilitet eksperimenter. McCain et al. udviklet en alternativ micromolded gelatine hydrogel substrat for udvidet kultur af industrielt hjertevæv i flere uger i et relateret MHF model 25.

Denne protokol gav vMTFs der med succes efterlignede arteriel lamel struktur (figur 2) og funktion (figur 3) i løbet af to uger. Mens en vellykket afslutning af præsenterede protokol giver de ønskede result af udvidede kultur tider for sygdomsfri relevant tidsforløb (f.eks de patologiske virkninger af cerebral vasospasme vedvarende i op til 14 dage 26), opstår nogle almindelige faldgruber. Gentagen brug af PDMS mikrofluidenheder resulterer i skadelig skader, som kan resultere i en delvis eller fuldstændig blokering af grene i enheden. Således skal nye enheder anvendes til hvert forsøg. Et andet problem, mens ikke så almindeligt, er uventet og inkonsekvent delaminering af væv. Disse hændelser syntes at være tilfældig karakter og sjældne i forekomst. Ved observation, væv danner en arch- eller lumen-lignende struktur, før delaminere. Vi observerede også denne adfærd i væv fremstillet ved hjælp af mikrokontakt trykteknikker. Således mener vi dette spørgsmål at være resultatet af enten over-seeding eller et fænotypisk skifte i de dyrkede VSMC der resulterer i unormal adfærd og ikke et direkte resultat af fabrikation metoder præsenteres her.

Den nuværende mikrofluiddesign ic kræver lineære strømningsmønstre og som sådan, er begrænset til væv med tilpasning på en enkelt hovedretning. Anvendelse til væv kræver mere komplekst mønster, såsom "mur" mønster af ventrikulær myocardial struktur 27, vil kræve mere udførlige mikrofluid design. Vi har ikke podet genipin-modificerede substrater med andre celletyper. Imidlertid Genchi et al. viste forlænget levedygtighed isotrop skeletmuskel på genipin-modificerede PDMS 11. Således føler vi overbeviste om, at et minimalt modificeret version af denne protokol har udbredt anvendelighed på andre organsystemer i den fremtidige udvikling af orgel-on-a-chip teknologi.

Beregningen stress for vMTFs baseret på tidligere metoder 8 er begrænset af den relative kontraktilitet i vævene og tilsvarende snitlængde af tynde film. Hvis skære for længe, ​​vil film krølle på sig selv. Hvis skåret for kort, vil film ikke værend. Begge tilfælde forhindrer korrekt analyse af kontraktile egenskaber på grund af modellere begrænsninger. Korrekt snitlængde skal raffineres gennem gentagne forsøg. Implementering af en laser gravering system som i Agarwal et al., Kan forbedre repeterbarhed og kvaliteten af MTF skære 28.

Evnen til bedre rekapitulere nativt væv struktur og funktion i en tæt kontrolleret, selvstændigt forsøgssystem er en central udøvelse inden for bioteknologi. Denne stræben har ført til udviklingen af flere in vitro væv efterligner og multi-funktionelle og alligevel forenklede model organer-on-a-chip, fremme forståelsen af grundlæggende fysiologiske og patologiske adfærd af organsystemer 29,30. Anvendelse af aflejring af genipin onto PDMS substrater, har vi vist udvidet cellelevedygtighed og vedligeholdelse af vaskulær glat muskulatur funktion over to uger. Dette er en væsentlig forbedring i forhold til tidligere fabrikation techniques, som kan føre til delaminering af væv og celledød efter 4-7 dage i kultur 19, og kan hjælpe udviklingen af mere robuste arterie-on-a-chip metoder. På grund af den kroniske karakter af de fleste vaskulære sygdomme, dette forskud danner rammen for en række fremtidige undersøgelser af kontraktile mekanismer involveret i specifikke vaskulære patologier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslip staining rack Electron Microscopy Sciences www.emsdiasum.com/ 72239-04
Microscope cover glass - 25 mm Fisher Scientific, Inc. www.fishersci.com 12-545-102
Poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) Polysciences, Inc. www.polysciences.com/ #21458
1-butanol Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com 360465
Spincoater Specialty Coating Systems, Inc. www.scscoatings.com
Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives (Dow Corning) www.ellsworth.com 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Fluorescent microbeads Polysciences, Inc. www.polysciences.com/ 17151
Silicon wafers Wafer World, Inc. www.waferworld.com 2398
Photoresist  MicroChem Corp. www.microchem.com
Contact mask aligner Suss MicroTec www.suss.com
Developer MicroChem Corp. www.microchem.com
Tridecafluro-trichlorosilane UCT Specialties, Inc. www.unitedchem.com T2492
Surgical biopsy punch Integra LifeSciences Corp. www.miltex.com 33-31AA-P/25
Genipin Cayman Chemical www.caymanchem.com 10010622
1X phosphate buffered saline Mediatech, Inc. www.cellgro.com 21-031-CV
Fibronectin Corning, Inc. www.corning.com 356008
Penicillin/streptomycin Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com 15140-122
Umbillical artery smooth muscle cells Lonza www.lonza.com CC-2579
Tyrode's solution components Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com various
Stereomicroscope Zeiss www.zeiss.com 4350020000000000
Temperature-controlled platform Warner Instruments www.warneronline.com 641659; 640352; 641922
Endothelin-1 Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com E7764-50UG
HA-1077 Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com H139-10MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Humphrey, J. D., Baek, S., Niklason, L. E. Biochemomechanics of cerebral vasospasm and its resolution: I. A new hypothesis and theoretical framework. Ann. Biomed. Eng. 35, 1485-1497 (2007).
  2. Hald, E. S., Alford, P. W. Smooth muscle phenotype switching in blast traumatic brain injury-induced cerebral vasospasm. Transl. Stroke Res. 5, 385-393 (2014).
  3. Olivetti, G., Anversa, P., Melissari, M., Loud, A. V. Morphometry of medial hypertrophy in the rat thoracic aorta. Lab. Invest. 42, 559-565 (1980).
  4. , Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
  5. Alford, P. W., Feinberg, A. W., Sheehy, S. P., Parker, K. K. Biohybrid thin films for measuring contractility in engineered cardiovascular muscle. Biomaterials. 31, 3613-3621 (2010).
  6. Rhodin, J. A. G. Architecture of the vessel wall. Physiol. Rev. ed, B. erne,R. ., , American Physiology Society. (1979).
  7. Balachandran, K., et al. Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 19943-19948 (2011).
  8. Grosberg, A., Alford, P. W., McCain, M. L., Parker, K. K. Ensembles of engineered cardiac tissues for physiological and pharmacological study: heart on a chip. 11, 4165-4173 (2011).
  9. Alford, P. W., Nesmith, A. P., Seywerd, J. N., Grosberg, A., Parker, K. K. Vascular smooth muscle contractility depends on cell shape. Integr. Biol. (Camb). 3, 1063-1070 (2011).
  10. Win, Z., et al. Smooth muscle architecture within cell-dense vascular tissues influences functional contractility). Integr. Biol. (Camb). , (2014).
  11. Genchi, G. G., et al. Bio/non-bio interfaces: a straightforward method for obtaining long term PDMS/muscle cell biohybrid constructs). Colloid Surface B. 105, 144-151 (2013).
  12. Fessel, G., Cadby, J., Wunderli, S., van Weeren, R., Snedeker, J. G. Dose- and time-dependent effects of genipin crosslinking on cell viability and tissue mechanics - Toward clinical application for tendon repair. Acta Biomater. , (2013).
  13. Lima, E. G., et al. Genipin enhances the mechanical properties of tissue-engineered cartilage and protects against inflammatory degradation when used as a medium supplement. J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 692-700 (2009).
  14. Madhavan, K., Belchenko, D., Tan, W. Roles of genipin crosslinking and biomolecule conditioning in collagen-based biopolymer: Potential for vascular media regeneration. J. Biomed. Mater. Res. A. , (2011).
  15. Satyam, A., Subramanian, G. S., Raghunath, M., Pandit, A., Zeugolis, D. I. In vitro evaluation of Ficoll-enriched and genipin-stabilised collagen scaffolds. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2012).
  16. Alford, P. W., et al. Blast-induced phenotypic switching in cerebral vasospasm. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 12705-12710 (2011).
  17. Song, H., Tice, J. D., Ismagilov, R. F. A microfluidic system for controlling reaction networks in time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 42, 768-772 (2003).
  18. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  19. Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, J. A., Win, Z., Alford, P. W. Long-term vascular contractility assay using genipin-modified muscular thin films. Biofabrication. 6, 045005 (2014).
  20. Han, M., Wen, J. K., Zheng, B., Cheng, Y., Zhang, C. Serum deprivation results in redifferentiation of human umbilical vascular smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C50-C58 (2006).
  21. Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
  22. Volfson, D., Cookson, S., Hasty, J., Tsimring, L. S. Biomechanical ordering of dense cell populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 15346-15351 (2008).
  23. Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: roles of apoptosis, inflammation, and fibrosis. Hypertension. 38, 581-587 (2001).
  24. Kayembe, K. N., Sasahara, M., Hazama, F. Cerebral aneurysms and variations in the circle of Willis. Stroke. 15, 846-850 (1984).
  25. McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues. Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).
  26. Weir, B., Grace, M., Hansen, J., Rothberg, C. Time course of vasospasm in man. 48, 173-178 (1978).
  27. McCain, M. L., Sheehy, S. P., Grosberg, A., Goss, J. A., Parker, K. K. Recapitulating maladaptive, multiscale remodeling of failing myocardium on a chip. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9770-9775 (2013).
  28. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab. Chip. 13, 3599-3608 (2013).
  29. Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab. Chip. 12, 2156-2164 (2012).
  30. Meer, A. D., van den Berg, A. Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse. Integr. Biol. (Camb). 4, 461-470 (2012).

Tags

Bioengineering substrat modifikation mikrofluidik protein deposition vaskulære glatte muskelceller cellelevedygtighed polydimethylsiloxan genipin arteriel vævsmanipulering mekaniske egenskaber,
Microfluidic genipin Deposition Teknik for Extended Culture of mikromønstrede Vaskulære Muskuløse Thin Films
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, … More

Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, J. A., Win, Z., Alford, P. W. Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films. J. Vis. Exp. (100), e52971, doi:10.3791/52971 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter