هنا يرد بروتوكول لقياس التقاط البكتيريا عن طريق خلايا CD4 + T التي تحدث أثناء تقديم المستضد عبر transinfection من الخلايا الجذعية المصابة مسبقا (DC). وتبين لنا كيفية تنفيذ الخطوات الضرورية: عزل الخلايا الأولية، وإصابة DC، DC / T تشكيل المترافقة الخلية، وقياس البكتيرية ترنسفكأيشن الخلايا التائية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
T خلايا التقاط البكتيريا التي كتبها Transinfection من الخلايا الجذعية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في الآونة الأخيرة ، أظهرنا ، على عكس ما هو موصوف ، أن خلايا CD4 + T ، نموذج الخلايا المناعية التكيفية ، تلتقط البكتيريا من الخلايا المتغصنة المصابة (DCs) من خلال عملية تسمى العدوى. هنا ، نصف تحليل عملية العدوى ، والتي تحدث أثناء عرض المستضد. تم الكشف عن هذه العملية باستخدام خلايا CD4 + T من الفئران المعدلة وراثيا OTII ، والتي تحمل مستقبلات الخلايا التائية (TCR) الخاصة بببتيد البيض (OVAp) ، والتي يمكن أن تشكل بالتالي مجمعات مناعية مستقرة مع الخلايا المتغصنة المصابة المحملة بهذا OVAp المحدد. يمكن مراقبة ديناميكيات البكتيريا التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) أثناء انتقال الخلايا التائية DC-T عن طريق تصوير الخلايا الحية ويمكن إجراء القياس الكمي للعدوى البكتيرية عن طريق قياس التدفق الخلوي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن قياس العدوى الانتقالية بطريقة أكثر حساسية تعتمد على استخدام الجنتاميسين ، وهو مضاد حيوي أمينوغليكوزيد غير منفذ يقتل البكتيريا خارج الخلية ولكن ليس البكتيريا داخل الخلايا. تم استخدام هذه الطريقة الكلاسيكية سابقا في علم الأحياء الدقيقة لدراسة كفاءة الالتهابات البكتيرية. نوضح بموجب هذا بروتوكول العملية الكاملة ، من عزل الخلايا الأولية إلى القياس الكمي للعدوى المعبرة.
المقدمة
عندما يصيب الممرض مضيفه، عادة ما يكون هناك تفعيل الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية، اللازمة لإزالة البكتيريا. المناعة الفطرية هي خط الدفاع الأول الذي يمنع معظم الالتهابات. المناعة الفطرية تميز في العناصر المحددة الطريقة التي يتم الحفاظ عليها في مجموعة واسعة من الكائنات الحية الدقيقة (أنماط الجزيئية المرتبطة الممرض، PAMPS) 1. آليات المناعة الفطرية وتشمل الحواجز المادية مثل الجلد، والحواجز المواد الكيميائية (الببتيدات المضادة للميكروبات، الليزوزيم) والكريات البيض الفطرية، والتي تشمل البالعات (الضامة، العدلات، والخلايا الجذعية)، الخلايا البدينة، الحمضات، الخلايا القاعدية، والخلايا القاتلة الطبيعية 2. هذه ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية قبل لجنة أخلاقيات البحوث في جامعة مدريد المستقلة وأجرى تحت إشراف جامعة مدريد المستقلة رئيس العام لرعاية صحة الحيوان وفقا للمبادئ التوجيهية الإسبانية والأوروبية. كانت ولدت الفئران في معين الممرض الحر (SPF) الإسكان، حيث الموت الرحيم كانت من قبل أفراد مدربين ومؤهلين باستخدام ثاني أكسيد الكربون (CO 2) طريقة الاستنشاق.
1. ماوس نخاع العظام المستمدة من البلدان النامية التمايز والعدوى
ملاحظة: يلخص الشكل 1 هذه الخطوة الأولى. ينبغي ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هنا وصفنا كيفية أداء الفئران خلايا T transinfection بكتيريا من نخاع العظم المصاب المستمدة من البلدان النامية وكيفية قياس transinfection بكتيريا عبر نهجين مختلفين: التدفق الخلوي والجنتاميسين بقاء فحص يلخص الشكل 1 الإجراء للحصول على الخلايا. يتم إنشاؤها من قبل البلدان النامية حضانة خلايا نخاع العظام مع GM-CSF لمدة 9 أيام. ثم، يتم maturated البلدان النامية مع LPS لزيادة MHCII على غشاء لتحميلها في وقت لاحق مع الببتيد محددة من OVA (OVAp.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
خلايا T أو T الليمفاوية هي نوع من كريات الدم البيضاء التي تلعب دورا محوريا في مناعة خلوية وتنتمي إلى الاستجابة المناعية التكيفية 26. خلايا T هي صهر لإصابتها في المختبر ولكن تشير بعض التقارير أنها يمكن أن تصاب في الجسم الحي 14،15. الاتصالات الحميمة من خلايا APC وT خلال المشبك المناعي بمثابة منابر لتبادل المواد البيولوجية 13، بما في ذلك بعض الفيروسات مثل فيروس نقص المناعة البشرية (11). وقد تبين مؤخرا أن يتعارض مع العقيدة،.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل بمنح BFU2011-29450 و BFU2008-04342 / BMC من وزارة العلوم والابتكار الإسبانية و PIES201020I046 من Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas (CSIC).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| RPMI | فيشر Scientific | SH3025501 | |
| r-GMCSF | Peprotech | 315-03 | |
| LPS | SIGMA | L2630-10mg | |
| Na Pyruvate | Thermo Scientific | SH3023901 | |
| 2-ME | Gibco | 31350-010 | |
| OVAp OTII (323 – 339) | مصفاة خلية GenScript | ||
| 70uM | BD | 352350 | |
| ؛ 30 ميكرومتر حقنة فيلكون معقمة | BD | 340598 | |
| أوتوماك كلاسيك | ميلتيني بيوتيك | 130-088-887 | |
| جنتاميسين | نورمون | 624601.6 | |
| ترانسويل | كوستار | 3415 | |
| رطل | بروناديسا | 1231 | |
| أجار | بروناديسا | 1800 | |
| بارافورمالديهايد 16٪ | علوم المجهر الإلكتروني | 15710 | |
| Triton X-100 | |||
| CD8 biot | BD Biosciences | 553029 | |
| IgM Biot | ImmunoStep | Clone RMM-1 | |
| B220 Biot | BD Biosciences | 553086 | |
| CD19 biot | BD Biosciences | 553784 | |
| MHC-II Biot (I-A / I-E) | BD Biosciences | 553622 | |
| CD11b biot | Immunostep | 11BB-01mg | |
| CD11c biot | Immunostep | 11CB3-01mg | |
| DX5 biot | BD Biosciences | 553856 | |
| Gr-1 biot | BD Biosciences | 553125 | |
| CD16 / CD32 | ImmunoStep | M16PU-05MG | |
| مضاد للسالمونيلا | ABD Serotec | 8209-4006 | |
| CD11cPE | BD Biosciences | 553802 | |
| CD4-APC | Tonbo Biosciences | 20-0041-U100 | |
| Gr-1 APC | BD Biosciences | 553129 | |
| MHC-II (I-A / I-E) FITC | BD Biosciences | 553623 | |
| Alexa-Fluor 647 الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) ، | Invitrogen | عالي الامتصاصA-21245 | |
| CMAC (7-أمينو-4-كلورو ميثيل كومارين) | تقنيات الحياة | C2110 | |
| BSA | SIGMA | A7030-100G | |
| Streptavidin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences |
المراجع
- Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449 (7164), 819-826 (2007).
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. , Garland Science. New York. (1989).
- Pancer, Z., Cooper, M. D.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
