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Medicine

द्वितीय -45 syngeneic चूहा Mesothelioma के मॉडल में ओर्थोटोपिक आरोपण और परिधीय इम्यून सेल निगरानी

doi: 10.3791/53019 Published: October 2, 2015

Summary

प्रतिरक्षा सक्षम चूहों के फुफ्फुस गुहा में द्वितीय -45 मेसोथेलियोमा कोशिकाओं का प्रत्यारोपण द्वारा फुफ्फुस घातक mesothelioma के एक ओर्थोटोपिक चूहे मॉडल की पीढ़ी के समक्ष प्रस्तुत किया है। एक प्रवाह cytometric विधि भी वर्णन किया गया है एक 25 μl रक्त के नमूने से इन जानवरों में सात प्रतिरक्षा सेल सबसेट का विश्लेषण करने के लिए।

Abstract

इस तरह के टीकों और प्रतिरक्षा जांच की चौकी निरोधक, और उपचार के जवाब में ट्यूमर microenvironment की भूमिका की वृद्धि की समझ के रूप में कैंसर के लिए प्रतिरक्षा आधारित उपचार के हित में भारी वृद्धि, सामूहिक रूप से पूर्व नैदानिक ​​परीक्षण के लिए प्रतिरक्षा सक्षम ओर्थोटोपिक मॉडल के लिए की आवश्यकता को इंगित इन नए उपचारों की। इस पत्र फुफ्फुस घातक mesothelioma के एक ओर्थोटोपिक प्रतिरक्षा सक्षम चूहे मॉडल स्थापित करने के लिए कैसे करें। ओर्थोटोपिक मॉडल में निगरानी रोग प्रगति ट्यूमर के आंतरिक स्थान से चकित है। अनुलंबीय रोग प्रगति और इस और कैंसर के अन्य चूहे मॉडल में प्रतिरक्षा कोशिकाओं घूम पर उसके प्रभाव पर नजर रखने के लिए, एक एकल ट्यूब केवल 25 μl पूरे रक्त वर्णन किया गया है की आवश्यकता होती है परख प्रवाह cytometry। कुल लिम्फोसाइटों, monocytes और न्यूट्रोफिल, साथ ही टी-सेल सबसेट CD4 और सीडी 8, बी कोशिकाओं और प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं: यह सटीक सात प्रतिरक्षा मापदंडों की मात्रा का ठहराव प्रदान करता है। विभिन्न बाद के चरणोंइन मानकों के टिकट मेसोथेलियोमा मॉडल में रोग प्रगति की निगरानी के लिए सबसे बड़ी उपयोगिता होने लिम्फोसाइट अनुपात को न्यूट्रोफिल के साथ, अलग अलग परिस्थितियों और मॉडलों में उपयोगी होते हैं। यह भी प्रतिरक्षा आधारित उपचार के लिए प्रतिक्रिया की निगरानी और उपचार की सफलता या विफलता के लिए अग्रणी अंतर्निहित तंत्र को समझने में सहायता कर सकते हैं इस एकल ट्यूब पद्धति का उपयोग करके प्रतिरक्षा सेल स्तरों घूम विश्लेषण।

Introduction

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घातक mesothelioma (एमएम) झिल्ली (मेसोथेलियम) में बदल कोशिकाओं से पैदा होती है, जो एक आक्रामक द्रोह है कि लाइनों के फेफड़े और पेट cavities, दिल और आंतरिक प्रजनन अंगों, और फेफड़ों गुहा या फुस्फुस 1,2 का सबसे आम प्राथमिक ट्यूमर है । एस्बेस्टोस तंतुओं को एक्सपोजर सभी एमएम के 80% के लिए खातों, और अभ्रक उपयोग पर रोक लगाई अधिकांश पश्चिमी देशों में दशकों पहले शुरू किए गए थे, जबकि समुदाय में इसकी व्यापक उपयोग एक घातक विरासत छोड़ दिया है। विश्व स्वास्थ्य संगठन के 107,000 लोगों को दुनिया भर में वृद्धि करने के लिए जारी मृत्यु दर के साथ, अभ्रक से संबंधित बीमारियों से हर साल मरते का अनुमान है कि। एक नया गैर व्यावसायिक घटना लहर भी उभर रहा है और यह 3 चोटी जाएगा जब, और किस स्तर पर की समझ बहुत कम है।

प्रणालीगत कीमोथेरपी केवल व्यवहार्य विकल्प 4 में से एक का प्रतिनिधित्व करता है जब एम एम के साथ लोगों के बहुमत देर निदान कर रहे हैं। सबसे प्रभावकारिताकीमोथेरेपी और (सिसप्लैटिन 5 के साथ एक साथ पेमेट्रेक्स्ड) वर्तमान 'देखभाल के मानक' ve 10 से अधिक साल पहले की पहचान की थी। इस उपचार का हालांकि विफलता अपरिहार्य है और केवल 12 महीने 2 की एक गंभीर रोग का निदान और मंझला अस्तित्व के साथ रोगियों को छोड़कर कोई सिद्ध दूसरी पंक्ति विकल्प हैं। इसलिए, अधिक प्रभावी उपचार के लिए एक जरूरी unmet की जरूरत नहीं है। क्लिनिकल परीक्षण में उपन्यास के उपचारों के एक नंबर की परीक्षा होने के बावजूद कोई भी व्यवहार में परिवर्तन में हुई है। यह नैदानिक ​​6-8 की स्थापना करने के लिए, आम तौर पर जेनोग्राफ्ट माउस मॉडल में प्रदर्शन पूर्व नैदानिक ​​परिणामों की कम (5%) स्थानांतरण, के कारण भाग में है। इस तरह के मॉडल ईमानदारी से अक्सर एक प्रतिरक्षा प्रणाली के कामकाज 9 के अभाव में, गैर शारीरिक स्थानों में होने वाली ट्यूमर microenvironment के जटिल पहलुओं पुनरावृत्ति नहीं है।

Syngeneic ओर्थोटोपिक मॉडल ग की तुलना में काफी अधिक यथार्थवादी ट्यूमर माहौल बनानेट्यूमर एक अक्षुण्ण प्रतिरक्षा प्रणाली 10,11 के साथ सही शारीरिक स्थान में होने के रूप में ommonly चमड़े के नीचे जेनोग्राफ्ट मॉडल का इस्तेमाल किया। चूहे के बड़े आकार के लिए विशेष रूप से धारावाहिक रक्त उपचार की प्रतिक्रिया और विषाक्तता 12 का आकलन करने के लिए आवश्यक हैं ड्रॉ जहां दवा अध्ययन में, एक कृंतक रोग मॉडल के रूप में इसके उपयोग को बढ़ाता है। इसके अलावा, मॉडल में जिसमें रोग प्रगति की निगरानी के संचलन में पाया कारकों बेहद आकर्षक है का उपयोग कर रोग प्रगति की निगरानी करने की क्षमता की वजह से (जैसे फुफ्फुस गुहा के रूप में) ट्यूमर के स्थान के लिए मुश्किल है। प्रतिरक्षा सक्षम चूहों का उपयोग कर फुफ्फुस mesothelioma के एक syngeneic ओर्थोटोपिक मॉडल की पीढ़ी में वर्णित है। इसके अलावा, घूम प्रतिरक्षा कोशिकाओं को मापने के द्वारा फुफ्फुस रोग प्रगति की निगरानी के लिए एक आसान और अपेक्षाकृत गैर इनवेसिव विधि भी वर्णन किया गया है।

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Protocol

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सभी जानवरों को शामिल प्रक्रियाओं वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए अभ्यास के ऑस्ट्रेलियाई संहिता में सिफारिशों के अनुसार किए गए। इस अध्ययन के लिए प्रोटोकॉल रॉयल नॉर्थ शोर अस्पताल पशु की देखभाल और आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। महिला फिशर 344 चूहों (F344, 150-200 ग्राम) कर्न्स सुविधा पर बनाए रखा गया, मानक स्थितियों (12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र और भोजन और पानी के लिए मुफ्त का उपयोग) के तहत Kolling संस्थान।

नोट: सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के लिए एक प्रवाह चार्ट चित्रा 1 में प्रस्तुत किया है।

आरोपण के लिए कक्षों की 1. तैयारी

  1. (यह भी आईएल 45 के रूप में जाना जाता है; crocidolite अभ्रक का पेरिटोनियल लागू होने से व्युत्पन्न) संस्कृति चूहा मेसोथेलियोमा द्वितीय -45 सेल लाइन RPMI 1640 में (RPMI) मीडिया (37 डिग्री 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक और मानक स्थितियों में हो जाना 5% सीओ 2) के साथ सी humidified इनक्यूबेटर। Maintaएक 75 सेमी 2 फ्लास्क में Passaging और दो ​​बार उप-संवर्धन पर लगभग 1:50 पिछले एक सप्ताह से में।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल संस्कृति और गर्म aliquots के लिए अभिकर्मकों तैयार करें। आवश्यक अभिकर्मकों 10% FBS, फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और 0.5% trypsin EDTA के साथ सीरम मुक्त RPMI मीडिया (SFM), RPMI शामिल हैं।
  3. लगभग 70-80% संगम आरोपण के लिए संस्कृति कोशिकाओं। यह है कि वे रेखीय विकास के चरण में हैं सुनिश्चित करता है।
  4. , मीडिया discarding बाँझ पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ एक बार धोने और फिर 3 मिलीलीटर 0.5% की ट्रिप्सिन- EDTA जोड़कर हार्वेस्ट कोशिकाओं।
  5. सभी कोशिकाओं को गैर पक्षपाती हो जाते हैं जब तक लगभग 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटर बोतल लौटें।
  6. कोशिकाओं गैर पक्षपाती हैं, एक बार, ट्रिप्सिन निष्क्रिय करने के लिए 10% FBS के साथ RPMI के 3 मिलीलीटर जोड़ें। लीजिए और सेंट्रीफ्यूज कोशिकाओं 3 मिनट के लिए 300 XG पर।
  7. 3 मिनट के लिए 300 XG पर फिर SFM और सेंट्रीफ्यूज के 10 मिलीलीटर में सेल गोली धो लें।
  8. 10 SFM के मिलीग्राम और सेंट्रीफ्यूज के रूप में ऊपर के साथ फिर से धो सेल गोली।
  9. SFM के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend और एक hemocytometer या इसी तरह के उपकरण का उपयोग कर एक कोशिका गिनती प्रदर्शन करते हैं।
  10. 100 μl प्रत्यारोपित किया जा कोशिकाओं की राशि शामिल है, ताकि कोशिकाओं पतला।
    नोट: ट्यूमर के विकास को 100 100 μl में कोशिकाओं लेकिन एक मानक खुराक 100 μl में 500,000 कोशिकाओं के रूप में के रूप में कम एक खुराक पर प्रदर्शन किया गया है।
  11. चूहों की संख्या (यानी, 100 μl / चूहा) प्रत्यारोपित किए जाने के लिए मीडिया में पर्याप्त कोशिकाओं को तैयार है, प्लस भड़काना और सुई के मृत मात्रा से नुकसान के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए कम से कम 0.5 मिलीग्राम अतिरिक्त।
  12. तैयार (कोशिकाओं के बिना) पर्याप्त SFM नियंत्रण चूहों (यानी, 100 μl / चूहा) में प्रत्यारोपित किया जाना है, के साथ साथ कम से कम 0.5 मिलीग्राम अतिरिक्त।
    कोशिकाओं और SFM अब आरोपण के लिए तैयार हैं: ध्यान दें। वे 37 सी में रखा है और व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए कटाई के 2 घंटे के भीतर प्रत्यारोपित किया जाना चाहिए।

प्रकोष्ठों के 2. में विवो आरोपण

  1. प्रेरण कक्ष में F344 चूहा (> उम्र के 13 सप्ताह) प्लेस और 1.4% isoflurane साँस लेना (या सुविधा में उपयोग में विधि) का उपयोग कर anesthetize। चूहा (बहने 1.4 isoflurane%) के साथ एक नाक शंकु के लिए कक्ष से सो चाल यह प्रतीत होता है एक बार, (उदर दृश्य) का सामना करना पड़ सीने के साथ अपनी पीठ पर जगह है। यह आंतरिक अंगों को दूर छाती गुहा से व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देता है। चूहे सुनिश्चित करने के लिए संस्थागत प्रोटोकॉल के अनुसार सजगता की जाँच पूरी तरह anesthetized है।
  2. फर हटाने का अधिकार Regio costalis (छाती) क्षेत्र दाढ़ी।
  3. 80% v / वी इथेनॉल के साथ मुंडा क्षेत्र को साफ।
  4. इंजेक्शन साइट की पहचान: सही पक्ष पर, 2 ग्रंथि कपाल शुरू कर पाते हैं। इंजेक्शन साइट रिब पिंजरे की दुम अंत से 3 और 4 पसली के बीच में, यह करने के लिए 0.5 सेमी समीपस्थ है। (2A चित्रा)।
  5. धीरे resuspend को द्वितीय -45 कोशिकाओं मिश्रण। धीरे-धीरे एक 1 मिलीलीटर में सेल निलंबन (या नियंत्रण चूहों के लिए SFM) आकर्षित &# 160; जुड़ी एक सुई के बिना सिरिंज। एक सुई कोशिकाओं की ड्राइंग के लिए संलग्न है, तो कोशिकाओं सुई इंजेक्शन रेखा के साथ विकसित करने के लिए क्षमता है। एक 23G एक्स 1 ¼ सुई संलग्न। प्रधानमंत्री सुई और किसी भी हवाई बुलबुले को दूर।
  6. सिरिंज और सुई primed रहे हैं एक बार, सुई शाफ्ट पर एक 20 मिमी लंबा और 5 मिमी व्यास स्पेसर जगह है। इस इंजेक्शन के दौरान फुफ्फुस गुहा में भी गहराई से मर्मज्ञ से सुई को रोकने के लिए प्रयोग किया जाता है। उजागर सुई की लगभग 5 मिमी -12 मिमी किसी अंगों को नुकसान पहुँचाए बिना पसलियों के माध्यम से प्रवेश के लिए पर्याप्त है।
  7. धीरे धीरे, पसलियों के बीच सुई डालने एक रक्त वाहिका (कोई रक्त सिरिंज में दिखाई देनी चाहिए) तो 100 μl कोशिकाओं या SFM इंजेक्षन हवा निकाल नहीं किया गया है सुनिश्चित करने के लिए सिरिंज पर वापस खींचना। (चित्रा 2 बी)।
  8. सुई निकालें और धीरे छाती गुहा में कोशिकाओं का प्रसार करने के पक्ष की ओर से चूहे रोल।
  9. एक पिंजरे में चूहे रखें और वसूली के लिए जाँच करें। गुई चूहे 1 मिनट के भीतर जाग और चारों ओर स्थानांतरित करने के लिए शुरू किया जाना चाहिए।
  10. एक नई सुई का उपयोग कर प्रत्येक चूहे के लिए दोहराएँ। एक ही सुई पुनर्प्रयोग सुई का इंजेक्शन रेखा के साथ सेल के विकास में परिणाम होगा।
  11. दैनिक जानवरों की भलाई की निगरानी करें।
  12. संस्थागत पशु आचार समिति द्वारा शासित के रूप में नैतिकता की दृष्टि से परिभाषित समापन पर जानवरों euthanize। इन प्रयोगों में चूहों के लिए नैतिक समापन के 10% से अधिक या कृत्रिम श्वास का वजन कम थे।

3. पूंछ नस रक्त संग्रह

  1. खून के बाद सेल आरोपण तुरंत एकत्र किया जा रहा है, anesthetized चूहे रहते हैं। एक और समय बिंदु पर खून के नमूने हैं, तो 1.4% isoflurane साँस लेना का उपयोग कर चूहा anesthetize। चूहे सुनिश्चित करने के लिए संस्थागत प्रोटोकॉल के अनुसार सजगता की जाँच पूरी तरह anaesthetized है।
  2. अपने पक्ष पर चूहे रखें और एक पार्श्व पूंछ नस का पता लगाने।
  3. 80% इथेनॉल के साथ पूंछ जीवाणुरहित और एक 0.5 मिलीलीटर EDTA ग लेबलollection ट्यूब।
  4. रक्त एकत्र करने के लिए, हमेशा (साथ रास्ते से लगभग एक तिहाई) पूंछ की दुम अंत में शुरू करते हैं। यह पहला प्रयास असफल है मामले में पूंछ के कपाल समाप्त करने के लिए आगे के प्रयास के करीब अनुमति देता है। इस खून का थक्का पैदा कर सकता है के रूप में दुमदारी resample कभी नहीं।
  5. पार्श्व नस को एक 23G एक्स 1 ¼ सुई समानांतर स्थिति और यह लगभग 10 मिमी (चित्रा 3) के प्रवेश तो एक उथले कोण पर नस में स्लाइड।
  6. नोट: शिरा सफलतापूर्वक की हवा निकाल दी गई है, तो रक्त सुई (चित्रा 3 बी) की कुर्की के अंत में दिखाई जाएगी।
  7. रक्त की एक बूंद सुई पंचर की साइट पर पूंछ पर बनेगी। लेबल 0.5 मिलीलीटर (या छोटे) EDTA संग्रह ट्यूब में एक पिपेट और हस्तांतरण का उपयोग कर इस खून ले लीजिए। प्रतिरक्षा सेल परख 25 μl के लिए पर्याप्त है। खून बह रहा बंद हो जाता है जब तक साइट पंचर करने के लिए दबाव के साथ धुंध लागू करें।
  8. जनसंपर्क के लिए रक्त और EDTA मिश्रण करने के लिए रक्त ट्यूब झटकाघटना के थक्के। रक्त संग्रह और थक्के रोकने के लिए जितना संभव हो कम EDTA के साथ मिश्रण के बीच के समय रखें।
  9. विश्लेषण तक आरटी पर एक रैक में कई चूहों की दुकान EDTA-रक्त के नमूनों से रक्त एकत्रित करते हैं। संग्रह के 2 घंटे के भीतर प्रक्रिया खून।

मनका आधारित पद्धति का प्रयोग प्रतिरक्षा सेल की रूपरेखा के लिए 4. नमूना तैयार

नोट: यह एक मंच विधि प्रत्येक नमूना के लिए मोतियों की एक ज्ञात संख्या है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पूर्ण गिनती ट्यूब का उपयोग पर निर्भर करता है। इन ट्यूबों मोतियों को रिहा नमूना तैयार करने के दौरान भंग कि lyophilized छर्रों, होते हैं। मोती fluorescently लेबल कर रहे हैं और मनका आबादी पर gating से, निरपेक्ष मायने रखता गणना की जा सकती है।

  1. EDTA पूरे रक्त के नमूने कई मिनट के लिए एक धीमी गति से रोटरी मिक्सर पर रखकर अच्छी तरह से मिला है सुनिश्चित करें। प्रत्येक नमूना के लिए एक पूर्ण गिनती ट्यूब लेबल। मोती युक्त एक गोली टी के नीचे दिखाई जानी चाहिएट्यूब के नीचे वह धातु मनका धारक।
  2. एक लेबल पूर्ण गिनती ट्यूब में EDTA पूरे रक्त के 25 μl स्थानांतरण। मनका गोली खून के अलावा पर भंग होगा।
  3. प्रत्येक ट्यूब विरोधी चूहा टी / बी / प्राकृतिक हत्यारा (एन.के.) सेल कॉकटेल के 20 μl, विरोधी चूहा CD8a पीई के 10 μl, विरोधी चूहा सीडी 4 (डोमेन 1) FITC के 10 μl और विरोधी चूहे के 10 μl जोड़ने CD45 पीई / Cy7 (चित्रा 4 क)। Fluorophores तालिका 1 में परिभाषित कर रहे हैं।
  4. एंटीबॉडी और कोशिकाओं ट्यूब के नीचे में हैं और ट्यूब की ओर करने के लिए अटक नहीं यह सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब संक्षिप्त (300 XG) अपकेंद्रित्र। भंवर मिश्रण और आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. लाल रक्त कोशिकाओं को 10 मिमी Tris के 400 μl जोड़ने lyse करने के लिए, 0.15 मीटर अमोनियम क्लोराइड बफर (7.5 पीएच) और भंवर मिश्रण करने के लिए। नमूना पारदर्शी और बादल नहीं (आंकड़े 4 बी और सी) प्रकट होता है जब सेल पूरा हो गया है। नमूना पूरी तरह से वृद्धि को बढ़ावा मिलेगा lyse करने में विफलताविकास पृष्ठभूमि और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण करते समय झूठा मायने रखता उठाया।

नमूने के 5. प्रवाह cytometric प्रसंस्करण

नोट: प्रवाह cytometer एक 4 रंग पर प्रदर्शन करते हैं।

  1. चित्रा 5 में दर्शाया के रूप में अधिग्रहण मोड और 8 भूखंडों के साथ एक नया टेम्पलेट में सॉफ्टवेयर खोलें।
  2. 1 टेबल में सूचीबद्ध और गेट आर 1 की स्थापना उन लोगों के लिए साधन सेटिंग्स समायोजित (FITC [फ्लोरिडा 1] एपीसी [फ्लोरिडा 4] बनाम), चित्रा 5Ai) फ्लोरोसेंट मोती गिनती करने के लिए। अन्य फाटकों इस अधिग्रहण चरण में के रूप में महत्वपूर्ण नहीं हैं, लेकिन विश्लेषण के लिए आवश्यक हो जाएगा। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल निरपेक्ष गिनती मोती फ्लोरोसेंट रंजक होते हैं और नीले चैनल में सबसे कमजोर कर रहे हैं, हालांकि किसी भी चैनल में पता लगाया जा सकता है।
  3. एक तैयार नियंत्रण खून का नमूना, भंवर का उपयोग करें और फिर कोशिकामापी पर लोड और डाटा अधिग्रहण फाटकों समायोजित किया जा सकता है तो सेटअप मोड पर एक कम गति (12 μl / मिनट) पर चलाते हैं।
  4. अधिग्रहण करने के लिए सेट करेंआर 1 मनका गेट में 10,000 घटनाओं इकट्ठा।
  5. डेटा रिकॉर्ड और अधिग्रहण के मेनू में फाइल संख्या और लेबल नमूना फाइल स्थापित करने के लिए एक फ़ोल्डर सेट करें।
  6. नमूना कोशिकामापी पर विश्लेषण किया जा करने के लिए लोड और मध्यम (35 μl / मिनट) के प्रवाह की दर निर्धारित किया है। एक ही प्रवाह दर पर प्रत्येक नमूना चलाएँ। प्रवाह की दर (12 μl / मिनट) कम या (60 μl / मिनट) उच्च करने के लिए अलग होना पड़ सकता है, लेकिन आम तौर पर मध्यम उचित है। इस दर पर यह प्रत्येक नमूना के लिए 10,000 मनका घटनाओं के अधिग्रहण के लिए लगभग 90 से 120 सेकंड लेता है।
  7. नमूना यकीन घटनाओं R1 मनका गेट में प्रदर्शित कर रहे हैं बनाने के लिए तितर बितर भूखंडों देखना भरी हुई है, एक बार। प्रारंभ में बिखराव भूखंडों में बहाव के कारण नमूना दबाव में कुछ अस्थिरता हो सकती है। इस को स्थिर करने के लिए प्रतीक्षा करें।
  8. स्थिर हो जाने के बाद, अधिग्रहण पर क्लिक करें और नमूना चलाने के लिए अनुमति देते हैं। कोशिकामापी आर 1 में 10,000 मनका घटनाओं का अधिग्रहण समाप्त हो जाने के बाद कोशिकामापी अधिग्रहण रोकने के लिए और सभी डेटा की बचत होगी।
  9. नमूना निकालें और टीयू प्रवाह त्यागेंहोना। कोशिकामापी अब अगले नमूना के लिए तैयार है। सभी नमूनों को चलाने और फिर विश्लेषण मोड के लिए आगे बढ़ें।

6. इम्यून सेल विश्लेषण

नोट: Gating रणनीतियों और बूलियन बीजगणित प्रत्येक सेल की आबादी को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। बूलियन बीजगणित एक भी परिभाषा में कई आपरेशनों के लिए अनुमति देता है कि एक तर्क आधारित विश्लेषण विधि है। (उदाहरण के लिए, बी.डी. CELLQuest) प्रवाह कोशिकामापी का विश्लेषण सॉफ्टवेयर बूलियन बीजगणित के उपयोग के लिए अनुमति देता है। समीकरणों अधिक विशेष रूप से प्रत्येक कोशिका की आबादी की पहचान करने के लिए सेल को परिभाषित करने में सहायता करता है कि महत्वपूर्ण नकारात्मक जेट के लिए सक्रिय रूप से खाते में उपयोग किया जाता है। 'क्षेत्र' क 'गेट' को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। (-, 2 टेबल में परिभाषित + *) फाटकों बीजीय ऑपरेटरों से जुड़े कई क्षेत्रों से बना जा सकता है, जबकि क्षेत्र में एक दो आयामी अंतरिक्ष परिभाषित करते हैं।

  1. विश्लेषण मोड के लिए सॉफ्टवेयर स्विच। एक विश्लेषण टेम्पलेट मैच के लिए उत्पन्न किया जाना चाहिए
  2. अलग से प्रत्येक व्यक्ति फ़ाइल (यानी, प्रत्येक व्यक्ति नमूना) का विश्लेषण। तालिका 2 में परिभाषित के रूप में स्थापित फाटकों R1 R9 के लिए के माध्यम से और उसके बाद (जो भी चित्रा 5 में दिखाया गया है) प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए एल्गोरिदम की स्थापना की।
  3. फाटकों और एल्गोरिदम (2 टेबल और चित्रा 5) द्वारा परिभाषित व्यक्तिगत सेल आबादी की गणना करने के लिए सेल के आँकड़े काउंटर का प्रयोग करें। एल्गोरिदम सेल आँकड़े काउंटर में स्वचालित रूप से सेल नंबर को समायोजित करेगा।
  4. निम्न समीकरण का उपयोग सेल सबसेट की गणना:
    1 समीकरण
    नोट: गिना सेल की घटनाओं की संख्या (जैसे, सीडी 4 टी सेल घटनाओं) खून की μl प्रति सेल नंबर देने के लिए ऊपर समीकरण का उपयोग प्रगणित है। उदाहरण चित्रा 5 में दिखाया जाता है।

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Representative Results

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द्वितीय -45 कोशिकाओं का उपयोग फुफ्फुस mesothelioma के एक ओर्थोटोपिक मॉडल की पीढ़ी के लिए इस पत्र में इस्तेमाल किया विधि कोई चूहों आरोपण पद्धति के कारण मरने के साथ, एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और तेजी से समय सीमा में मेसोथेलियोमा के सामने झुकने जानवरों में हुई। प्रत्यारोपित कोशिकाओं की संख्या का अनुमापन 1x 10 3 कोशिकाओं को एक पूरी तरह से व्याप्ति मॉडल (100% engraftment) के लिए आवश्यक न्यूनतम संख्या थी कि निर्धारित। चूहों में प्रत्यारोपित कोशिकाओं के विभिन्न संख्या बीमारी की गंभीरता को प्रभावित करने के लिए प्रदर्शित होने के बिना बीमारी के समय के पाठ्यक्रम बदल दिया है। एक्स 10 3 1 प्राप्त किया है कि पशु, दिन 40, 30 और क्रमशः दिन 20 (चित्रा 6) से नैतिकता की दृष्टि से परिभाषित समापन के पर पहुंच गया 10 x 4 1 और 5 x 10 5 कोशिकाओं।

रक्त संग्रह करने के लिए संबंधित मनाया कोई जटिलताओं के साथ लगभग दो बार प्रत्येक सप्ताह चूहों से एकत्र किया गया था। यह कुल रक्त की मात्रा की है कि कोई 10 से अधिक% नोट करना महत्वपूर्ण है (यालगभग 2 मिलीग्राम) एक दो सप्ताह की अवधि में एकत्र किया जाना चाहिए। Gating रणनीतियों संयुक्त और बूलियन बीजगणित लिम्फोसाइटों, monocytes और जीवाणुओं और लिम्फोसाइट सबसेट टी, सीडी 4 टी, सीडी 8 टी, ​​बी और एन.के. कोशिकाओं की पहचान करने के लिए स्थापित किया गया था, जो एक प्रवाह cytometric परख। प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए मतलब है और सीमा नियंत्रण चूहों (एन = 5) और समापन बिंदु पर द्वितीय -45 प्रत्यारोपित चूहों का मतलब है और सीमा की तुलना में था (3 टेबल) का उपयोग कर स्थापित किया गया था। समापन बिंदु मूल्यों पहले मतभेद स्वस्थ और रोगग्रस्त पशुओं के बीच प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गिनती में ही अस्तित्व में निर्धारित करने के लिए की तुलना में थे। लिम्फोसाइट अनुपात (NLR) को monocytes, न्यूट्रोफिल और न्युट्रोफिल वृद्धि हुई जबकि स्वस्थ नियंत्रण चूहों की तुलना में, कुल लिम्फोसाइटों, सीडी 4 टी कोशिकाओं, बी lymphocytes और एन.के. कोशिकाओं समापन बिंदु पर द्वितीय -45 प्रत्यारोपित चूहों में कमी आई है।

यह भी इस प्रकार की बीमारी प्रगति के साथ बदल गया है और इन प्रतिरक्षा सेल मानकों च सरोगेट मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि क्या निर्धारित करने के लिएया रोग की निगरानी, ​​अनुदैर्ध्य नमूने भी चित्रा (7) की तुलना में थे। सबसे जानकारीपूर्ण अनुदैर्ध्य पैरामीटर नैतिक समापन के (चित्रा 7A) से पहले 7 दिनों के लिए पता लगाया वृद्धि के साथ NLR था। कम खुराक कोशिकाओं के साथ चूहों के लिए, NLR दिन 18 और 22 कुल लिम्फोसाइट मायने रखता है के बीच में वृद्धि करने के लिए शुरू किया है, जबकि उच्च खुराक कोशिकाओं के साथ चूहों के लिए, उच्च NLRs, 7 दिन और 12 दिन के बाद के आरोपण के बीच पता चला रहे थे एक साथ चूहों में रोग बढ़ने के साथ कम लंबे समय तक बीमारी समय बेशक मॉडल (कम सेल खुराक: 1 X10 4, चित्रा 7B)। यह कमी एक तेजी से समय के पाठ्यक्रम के साथ चूहों में स्पष्ट नहीं था (उच्च सेल खुराक: 5 X10 5)। मोटे तौर पर वृद्धि हुई मायने रखता है अक्सर (चित्रा 7C) मनाया गया जब monocytes टर्मिनल संग्रह तक सामान्य स्तर पर बने रहे। अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गिनती (न्यूट्रोफिल, एन.के., बी सेल और CD4 और CD8 टी कोशिकाओं) अधिक चर और इस तरह कम जानकारीपूर्ण थे।


चित्रा 1. प्रयोगात्मक प्रक्रिया का प्रवाह चार्ट। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. स्थान और आरोपण की साइट। चूहे पहले अपनी पीठ पर रखा और सही Regio costalis (छाती) क्षेत्र फर दूर करने के लिए मुंडा है, anesthetized है। सही पक्ष पर, ऊपर से 2 एन डी निपल की पहचान की है और इंजेक्शन साइट रिब पिंजरे (ए) के नीचे से 3 और 4 वें पसली के बीच में, यह करने के लिए 0.5 सेमी समीपस्थ स्थित है। एक स्पेसर तो फुफ्फुस में भी गहराई मर्मज्ञ सुई को रोकने के लिए तैयार सुई और सिरिंज पर रखा गया है गुहा और कोशिकाओं या SFM के 100 μl (बी) इंजेक्ट किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. पूंछ से रक्त एकत्रित करने के लिए नमूना तकनीक। पार्श्व नस (ए) के लिए एक 23G एक्स 1 ¼ सुई समानांतर स्थिति। एक उथले कोण पर लगभग 10 मिमी गहरी शिरा में सुई स्लाइड, और खून दिखाई (बी) है तब तक सुई निकालने कुछ सेकंड के लिए वहाँ पकड़ो। एक पिपेट (सी) का उपयोग कर खून ले लीजिए। यदि आवश्यक हो तो धीरे स्ट्रोक पूंछ नस रक्त प्रवाह जारी सुनिश्चित करने के लिए। आप थक्के रोकने के लिए जाने के रूप में एक 0.5 मिलीलीटर EDTA संग्रह ट्यूब (डी) में पिपेट रक्त, मिश्रण। arge.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए एक पूर्ण गिनती ट्यूब में रक्त के नमूने की लेबलिंग। रक्त (25 μL) और एंटीबॉडी के एक निरपेक्ष गिनती ट्यूब (ए) से जुड़ जाते हैं। ट्यूब तो vortexed और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए incubated है। अमोनियम क्लोराइड बफर के अलावा लाल रक्त कोशिकाओं lyse पहले, नमूना पंकिल या अपारदर्शी (बी) प्रकट होता है। Lysed एक बार, नमूना पारदर्शी प्रकट होता है और विश्लेषण (सी) के प्रवाह cytometry के लिए तैयार है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तों / ftp_upload / 53019 / 53019fig5.jpg "/>
चित्रा प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए 5. gating रणनीति। एक 6-आयामी डाटासेट लिम्फोसाइटों, monocytes और जीवाणुओं और लिम्फोसाइट सबसेट टी, सीडी 4 टी, सीडी 8 टी, बी और एन.के. कोशिकाओं की पहचान कर सकते हैं। परिभाषित gating रणनीतियों और एल्गोरिदम विशिष्ट पहचान सक्षम प्रत्येक कोशिका प्रकार परिभाषित है कि दोनों नकारात्मक और सकारात्मक जेट शामिल। (प्रत्येक ट्यूब के लिए थैली पर पाया) प्रत्येक पूर्ण गिनती ट्यूब में मोतियों की संख्या प्रत्येक नमूना के लिए दर्ज की गई है और के रूप में दिखाया प्रत्येक सबसेट के लिए रक्त μl प्रति कोशिकाओं की संख्या की गणना के लिए आवश्यक है। प्रत्येक सेल सबसेट के लिए पूरा gating एल्गोरिथ्म विश्लेषण भूखंडों के अधिकार के लिए सूचीबद्ध है। (ऐ) मोती (आर 1) शुरू में एपीसी बनाम FITC (फ्लोरिडा 1) (फ्लोरिडा -4) से गिने जाते हैं। अधिग्रहण लगभग 10,000 घटनाओं (इस उदाहरण के लिए 9960) के लिए निर्धारित है। (Aii) मलबे (आर 2) बाद के सभी छ से एसएससी बनाम एफएससी द्वारा की पहचान की और निकाल दिया जाता हैating। (बीआई) मलबे के बाद हटाने एसएससी बनाम (आर 2) एफएससी लिम्फोसाइटों (R3), monocytes (R4) और जीवाणुओं (R5) में सफेद रक्त कोशिका आबादी differentiates। (Bii) (बीआई) में पहचान सेल आबादी का उपयोग कर पुष्टि कर रहे हैं एसएससी बनाम पीई / Cy7 (फ्लोरिडा -3) पर आम ल्युकोसैट प्रतिजन CD45 gating। (Biii) लिम्फोसाइट आबादी (R3) आगे एसएससी बनाम एपीसी (फ्लोरिडा -4) पर CD3 gating का उपयोग कर टी कोशिकाओं (R6) में भेदभाव कर रही है। ( (Biv) CD8 टी कोशिकाओं) (। बी कोशिकाओं सीआइ भी CD8a (R9 एक्सप्रेस) और एसएससी बनाम पीई (फ्लोरिडा -2) पर gated हैं कि टी सेल (R6) में भेदभाव लिम्फोसाइटों (R3) कर रहे हैं और एन.के. कोशिकाओं लिम्फोसाइटों के रूप में परिभाषित कर रहे हैं CD3 नकारात्मक हैं जो R3)। वे CD45RA व्यक्त करते हैं और FITC (फ्लोरिडा -1)। (सीआईआई) सीडी 4 टी कोशिकाओं लिम्फोसाइटों (R3) के रूप में परिभाषित कर रहे हैं बनाम एपीसी (फ्लोरिडा -4) द्वारा सह-एक्सप्रेस CD3 gated हैं के रूप में बी कोशिकाओं (R7) एन.के. कोशिकाओं से भेदभाव कर रहे हैं (टी कोशिकाओं, R6) औरसीडी 4 (R8), लेकिन इस्तेमाल अन्य मार्कर के किसी भी व्यक्त नहीं करते। वे पीई बनाम FITC (फ्लोरिडा 1) (फ्लोरिडा -2) gating का उपयोग कर भेदभाव कर रहे हैं। एनके कोशिकाओं को भी CD161a। व्यक्त करता है कि पहले से ही परिभाषित नहीं किया गया है कि किसी भी शेष लिम्फोसाइट के रूप में परिभाषित कर रहे हैं यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
द्वितीय -45 मेसोथेलियोमा कोशिकाओं के विभिन्न खुराक के साथ प्रत्यारोपित चूहों के लिए चित्रा 6 अस्तित्व वक्र। चूहों के समूह pleurally साथ प्रत्यारोपित किया गया 5 एक्स 10 5 (एन = 6), 1 एक्स 10 4 (एन = 2), 1 एक्स 10 3 ( एन = 2) या 1 एक्स 10 2 (एन = 4) द्वितीय -45 मेसोथेलियोमा कोशिकाओं 100 μL मात्रा में और फिर वे euthanized थे जब नैतिक समापन बिंदु तक नजर रखी। जीवन रक्षा लॉग-रैंक (मेंटल-कॉक्स) Gehan-ब्रेसलो-Wilcoxon विधि का उपयोग रेखांकन किया गया था। p>

चित्रा 7
अनुदैर्ध्य स्वस्थ नियंत्रण चूहों के लिए मतलब है और श्रृंखला के लिए मेसोथेलियोमा रिश्तेदार के साथ चूहों से प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गिनती घूम। स्वस्थ नियंत्रण प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए इसका मतलब यह 7 चित्रा मूल्य का सही वाई अक्ष पर दिखाया जाता है (एक क्षैतिज अटूट काला लाइन के रूप में दिखाया गया है प्रत्येक ग्राफ) और सीमा ग्रे छायांकित क्षेत्र से दिखाया गया है। शाफ़्ट घोषित सेल प्रकार, या NLR के लिए मूल्य के लिए रक्त की μl प्रति गिना जाता है पता चलता है। एक्स अक्ष 0 दिन आरोपण का दिन है जहां रोग प्रगति, के लिए समय के पाठ्यक्रम है। 5 x 10 5 कोशिकाओं (सी, डी) दिखाए जाते हैं के साथ प्रत्यारोपित 1 एक्स 10 4 कोशिकाओं (ए, बी) और 2 चूहों के साथ प्रत्यारोपित 2 चूहों के लिए अनुदैर्ध्य का परिणाम है। (ए) NLR, (बी) के कुल लिम्फोसाइट मायने रखता है, (सी) एककेंद्रकश्वेतकोशिका मायने रखता है।ge.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

डिटेक्टर Fluorophore विवरण वोल्टेज मोड
एफएससी --- --- E00 रैखिक
एसएससी --- --- 450 रैखिक
फ्लोरिडा -1 FITC 533/30 एनएम 670 लॉग इन
फ्लोरिडा -2 पीई 585/40 एनएम 675 लॉग इन
फ्लोरिडा -3 पीई / Cy7 670nm (लंबे समय से गुजारें) 600 लॉग इन
फ्लोरिडा -4 एपीसी 675/25 एनएम 735 लॉग इन

तालिका 1: प्रवाह Cyto के लिए वोल्टेज डिटेक्टर सेटिंग्सएक 4 रंग प्रवाह cytometer का उपयोग कर मीट्रिक डाटा अधिग्रहण। आयाम लाभ सभी डिटेक्टरों के लिए 1 पर सेट किया जाता है। एफएससी: आगे तितर बितर, एसएससी: पक्ष बिखराव, FITC: Fluorescein isothyocyanante, पीई: phycoerythrin, एपीसी: Allophycocyanine।

सेल सबसेट सेल मार्कर Gating एल्गोरिथ्म
मोती आर 1
मलबा आर 2
कोशिकाओं (अखिल ल्यूकोसाइट्स) CD45 + -R2
लिम्फोसाइटों एसएससी बनाम CD45 + एफएससी R3 * -R2
Monocytes एसएससी बनाम CD45 + एफएससी R4 * -R2
न्यूट्रोफिल एसएससी बनाम CD45 + एफएससी R5 * -R2
टी कोशिकाओं (कुल) CD45 + / CD3 + R6 * R3 * -R2
सीडी 8 सकारात्मक टी सीईLLS CD45 + / CD3 + / CD8a + R9 * R6 * R3 * -R2
बी कोशिकाओं CD45 + / CD3- / CD45RA + R7 * R3 * -R2
सीडी 4 सकारात्मक टी कोशिकाओं CD45 + / CD3 + / सीडी 4 + R8 * R6 * R3 * - (R7 * R3 * -R2)
प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं CD45 + / CD3- / CD161a + R3 * - [(आर 2 + R6) + (R7 * R3 * -R2)]

तालिका 2: सेल मार्कर और gating एल्गोरिदम प्रत्येक प्रतिरक्षा सेल सबसेट को चिह्नित करने के gating एल्गोरिथ्म के लिए, '+ प्रतीक का अर्थ है' या 'और दो ​​अलग-अलग आबादियों अपनी प्रतिक्रियाओं ओवरलैप नहीं है, भले ही एक साथ जोड़े जाने के लिए अनुमति देता है।। '-' प्रतीक 'नहीं' का मतलब है और एक और परिभाषित आबादी या एक पहले से वर्णित आबादी के रिवर्स भीतर से एक जनसंख्या घटाना कर सकते हैं। '*' प्रतीक का अर्थ है 'और' और दो प्रतिक्रियाओं ओवरलैप केवल जब मौजूद है कि एक अंतरिक्ष परिभाषित करता है। इम्यून सेल सबसेट नियंत्रण चूहों (एन = 5) समापन बिंदु पर द्वितीय -45 प्रत्यारोपित चूहों (एन = 4) मतलब सीमा मतलब सीमा कुल लिम्फोसाइटों 165.7 111.5-207.0 97.9 54.4-137.0 सीडी 4 टी lymphocytes 72.9 45.4-111.4 38.4 25.6-50.0 सीडी 8 टी lymphocytes 36.6 26.0-48.3 32.1 16.1-46 बी लिम्फोसाइट्स 56.6 36.0-83.9 24.7 11.2-36.0 एन.के. कोशिकाओं 9.3 3.1-15.7 4.0 1.34-7.7 Monocytes 27.1 12.7-39.0 373।3 42.4-575.8 न्यूट्रोफिल 51.4 24.3-87.0 159.2 51.1-366.0 NLR 0.3 0.18-0.42 1.8 0.94-2.66

तालिका 3:। खून की μl प्रति स्वस्थ नियंत्रण चूहों में मतलब है और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रेंज (एन = 5) और द्वितीय -45 प्रत्यारोपित चूहों पर समापन बिंदु (एन = 4) परिणाम दिखाए जाते हैं।

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Discussion

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इस पत्र फुफ्फुस mesothelioma के एक चूहे syngeneic ओर्थोटोपिक मॉडल और अनुदैर्ध्य रक्त नमूने के माध्यम से रोग प्रगति की निगरानी के लिए एक सरल विधि की पीढ़ी के लिए एक विधि का विवरण।

द्वितीय -45 मॉडल एस्बेस्टोस तंतुओं से 13 फिशर 344 चूहों को उजागर द्वारा विकसित किया गया था। इस प्रदर्शन मेसोथेलियोमा रोगजनन के लिए मेजबान अभ्रक प्रतिरक्षा प्रणाली को बातचीत का सच गतिशीलता का प्रतिनिधित्व करता है, यद्यपि यह एक लंबे समय अंतराल (उत्पन्न करने के लिए वर्ष ले) और कारण एस्बेस्टोस तंतुओं को संभावित जोखिम के शोधकर्ताओं के लिए खतरनाक हो सकता है। जानवरों के फुफ्फुस गुहा में द्वितीय-45 कोशिकाओं के ओर्थोटोपिक आरोपण एक प्रतिरक्षा सक्षम मेजबान 11 में मानव रोग mimics जो कैंसर की प्रगति का एक सुरक्षित और तेजी से मॉडल उपलब्ध कराता है। हालांकि सटीक तरीके और सिद्धांतों इन प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं अच्छी तरह से परिभाषित नहीं कर रहे हैं के दौरान का पालन करने के लिए। प्रक्रिया असली है कि एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल में परिणाम वर्णितऑपरेटर के अनुभव के अपेक्षाकृत स्वतंत्र। महत्वपूर्ण कदम एक बहुत तेजी से विकास के चरण और व्यवहार्य कोशिकाओं की सटीक गिनती में, कटाई द्वितीय -45 कोशिकाओं रहे हैं; 2, सही आरोपण साइट की स्थिति को बनाए रखने और जानवरों की भलाई की निगरानी भी गहराई घुसना और फेफड़ों पंचर या दिल को नुकसान पहुंचा है, और 3 नहीं है सुई सुनिश्चित करने।

द्वितीय -45 सेल लाइन तेजी आरोपण के लिए तैयारी कर रहा है, इसलिए जब कोशिकाओं उप सुसंस्कृत होना चाहिए और विकास के दैनिक निगरानी, ​​बढ़ रही है और संस्कृति में हर 3 से 4 दिन passaging की आवश्यकता है। प्रकोष्ठों में लगभग 70% संगम, यानी, काटा और जब बहुत तेजी से विकास के चरण में गिना जाना चाहिए। गिनती और आरोपण के लिए तैयार करते समय बल्कि पीबीएस से सीरम मुक्त मीडिया में कोशिकाओं के मेजबान कोशिकाओं पर तनाव कम कर देता है। सटीक सेल मायने रखता है, विशेष रूप से कम सेल नंबर (जैसे, 100 से 1000) के साथ खुराक, जब reproducibility के लिए महत्वपूर्ण हैं। SUSपेंशन सजातीय हो सकता है और एकल कक्षों (कोई झुरमुटों) से मिलकर चाहिए। 100 μl का एक आरोपण मात्रा फुफ्फुस गुहा में अत्यधिक तरल पदार्थ के माध्यम से फेफड़ों के विस्तार आई बिना सटीक खुराक सक्षम बनाता है। आरोपण में महत्वपूर्ण कदम सही स्थिति और अधिक से अधिक 12 मिमी की गहराई तक सुई प्रवेश सीमित कर रहे हैं। इंजेक्शन स्थल पर सुई की सही स्थिति की कोशिकाओं फुफ्फुस गुहा में और न पेरिटोनियल गुहा में प्रत्यारोपित कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है। गलत तरीके से जिगर और पेरिटोनियल गुहा में, डायाफ्राम के माध्यम से बढ़ मेसोथेलियोमा ट्यूमर में परिणाम कर सकते हैं बहुत कम कोशिकाओं दाखिल। सुई के प्रवेश गहराई सीमित आंतरिक अंग क्षति का एक परिणाम के रूप में मृत्यु दर को रोकने के लिए भी अत्यंत महत्वपूर्ण है। यह प्रतिबंध (दिखाया गया है) एक लंबी सुई या 12 मिमी के लिए 5 मिमी की एक शाफ्ट की लंबाई के साथ एक छोटी सुई के इस्तेमाल को लेकर एक स्पेसर के उपयोग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। हमारे हाथ में, कोई प्रतिकूल घटनाएँ हुई हैंसेल आरोपण के दौरान। यह हर आरोपण के बाद सुई को बदलने के लिए भी आवश्यक है। ऐसा करने में विफलता इंजेक्शन रेखा के साथ छाती गुहा के बाहर से बढ़ ट्यूमर में परिणाम कर सकते हैं। फुफ्फुस गुहा के बाहर इस तरह के विकास सुई शाफ्ट पर अवशिष्ट कोशिकाओं के कारण होता है और विस्तारित अस्तित्व में हो सकता है।

≥ 1 एक्स 10 3 कोशिकाओं का प्रबंध जब हमारे हाथ में इस मॉडल एक 100% ट्यूमर engraftment दर है। द्वितीय -45 मेसोथेलियोमा मॉडल में रोग प्रगति 1 एक्स 10 4 कोशिकाओं 5 x 10 5 कोशिकाओं की एक खुराक के लिए कम से कम 20 दिनों प्रत्यारोपित कर रहे हैं और जब कम से कम 40 दिन किया जा रहा है, काफी तेजी से होता है। यह कुछ उपचारों के पूर्व नैदानिक ​​परीक्षण के लिए इस मॉडल की उपयोगिता सीमित कर सकता है। द्वितीय -45 कोशिकाओं, जबकि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं प्रवर्तक 13 से अनुमति के साथ sourced किया जा सकता है। हालांकि, एक ही आरोपण तकनीकों और सिद्धांतों को भी सेल लाइन रेपो से उपलब्ध अन्य चूहा मेसोथेलियोमा सेल लाइनों के लिए लागू किया जा सकता हैitories प्रासंगिक syngeneic चूहा उपभेदों के साथ मिलान किया जाता है। इष्टतम सेल खुराक सेल लाइन के साथ अलग-अलग हो सकता है और प्रत्येक पंक्ति के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता होगी।

रोग प्रगति और जानवरों की भलाई निगरानी ट्यूमर आंतरिक हैं और आकार से निगरानी नहीं कर सकते हैं के रूप में मुश्किल है। शारीरिक लक्षण दिखाई बनने से पहले इसलिए हम इस तरह के NLR या प्रतिरक्षा सेल मार्कर में अन्य परिवर्तन में वृद्धि के रूप में उनकी हालत की गिरावट की भविष्यवाणी कर सकता है कि जानवरों की निगरानी करने की एक विधि को विकसित करने की मांग की। नियमित रूप से नमूने जानवर के लिए कम से कम संकट के साथ किया जा सकता है, ताकि विकसित रक्त स्क्रीन परिधीय रक्त का केवल 25 μl का उपयोग करता है। वर्णित नमूना तकनीक आवश्यक विशेषज्ञता हासिल करने के लिए अभ्यास की आवश्यकता है। हालांकि, एक बार यह तेजी से और कम आक्रामक है महारत हासिल है।

रक्त विश्लेषण में एक महत्वपूर्ण कदम एक EDTA ट्यूब करने के लिए तेजी से हस्तांतरण के द्वारा रक्त नमूने के थक्के रोकने के लिए है। पका नमूनेमायने रखता है गलत हो जाएगा के रूप में खारिज किया जाना चाहिए। एक और महत्वपूर्ण कदम सेल विश्लेषण करने से पहले लाल सेल है। लाल कोशिकाओं को पूरी तरह lysed नहीं कर रहे हैं, वृद्धि की पृष्ठभूमि झूठा मायने रखता है तरक्की करेगा। डॉट भूखंडों और gating की प्रारंभिक सेटअप समय लगता है जबकि सेटिंग और टेम्पलेट से बच रहे हैं, एक बार, परख थोड़ा समायोजन की आवश्यकता है। नियोजित gating रणनीति डेटा deconvolute करने के लिए एक मल्टी पैरामीटर बूलियन बीजीय दृष्टिकोण का उपयोग करता है। विशेष के नाम से जाना जाता संयोजनों का उपयोग करके और साझा किए गए इस ratiometric मनका आधारित प्रौद्योगिकी 15-17 की स्थापना की सटीकता के साथ युग्मित लाभ दिया है। इस छह-आयामी डाटा मैट्रिक्स 14 में असतत सेल प्रकार परिभाषित गेट रणनीति की प्रत्येक पंक्ति के लिए एल्गोरिदम प्रतिजनों कोशिकाओं का एक अनुपात और μl प्रति एक निरपेक्ष गिनती दोनों के रूप में किसी भी परिभाषित सेल प्रकार की गणना को सक्षम करने की।

यह तेजी से प्रतिरक्षा प्रणाली पी मान्यता है कि होता जा रहा हैकैंसर 18 के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका तैयार करती है। दोनों घातक कोशिकाओं और ट्यूमर से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के दमन को समझते हैं और नष्ट करने के लिए प्रतिरक्षा प्रणाली की विफलता अनियंत्रित ट्यूमर के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। कैंसर मॉडलिंग और syngeneic कैंसर मॉडलों में से एक बड़ा फायदा है जब इस प्रकार, एक प्रतिरक्षा सक्षम ट्यूमर microenvironment के शामिल किए जाने के लिए एक महत्वपूर्ण विचार है। ये प्रतिरक्षा-सक्षम मॉडल xenogeneic मॉडल की कमी है, जो ट्यूमर के विकास और प्रतिरक्षा बातचीत के लिए एक यथार्थवादी और चिकित्सकीय प्रासंगिक माहौल बनाएँ।

यानी रोग प्रगति, लिम्फोसाइट मायने रखता है, एककेंद्रकश्वेतकोशिका मायने रखता है और NLR के साथ कि इस अध्ययन में पहचान प्रतिरक्षा मापदंडों भी गरीब मानव मेसोथेलियोमा मॉडल की प्रासंगिकता के लिए साक्ष्य उपलब्ध कराने 19-21 में रोग का निदान और रक्त परीक्षण के साथ संबंध स्थापित करने के लिए दिखाया गया है । प्रस्तुत मॉडलों में, प्रतिरक्षा के मापदंडों की निगरानी के नैदानिक ​​उपयोगिता बुद्धि में वृद्धि हुईज लंबे समय के कोर्स (कम खुराक) और आगे बीमारी के बाद के चरणों में अधिक लगातार नमूने में सुधार किया जा सकता है। इस पत्र मेसोथेलियोमा के एक मॉडल पर केंद्रित है, परिधीय रक्त नमूने के माध्यम से ट्यूमर प्रगति की निगरानी करने की क्षमता सभी syngeneic कैंसर मॉडल के लिए उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, परख भी अलग उपचार के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पहले हम एक syngeneic तंत्रिकाबंधार्बुद मॉडल (9L) 22 में एक एंटी-कैंसर का टीका उपचार के लिए प्रतिक्रिया पर नजर रखने के लिए इस परख का इस्तेमाल किया है। कि अध्ययन में, CD4 और CD8 टी कोशिकाओं सबसे जानकारीपूर्ण मार्कर थे। हम भी अलग केमोथेरापी 11 के लिए प्रतिरोधी ट्यूमर के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में मतभेद की पहचान करने के लिए इस परख और द्वितीय -45 मेसोथेलियोमा मॉडल का इस्तेमाल किया है। कि अध्ययन में, सीडी 8 टी कोशिकाओं को छोड़कर सभी मापदंडों महत्वपूर्ण अंतर दिखाया। यहाँ वर्णित रोग प्रगति दौरान अनुदैर्ध्य निगरानी भ्रष्टाचार को अलग प्रतिरक्षा सेल मानकों की क्षमता पर प्रकाश डाला गयाचूहों में कैंसर की syngeneic ओर्थोटोपिक मॉडलिंग उपक्रम जब कैंसर की प्रगति और जानवरों की भलाई के साथ संबंधित हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDTA Collection tube (0.5 ml) Greiner Bio One GmbH 450480
Rat T/B/NK Cell cocktail BD Pharmingen 558509 anti-Rat CD3  APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78)
anti-RAT CD8a PE  Biolegend 200608 (IgG1vClone G28)
anti-Rat CD4 FITC (Domain 1)  Biolegend 203406 (IgG1 Clone OX-38)
anti-Rat CD45 PE/Cy7  Biolegend 202214 (IgG1 Clone OX-1)
TruCount Tubes Becton Dickinson 340334 Box of 50 absolute counting tubes
RPMI 1640 media Life Technologies 11875-119
foetal bovine serum (FBS) Scientifix FBS500-S (lot# 010101-1)
trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
PBS tablets Medicago AB 09-9400-100
23Gx1¼ Needle Becton Dickinson 302008
1 ml Syringe Becton Dickinson 302 100
Fischer 344 Rat Animal Resources Centre, Perth Australia F344
I.S.O (Isoflurane USP) Veterinary Companys Australia (VCA)  B7058
II-45 Rat Mesothelioma line Zurich University Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC
FACSCalibur 4 color Becton Dickinson 342975
TRIS-HCL SIGMA T3253
Ammonium Chloride SIGMA 9718
Anaesthetic Machine (The stinger) Advanced Anaesthesia specialists #00449

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References

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द्वितीय -45 syngeneic चूहा Mesothelioma के मॉडल में ओर्थोटोपिक आरोपण और परिधीय इम्यून सेल निगरानी
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Weir, C. J., Hudson, A. L., Peters, L., Howell, V. M. Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model. J. Vis. Exp. (104), e53019, doi:10.3791/53019 (2015).More

Weir, C. J., Hudson, A. L., Peters, L., Howell, V. M. Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model. J. Vis. Exp. (104), e53019, doi:10.3791/53019 (2015).

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