本方案描述了一种制备与富勒烯共混的导电聚合物纳米颗粒的方法。这些纳米颗粒被研究用于作为下一代光动力疗法（PDT）光敏剂的潜在用途。
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摘要
摘要
本文介绍了一种用于制备和可重复 体外 报道了将导电聚合物纳米颗粒与富勒烯混合用作下一代光动力疗法（Photodynamic Therapy, PDT）光敏剂的评估。这些纳米颗粒通过半导体聚合物 MEH-PPV（poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene]）与富勒烯 PCBM（phenyl-C61在非相容性溶剂存在下，生成丁酸甲酯。MEH-PPV具有高消光系数，可导致三重态形成速率较高，并能高效地向富勒烯PCBM进行电荷和能量转移。后一过程通过富勒烯介导的三重态和自由基形成，以及MEH-PPV激发态的超快去活化，增强了光动力治疗（PDT）系统的效率。本文报道的结果表明，该纳米颗粒光动力治疗增敏系统具有高效性，并对癌细胞系表现出意外的特异性。
引言
在光动力疗法（Photodynamic Therapy, PDT）中，光敏剂被施用于靶组织，当暴露于光照时，光敏剂会产生活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）。诸如单线态氧和超氧阴离子等活性氧物种可诱导细胞和组织的氧化应激，并导致其结构损伤1-4。由于该方法操作简便，已受到广泛研究，并已开展多项临床试验5,6。然而，仍存在若干重要问题，例如光敏剂的暗毒性、患者对光的敏感性（源于光敏剂的非特异性分布）以及光敏剂的疏水性（这会导致生物利用度降低和潜在的急性毒性）。
在此，我们报告一种用于制备和 体外 评估将导电聚合物纳米颗粒与富勒烯混合用作下一代光动力治疗光敏剂。这些纳米颗粒由半导体聚合物 MEH-PPV（聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-亚苯基乙烯]）与富勒烯 PCBM（苯基-C61-丁酸甲酯）当这些材料溶解于相容性溶剂中并迅速注入非相容性溶剂时图1A）。选择MEH-PPV作为主体聚合物，是因其具有高消光系数，可导致高比例的三重态形成，同时能够实现向富勒烯PCBM高效且超快的电荷和能量转移7这些特性非常适合于光动力疗法中单线态氧和超氧阴离子的生成。
富勒烯实际上已以分子形式和纳米颗粒形式应用于光动力疗法（PDT）中8-13....
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方案
1. 细胞系培养
- 将TE 71（小鼠胸腺上皮细胞）、MDA-MB-231（人乳腺癌细胞）、A549（人肺癌细胞）和OVCAR3（人卵巢肿瘤细胞）的冻存管置于温水中解冻，时间不超过2分钟。每种细胞系加入10 ml含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，于106 × g条件下离心6分钟。
- 吸除上清液，向细胞沉淀中加入3 ml培养基，通过反复吹打充分混匀细胞。将该细胞悬液加入已预热的、含7 ml补充10% FBS的DMEM培养基的T75培养瓶中，置于37 °C、含95%空气和5% CO2的湿润环境中培养。将此培养瓶标记为第0代（Passage 0）。
- 当细胞融合度达到80%时，用0.05%胰蛋白酶孵育10分钟以收获细胞。加入等体积的培养基中和胰蛋白酶活性。将细胞悬液于106 × g离心6分钟。弃去上清液，向沉淀中加入3 ml新鲜培养基，充分混匀后取少量（100 µl）转移至含有7 ml培养基的培养瓶中。将培养瓶放入培养箱中孵育，并标记为第1代（Passage 1）。
- 持续培养各细胞系至第11或第12代。
2. 纳米颗粒的制备
- 制备约 10-6 M（调整后）未稀释的 MEH-PPV 储备液
- 在样品瓶中加入 1 mg 聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-亚苯基乙烯]（MEH-PPV）....
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结果
纳米颗粒的摄取及其内在细胞毒性
将50 wt%混合的MEH-PPV/PCBM纳米颗粒与TE 71、MDA-MB-231、A549和OVCAR3细胞系共同孵育。选择50 wt%的PCBM掺杂比例，因其已被证明可在共轭聚合物与富勒烯之间提供理想的电荷和能量转移特性14。纳米颗粒摄取的荧光图像如图1B所示。细胞与纳米颗粒共孵育24小时，以确保充分摄取。随后用4%多聚甲醛固定细胞，并用DAPI染色以识别细胞及细胞核位置。为获得足够分离的单个细胞图像，细胞汇合度维持在40%。荧光图像及其对应的相差图像显示，A549和OVCAR3癌细胞系对纳米颗粒具有优先摄取能力。在TE 71对照细胞系和MDA-MB-231癌细胞系中未观察到可检测的荧光信号，表明其摄取有限。而A549和OVCAR3癌细胞系则表现出显著的纳米颗粒摄取。通过将50 wt%混合的MEH-PPV/PCBM纳米颗粒与TE 71、MDA-MB-231、A549和OVCAR3细胞系共孵育，并采用MTT法测定细胞活力，评估其固有细胞毒性（暗毒性）。图1C
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讨论
为实现纳米颗粒的摄取，在制备纳米颗粒时必须维持若干关键参数。10-6 将MEH-PPV溶液（与50 wt% PCBM共混）溶于THF中，用于注入去离子水中。由于该溶液的浓度对所形成纳米颗粒的尺寸具有重要影响，因此需通过紫外-可见光谱法检测其浓度。请注意，在方案步骤2.1.3中，必须先将初始配制的MEH-PPV溶液（未稀释的MEH-PPV储备液）进行稀释，再进行紫外-可见光谱测定，因为该溶液的吸光度远大于1。注射速度在决定纳米颗粒尺寸方面也起着关键作用，应在剧烈搅拌去离子水的同时尽可能快速地完成注射；缓慢注射会导致形成较大的纳米颗粒。注射完成后应立即停止搅拌，以避免进一步聚集。在将溶液注入水中时，需将针头插入液面以下，并保持靠近小瓶内壁，以避免产生气泡，否则会影响纳米颗粒的尺寸。在本实验中，通过动态光散射（DLS）测得的纳米颗粒尺寸为61.5 ± 23.3 nm。选择DLS而非透射电子显微镜（TEM），是因为DLS方法快速、成本低、对本尺寸范围可靠且易于获取。这些纳米颗粒的zeta电位为-9.66 ± 8.12 mV。 即， 轻微负电至中性表面电荷
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者们衷心感谢美国国家科学基金会（NSF）通过CAREER奖（CBET-0746210）以及奖助项目CBET-1159500为本研究提供的经费支持。我们感谢夏威夷大学癌症研究中心的Turkson博士和中佛罗里达大学医学院的Altomare博士在细胞培养方面提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-亚苯基乙烯]（MEH-PPV） | Sigma Aidrich | 536512-1G | 平均 Mn 150,000–250,000 |
| [6,6]-苯基-C61 丁酸甲酯（PCBM） | Sigma Aidrich | 684449-500MG | >99.5% |
| 四氢呋喃（THF） | EMD | TX0284-6 | Drisolv |
| 1 ml 注射器 | National Scientific Company | 37510-1 | 用于过滤 MEH-PPV 溶液 |
| 注射器滤器 | VWR | 28145-495 | 25 mm，0.2 µm，PTFE |
| 1 ml 注射器 | Hamilton Company | 81320 | 用于将 MEH-PPV 溶液注入水中制备纳米颗粒 |
| DMEM/F12 培养基（50/50 混合液），杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Corning (VWR) | 45000-350 | |
| 不含酚红的汉克平衡盐溶液（HBSS） | Quality Biological (VWR) | 10128-740 | |
| 不含钙和镁的杜尔贝科磷酸盐缓冲液（1× DPBS） | Corning (VWR) | 45000-436 | |
| 胎牛血清，常规型（热灭活）（FBS） | Corning (VWR) | 45000-736 | |
| 胰蛋白酶 EDTA 1× 0.25% | Corning (VWR) | 45000-664 | 不含碳酸氢钠、钙和镁的 HBSS 中的胰蛋白酶/2.21 mM EDTA，经猪细小病毒检测 |
| 16% 戊二醛 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 通过加入 PBS 将 16% 戊二醛稀释至 4% |
| DAPI | Biotium VWR | 89139-054 | 细胞核染色剂 |
| 5 ml 移液管 | VWR | 82050-478 | |
| 75 cm2 培养瓶 | VWR | 82050-856 | 用于细胞培养 |
| 96 孔板 | VWR | 82050-771 | 用于 MTT 检测 |
| 带通气孔的组织培养皿 | Greiner Bio-One (VWR) | 82050-538 | |
| 碘化丙啶 | Molecular probes | P3566 | |
| Annexin V FITC | Invitrogen | A13199 | 凋亡染色剂 |
| Celltiter 96 非放射性细胞活力检测试剂盒（1000 次检测） | Promega (VWR) | PAG4000 | MTT |
| CellROX Green 试剂，用于氧化应激检测 | Invitrogen | C10444 | 用于活性氧（ROS）检测 |
| 紫外-可见分光光度计 | Agilent 8453 | ||
| 荧光分光光度计 | NanoLog HoribaJobin Yvon | ||
| 动态光散射仪 | PD2000DLS，Precision detector | ||
| 培养箱 | NuAir DH Autoflow | ||
| 共聚焦显微镜 | Zeiss Axioskop2 | 63X 油浸物镜 | |
| 落射荧光显微镜 | Olympus IX71 | 60X 水浸物镜，Andor Zyla sCMOS 相机 | |
| 太阳光模拟器 | Newport 67005 Oriel Instruments | ||
| 参考太阳能电池 | Oriel | VLSI Standards Incorporated | |
| 酶标仪 | BioTek Ex808 | ||
| 血细胞计数板 | Hausser Scientific Partnership | 3200 | 用于细胞计数 |
参考文献
- Dolmans, D., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3 (5), 380-387 (2003).
- Dougherty, T. J., et al. Photodynamic therapy. J Natl Cancer Inst. 90 (12), 889-905 (1998).
- Ferrari, M.
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重印与许可
