Abstract
hücre dışı matris (ECM) ECM kardiyo-vasküler de dahil olmak üzere gelişme ve çeşitli patolojilerin önemli roller oynadığı hücre proliferasyonu, canlılığı, göç, vb önemli regülatörleri olan, biyofiziksel ve biyokimyasal işaretler sağlamaktadır çapraz bağlı proteinlerin kompleks bir ağ örgüsü olan ve kas-iskelet sistemi hastalıkları, fibrozis, ve kanser. Bu nedenle, normal ve hastalıklı dokuların ECM'lerin bileşiminin karakterize yeni bir prognostik ve tanısal biyolojik ve potansiyel yeni terapötik hedeflerin tanımlanmasına yol açabilir. Ancak, ECM proteinleri doğası (boyutu büyük çapraz bağlı ve kovalent bağlı, ağır glıkosıle) zorlu ECMs biyokimyasal analizler hale gelmiştir. Bu zorluğu aşmak için, ECM proteinlerinin çözünmezliği yararlanır taze veya dondurulmuş doku ve tümörlerden ECMs zenginleştirmek için bir yöntem geliştirdi. Biz burada detaylı sıralı i oluşur decellularization prosedürü tarifFarklı pH ve tuz ve deterjan konsantrasyonları tamponlarda ncubations ve 1'de sonuçlar) hücre içi (sitozolik, nükleer, membran ve sitoskeletal) protein ve ECM proteinleri 2) zenginleştirme çıkarma. Biz o zaman deglycosylate ve kütle spektrometresi ile sonraki analiz için peptidler içine ECM-zenginleştirilmiş protein hazırlıklarını sindirimi nasıl açıklar.
Introduction
hücre dışı matris (ECM) kısmen, hücreler ve parametreler için mimari destek ve tutunması çapraz bağlanmış ve glikosile edilmiş proteinler, dokuların biyomekanik özellikleri 1,2 karmaşık bir ağ örgüsü olan. ECM proteinleri de hücrelere doğrudan reseptörleri (örneğin, integrinler, syndecans, vs.) ya da 3 Büyüme faktörü sinyal iletiminin düzenlenmesiyle işaret etmektedir. ECM böylece vb çoğalması, yaşam, polarizasyon, farklılaşma, göç gibi hücresel süreçlerin önemli düzenleyicileri biyofizik ve biyokimyasal ipuçları sağlar
ECM fizyolojisi, geliştirme ve 4 yaşlanma kilit roller oynar. Ayrıca, bu tür kalp-damar hastalıkları, fibroz, kas-iskelet hastalıkları, kanser gibi çeşitli patolojiler, neden olduğu ya da ECM değişiklik ile sonuçlanır. Ayrıca, ECM kök hücre nişler bakım katkıda bulunur ve inci anahtar ECM molekülleri tanımlamakDestek stemness doku mühendisliği ve rejeneratif tıp 5 direkt uygulama olacaktır. Ancak, onun önemine rağmen, ECM kalmıştır, yakın zamana kadar, 6 kadar yeterince.
In silico analiz ECM ve ECM ile ilişkili proteinlerin topluluk olarak tanımlanır matrisome, insan ve fare hem de genomlarında 1,7,8 birkaç yüz gen ürünlerini içermesidir olduğunu ortaya koymuştur. Ancak, ECM proteinlerinin çözünmezliği normal ve patolojik numunelerin in vivo hücre dışı matris kompozisyon sistematik karakterizasyonu engellemiştir. 10 - Biz son zamanlarda bu çözünmezliği avantaj döndü olabilir ve ECM proteinler 8 zenginleştirmek için kullanılan gösterdi. 10, 13 - Bu ve diğerleri ayrıca kütle spektrometresi ECMlerin 8 bileşimini karakterize etmek için tercih edilen bir yöntem olup olduğunu göstermiştir.
BizBurada farklı pH ve tuz ve deterjan konsantrasyonları tamponlarda sıralı inkubasyon oluşan bir decellularization prosedürü tarif. Ekstraksiyon (veya tükenmesi) sitozolik, nükleer, membran ve hücre iskeleti proteinleri ve ECM proteinleri zenginleşmesine Bu prosedür sonuçları. Daha sonra kütle spektrometresi ile sonraki analiz için peptidler içine ECM-zenginleştirilmiş protein hazırlıklarını sindirimi nasıl açıklar.
Ayrıntılı ve burada gösterilen prosedürler kullanılarak, başarılı bir şekilde ilave edilen ve kütle spektrometrisi ile karakterize edici özelliği, on farklı doku ve tümör türleri hücre-dışı matrisler: normal fare akciğer 8, insan ve murin kolon 8,9, insan karaciğer 9, insan kolorektal tümörler ve türetilmiş karaciğer metastazı 9, melanom ksenogrefleri 8, (yayınlanmamış Nebe ve ark.,), meme tümörü ksenogrefleri 10, murin pankreas adacık ve murin İnsülinomalar. Farklı matrisom karşılaştırılmasıes başka potansiyel diagnostik veya prognostik biyolojik olarak kullanılabilir doku ve tümöre özgü ECM imza ortaya koymuştur.
Bu prosedür, bir ya da nispeten küçük değişikliklerle, başka örneklerde uygulanabilir olduğuna inanıyoruz.
Protocol
NOT: Prosedür taze veya dondurulmuş flaş dokularda yapılabilir. Biz kan hücreleri ve plazma proteinleri kırmızı ortadan kaldırmak için diseksiyon sırasında PBS ile çok kanlanan dokular perfüze öneririz. Biz sabitleme gibi sabit dokularda prosedürü yürüten önermiyoruz (yani, kimyasal çapraz) decellularization müdahale ve aynı zamanda önemli ölçüde daha sonraki kütle spektrometresi analizi bozabilir. Bütün prosedür için, protein ve peptid kurtarma maksimize etmek için düşük tutma tüpleri ve pipet uçları kullanmanızı öneririz.
Dokuların veya Tümörler 1. Decellularization
Not: başlamadan önce, reaktifler hazırlanması ve her bir tampon istenen hacme (Bölme protein çıkarımı takımla birlikte verilmektedir), proteaz inhibitörleri ekleyin. Tüm tamponlar ve numuneler, SDS Yağış önlemek için oda sıcaklığında tutulması gerekiyor Tampon CS hariç deney süresince buz üzerinde tutulmalıdıryağışa.
Not: protokol farklı pH ve özüt, hücre içi proteinlerin sırayla ve çözünmeyen ECM proteinleri (Şekil 1, Tablo 1 için zenginleştirmek için tuzları ve değişik deterjan miktarını ihtiva eden bir tampon içinde inkübe bir dizi kullanır kullanımına alternatifler de Tartışma bakın ticari kit) burada ayrıntılı. Aşağıda verilen reaktif hacimleri dokular ya da tümörler (Tablo 1 e bakınız), 100 mg ve uygun bir şekilde ayarlanması gerekir.
- Doku tamamen bozulur ve homojen bir süspansiyon elde edilene kadar, bir doku homojenleştirici kullanılarak proteaz inhibitörleri içeren tampon C'de 500 ul doku 100 mg homojenize edilir.
Not: ekleme deoksiribonükleaz I (nihai konsantrasyon: 200 ug / ml, üreticinin talimatlarına uygun olarak yeniden) ve A (20 ug / ml, üreticinin talimatlarına uygun olarak yeniden nihai konsantrasyon) ribonükleazaTampon N. - Hücre içi çözünür proteinlerin Sıralı ekstraksiyon
- Sitozolik proteinlerin çıkarımı. 4 ° C'de 20 dakika boyunca bir boru rotator Homojenat inkübe edin. Daha sonra Western blot analizi (Beklenen Sonuçlar bölümü ve Şekil 2) için homojenat küçük bir kısım (20 ul, 10 ul) kaydedin.
- 4 ° C'de 20 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüjleyin Homojenat. Temiz bir tüpe supernatant toplamak bu Western blot analizi sitosolik (C) fraksiyonu teşkil edecektir. Flaş -80 ° C bu kısmını ve mağaza dondurma.
- Yıkamak için, proteaz inhibitörlerini ihtiva eden B Tamponu 400 ul pelet tekrar süspansiyon ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca bir boru rotator örnek inkübe edilir. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüjleyin Homojenat. Süpernatantı atın.
- Çıkarmak için, nükleer proteinler, Tampon N 150 ul proteaz inhibitörlerini ihtiva eden pelletini, deoxyribonucleaSE I ve ribonükleaz A ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca bir boru rotator örnek inkübe edilir.
- 4 ° C'de 30 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüjleyin ve temiz bir tüp içinde supernatant toplamak. Bir kez bu adımı yineleyin: ikinci kez numune santrifüj sonra, önceki süpernatana süpernatant ekleyin: Bu western blot analizi nükleer (N) fraksiyonu teşkil edecektir. Flaş -80 ° C bu kısmını ve mağaza dondurma. Sonra, adım 1.2.3 başına yıkamalarda gerçekleştirin.
- Membran proteinlerini ekstre etmek için, Tampon M, 100 ul, proteaz inhibitörlerini ihtiva eden pelet tekrar süspansiyon ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca bir boru rotator örnek inkübe edilir. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüjleyin
- Temiz bir tüpe supernatant toplamak Bu western blot analizi membran (M) fraksiyonu teşkil edecektir. Flaş -80 ° C bu kısmını ve mağaza dondurma.
- 2 pelet tekrar süspansiyon, sitoskeletal proteinler elde etmek içinProteaz inhibitörleri içeren ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca tüp rotator örnek inkübe Tampon CS 00 ul.
Pelet tamamen çözülür unutmayın. Biz pelet bozulması gözlemleyerek kadar pipetleme ve aşağı pelet kesintiye öneririz. - Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüjleyin. Temiz bir tüp içinde süpernatant toplayın. Bu noktada, pelet (video) büyüklüğünde bir başka belirgin bir azalma not edin.
- Tampon C içeren proteaz inhibitörlerinin 150 ul pelet yeniden süspanse edin ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca bir boru rotator örnek inkübe edilir. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüjleyin.
- Süpernatant toplayın ve önceki üstte yüzen eklemek Bu Western blot analizi sitoskeletal (CS) fraksiyonu teşkil edecektir. Flaş -80 ° C bu kısmını ve mağaza dondurma.
- Ek yıkar gerçekleştirin. 500 ul PBS proteaz inhibitörleri, bir içeren pelet yeniden süspansend, 4 ° C'de 5 dakika boyunca, bir boru rotator örnek inkübe edilir. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı atın. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
NOT: deterjanların tüm izleri peptidler (bakınız Bölüm 3) içine önce proteinlerin sindirimi için kapsamlı yıkar kaldırılması gerekir. Bu noktada, ECM-zenginleştirilmiş pelet anında donduruldu olabilir ve -80 ° C'de tutuldu. Topak boyutu, başlangıç malzemesi içinde çözünmeyen (ECM), proteinlerin miktarı ve decellularization verimliliğine bağlı olacağını not edin.
2. SDS-PAGE ve Western Blot tarafından Decellularization / ECM Zenginleştirme Kalitesinin İzlenmesi
- Toplam doku ekstraktı 10-20 ul kısım ve Laemmli Tampon 100 mM DTT içeren ara fraksiyonların 50 ul alikotları karıştırın. 100 mM DTT içeren 3x Laemmli tamponu ECM zenginleştirilmiş, çözünür olmayan kısmın yeniden süspanse edin.
Not: O konsantrasyonları yükselmişDTT ve SDS nispeten çözünmez olan ECM proteinlerinin çözündürme yardımcı olur. - SDS-PAGE ile protein ayırın ve nitroselüloz zarlar üzerine aktarıldı.
- Sitosolik, nükleer membran, hücre iskeleti ile ECM fraksiyonların her birinin proteinleri temsilcisine izlemek için antikorlar kullanılarak bağışıklık-lekeleme gerçekleştirme (Örnek Sonuçlar bölümünde, Tablo 2 ve Şekil 2).
Kütle Spektrometresi Analizi için Peptitler için Proteinlerin 3. In-solüsyon Sindirim
Not: SDS decellularization prosedürü ve uzaklaştırılmasından sonra elde edilen topak, bu proteinler ve peptitler sindirilmiş gereken kütle spektrometrisi ile daha fazla analiz için çözünmeyen ECM proteinlerinde zenginleştirilmiş olan. Bu aşama, örneğin, protein konsantrasyonunu ölçmek için ECM proteinin çözünür bir sonucu olarak, bu mümkün olmadığından, dikkat edin. Böylece ECM-Enri sindirimi reaktif hacimleri sağlamakECM zenginleştirilmiş pelet (Tablo 3) boyutu (mm) ya da kuru ağırlığına göre peptidlere ched örnekleri. amonyum bikarbonat, üre, DTT, iyodoasetamit ve trifluoroasetik asit çözeltileri tüm taze hazırlanmış olması gerekir.
- ECM zenginleştirilmiş pelet 8 M üre uygun hacimde eklenmesiyle ECM zenginleştirilmiş örnek yeniden süspanse edin ve 10 mm nihai konsantrasyonda DTT ekleyin (bakınız Tablo 3). 37 ° C 'de 2 saat süre ile 1400 rpm'de sürekli çalkalama ile inkübe edin.
NOT: Bu noktada, ECM proteinleri tamamen çözülmüş olmayacak ve gözle görülür büyük protein parçacıkları santrifüj leme veya süzme ile göz ardı edilmemesi gerekir. Süspansiyon Deglikosilasyondan ve sindirim (video) üzerine silinir. - Alkilasyon
- HPLC dereceli su içinde iyodoasetamit çözelti hazırlayın. Oda sıcaklığına soğumasına ve 25 mM'lik bir son konsantrasyona değin iodoasetamid ekleyin. Tam alkilasyonu için DTT: iyodoasetamit oranı 1 arasında olmalıdır: 2 arasındadır.5 ve 1: 3 arasındadır.
- Oda sıcaklığında, 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe edilir.
- Deglikosilasyon:
Not: deglikosilasyon karbohidrat yan N değiştirilmiş peptitlerin tanımlanması müdahale zincirleri glikosilasyonu -bağlı kaldırmak için gereklidir.- 100 mM amonyum bikarbonat, pH 8.0, 2 M üre seyreltin ve PNGaseF uygun miktarda (bakınız Tablo 3). 37 ° C 'de 2 saat süre ile 1400 rpm'de sürekli çalkalama ile inkübe edin.
- Sindirim
- Lys-C ilave edin ve 37 ° C'de 2 saat süre ile 1400 rpm'de sürekli çalkalama ile inkübe edin. Tripsin ekleyin ve 37 ° C'de 1400 rpm'de O / N sürekli çalkalama ile inkübe edin.
NOT: 8M üre ilk sulandırıldıktan sonra bulutlu başladı ECM zengin süspansiyon O / N sindirimi (video) sonra açık görünür. - 37 ° C'de ilave bir 2 saat süre ile 1400 rpm'de sürekli çalkalama ile örnek tripsin bir ikinci kısım ilave edin ve inkübe edilir. </ Li>
- Lys-C ilave edin ve 37 ° C'de 2 saat süre ile 1400 rpm'de sürekli çalkalama ile inkübe edin. Tripsin ekleyin ve 37 ° C'de 1400 rpm'de O / N sürekli çalkalama ile inkübe edin.
- Asitleştirme
- Sindirim tamamlandıktan sonra, taze hazırlanmış% 50 trifloro-asetik asit (TFA) ile numunenin asit hale getirilmesiyle tripsin etkisiz hale getirirler. Örnek Bir seferde% 50 TFA 1-1.5 ul ekleyerek ve (video) pH kağıdı kullanarak çözeltinin pH ölçümü peptit solüsyonu 1 ul kullanmanızı öneririz pH <2. ulaşmalıdır.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüjleyin asitleştirildi. Temiz düşük tutma tüp supernatant toplamak. Bu noktada, peptid solüsyonu -20 ° C 'de muhafaza edilebilir.
- Tuzdan arındırma
Not: Bu son adım genellikle kendi tercih edilen yöntemlere göre kütle spektrometrisi imkan ifa edilmesi.- Önceki proteomik analizi, bir vakum deriştirme aygıtı içinde, konsantrasyon izledi taze hazırlanmış% 60 asetonitril,% 0.1 triflüoroasetik asit ile elüt örnekler ve peptidler desalt. Taze hazırlanmış% 3 acetonitr peptitler yeniden süspanseile,% 0.1 trifloroasetik asit 8.
NOT: tuzunun alınması işlemlerinden sonra, peptid solüsyonu konsantrasyonu spektrofotometri ile ölçülebilen ki (Beklenen Sonuçlar bölümüne bakınız). - Şimdi yine kütle spektrometresi tesisin optimum prosedürlere göre, kütle spektrometresi ile analiz örneği.
NOT: Biz diğer yayınlar 8 başvurmak için kütle spektrometresi kullanılarak ECMlerin kompozisyon karakterize ilgilenen araştırmacıları teşvik - LC-MS / MS parametreleri, protein tanımlama ve veri analizi için kütle spektrometresi veri araması dahil daha detaylı bir açıklama sağlamak 10 ve web sitesi Biz 8 geliştirdiği in silico matrisome açıklama aracını kullanarak.
- Önceki proteomik analizi, bir vakum deriştirme aygıtı içinde, konsantrasyon izledi taze hazırlanmış% 60 asetonitril,% 0.1 triflüoroasetik asit ile elüt örnekler ve peptidler desalt. Taze hazırlanmış% 3 acetonitr peptitler yeniden süspanseile,% 0.1 trifloroasetik asit 8.
Representative Results
Decellularization prosedürü kalite kontrolü
decellularization etkinliği western blot ile her bir fraksiyonun protein içeriğini analiz ile izlenebilir. diyagnostik değer 2 listeleri proteinleri Tablo decellularization prosedürü kalitesini değerlendirmek için. Şekil 2A, sitosolik ara kısımların etkili ekstraksiyon (GAPDH gösterir ), çekirdek (histonlar), membran (β1 integrin) ve sitoskeletal (aktin) proteinleri, ECM proteinleri (kolajen I) Bu fraksiyonlar saptanır etmiştir (Şekil 2). Buna karşılık olarak, final peleti ECM proteinleri için zenginleştirilir ve büyük ölçüde hücre içi protein (Şekil 2A). Aktin de tespit edilebilir, her ne kadar Şekil 2B, tatmin edici bir hücre içi protein tükenmesi (bir histon ECM bakımından zengin fraksiyon tespit edilir) sunulur tüketilmiş ECM-zengin fraksiyon ve monomerik kollajen I tükenmesi- Görünür molekül ağırlığı ~ 110 kDa, varsayımsal bir birleştirilmemiş kollajen tekabül eden - CS fraksiyonunda gözlenebilir.
Bazı dokularda bu bileşenler kısmen önceden fraksiyonlar 8-10 içinde çözünmüş olabilir, ancak biz de rutin olarak, örneğin fibronektin ve laminin gibi ek ECM proteinlerini izler. Örneğin, fibronektin da ECM dahil değil gibi çözünebilir plazma fibronektin oluşur. Ekstraksiyon öncesinde dokuların perfüzyon fibronektin konsantrasyonunu azaltır, ancak her zaman ortadan kaldırmaz. Bazı dokularda Lamininler bulunan gevşek hücre yüzeyi ya da ara fraksiyonlarda ECM ve özü ile ilişkilidir. Bu durum ortaya çıkarsa o ekstraksiyon koşulları (Tartışma) değiştirilerek ele alınabilir.
ECM proteinleri ve hücre içi bileşenlerinin aynı zamandaki azalması zenginleştirilmesi farklı tamponlar proteinlerin nispi çözünürlüğüne dayalı olduğunu not edin. ThFarklı dokulardan arasındaki farklılık ise - bazı durumlarda histon ve aktin daha kolay diğerlerine göre daha ayıklanır. Ayrıca histonlar N fraksiyonu (Şekil 2B) çıkarılan bekleniyor, ancak biz sık sık M veya CS fraksiyonu (Şekil 2A ve B) histonların daha tam tükenmesi gözlemlemek, dikkat.
Gösterge peptid konsantrasyonu tahmin
sindirim, asidifikasyon ve tuzunun alınması işlemlerinden sonra elde edilen peptid çözeltisinin konsantrasyonu, spektrofotometri ile, ya triptofan, tirosin karşılık gelen 280 nm dalga boyu kullanılarak peptit solüsyonunun absorbans ölçülerek, ya da peptidin absorbansa karşılık gelen 205 nm dalga boyu kullanılarak ölçülebilir tahviller.
(Sırasıyla, 82 mg, 100 mg ve 100 mg), üç fare akciğerleri örneklerin decellularization elde edilen peptid çözeltilerinin konsantrasyonu ölçüldü prepa424 ng / ml, 450 ng / ml, sırasıyla peptitler 580 ng / ml: Kırmızı paralel olarak ve her biri üzerinde elde edilmiştir.
Kütle spektrometresi ile ECM peptidler tanımlanması
Burada tarif edildiği gibi hazırlanan ECM zenginleştirilmiş protein örnekleri, bileşimin kütle spektrometrik analizi, sinyal yoğunluğu>% 70 ECM ve ECM ile ilişkili proteinlerin 8-10 tekabül göstermiştir.
Doku veya tümör, 100 mg (ıslak ağırlık) decellularize kompartman Ekstraksiyon kiti reaktifler Tablo 1. Cilt. Bu tablo bir bileşim, doku ya da tümör 100 mg decellularization yapmak için kullanılan her tampon hacmi listeler. Proteaz inhibitörleri kokteyli bir 50x çözelti olarak sağlanan ve her bir tamponun 2 eklenmesi ihtiyacı vardır.
| Bölme Protein Ekstraksiyonu Kit Reaktifler | 100 mg doku için ses | Kompozisyon (Millipore datasheet kedi # dayanan 2145 1) |
| Tampon Cı | 500 ul | HEPES (pH 7.9 3), MgCl2, KCI, EDT 4, sukroz, gliserol, sodyum ortovanadat 5 |
| Tampon W | 400 ul | HEPES (pH 7.9), MgCI2, KCI, EDTA, sukroz, gliserol, sodyum ortovanadat |
| Tampon N | 150 ul 2 x | HEPES (pH 7.9), MgCI2, NaCI, EDTA, gliserol, sodyum ortovanadat |
| Tampon W | 400 ul | HEPES (pH 7.9), MgCI2, KCI, EDTA, sukroz, gliserol, sodyum ortovanadat |
| Tampon M | 100 ul | HEPES (pH 7.9), MgCI2, KCI, EDTA, sukroz, gliserol, sodyum deoksikolat (DOC) 6, NP-40 6 |
| Tampon CS | 200 ul | BORU (pH 6.8), MgCI2, NaCI, EDTA, sakaroz, sodyum dodesil sülfat (SDS), 7, sodyum ortovanadat |
| Tampon Cı | 150 ul | HEPES (pH 7.9), MgCI2, KCI, EDTA, sukroz, gliserol, sodyum ortovanadat |
| 1x PBS | 500 ul / yıkama | - |
Notlar:
1 tescilli nedenlerden dolayı, biz kiti tedarikçiden tampon kesin bileşimini elde koyamadık, ama biz burada benzer çekimi yapmak için ev yapımı tamponlar kullanarak kendi deneyimlerine dayanarak bazı notlar yer alıyor.
2 proteaz inhibitörü: bu gibi sistein, serin ve treonin peptidazlar, serin esteraz, iki değerli katyon bağımlı metalloproteinaz karşı inhibitörlerin çeşitli dahil edilmesi tavsiye edilmektedirPek çok ticari olarak temin edilebilir proteaz inhibitörü kokteyl bulunmaktadır.
7.0 Yukarıdaki 3 pH lızozomal proteazlarının etkili bir inhibitörüdür.
(Genellikle 2 mM'de kullanılan) 4 EDTA iki değerlikli katyon bağımlı proteazların etkin bir inhibitörüdür.
5 Sodyum ortovanadat, bir fosfataz önleyicisidir. Tipik bir etkili konsantrasyonu, 0.5-5 mm olacaktır.
% 0.1% -0.5 6 NP40 en membran lipidleri çözündürülmesi için yeterli olmaktadır. NP40 ve DOC kombinasyonu - genellikle hala bozulmamış birçok protein-protein etkileşimlerini yaprakları daha sıkı ekstre olarak kullanılır - genellikle (örneğin, her biri% 0.5), eşit konsantrasyonlarda kullanılmaktadır.
7 SDS daha sıkı iyonik deterjan (CMC% 0.1) 'dir. Bu, aynı zamanda, diğer iki deterjan SDS / NP-40 / DOC, bir orta sertlik tampon olarak 0.1 / 0.5 /% 0.5 ile kombinasyon halinde de kullanılabilir.
Tablo 2. Teşhis proteinlerdecellularization prosedürü kalitesini izlemek. Bu tablo decellularization prosedürü kalitesini ve verimliliğini izlemek için kullanılabilen her hücre içi bölmenin (sitosol, çekirdek, plazma membranı, hücre iskeleti ve ECM) özellikleri olan proteinlerin örnekleri listeler ECM-zenginleştirme.
| Hücre içi Bölme | Tanı Proteinler |
| Sitosolik proteinlerdir | Gliseraldehit 3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH) |
| Nükleer proteinler | Histonlar, Laminler, Nucleoporin |
| Membran proteinleri | İntegrinler, Transferrin Reseptör |
| Sitoskeletal proteinler | Aktin, Tübülin, Vimentin |
| Bazal membran ECM proteinleri | Kolajen IV, Nidogens, Lamininler |
| İnterstisyel ECM proteinleri (interstisyel) | Kolajen I, Kolajen III, Kolajen VI, Fibronektin |
Antikorlar üzerinde öneri için, yayınları 8-10 bakın.
Peptidler içine ECM zenginleştirilmiş örnekleri sindirmek reaktiflerin Tablo 3. Cilt. Bu tablo ECM-zenginleştirilmiş protein örnekleri tekrar süspansiyon ve azaltmak, alkilleştirir, deglycosylate ve kütle spektrometresi analiz öncesi peptidler içine proteinlerin örnekleri sindirmek için kullanılan reaktif listeler.
| Reaktifler | Hazırlık | 1 mm kalınlıkta bir pelet için nihai konsantrasyon / Miktar (~ 5-10 mg kuru ağırlık) | 1 mm kalınlığında pelet için Volume (~ 5-10 mg kuru ağırlık) |
| Amonyum bikarbonat (NH4 HCO 3) | HPLC dereceli su içinde 100 mM çözelti, | - | - |
| Üre | 100 mM amonyum bikarbonat içinde 8 M çözelti | 8 M | 50 ul |
| Ditiyotreitol | 500 mM'de HPLC dereceli su ile sulandırın | 10 mM | 1 ul |
| Iyodoasetamit | 500 mM'de HPLC dereceli su ile sulandırın | 25 mM | 2.5 ul |
| Peptid N glikosidaz F (PNGaseF) | 500 U / ul ticari çözüm | 1000 U | 2 ul |
| Endoproteinaz lvsC, kütle spektrometresi dereceli | 0.5 ug / ul HPLC dereceli su ile sulandırın | 1 ug | 2 ul |
| Tripsin, kütle spektrometresi dereceli (yuvarlak 1) | 0.5 ug / ul ticari çözüm | 3 ug | 6 ul |
| Tripsin, kütle spektrometresi dereceli (yuvarlak 2) | 0.5 ug / ul ticari çözüm | 1.5 ug | 3 ul |
| Trifluoro-asetik asit (TFA) | HPLC dereceli su içinde% 50 çözelti, | - | 2-5 ul |
| Asetonitril (elüsyon) | HPLC dereceli su içinde% 0.1 TFA ile% 60 çözelti, | - | 500 ul |
| Asetonitril (sulandırma) | HPLC dereceli su içinde% 0.1 TFA ile% 3 solüsyonu | - | 100 ul |
Deneysel işlemin Şekil 1. Şema. Protoco şematik iş akışıl, dokular (Bölüm 1) decellularize decellularization kalite kontrol ve ECM zenginleştirme (Bölüm 2) değerlendirmek ve kütle spektrometresi analizi (Bölüm 3) öncesinde peptidler içine ECM-zenginleştirilmiş protein örnekleri sindirmek için.
Western blot ile decellularization prosedürü Şekil 2. kalite kontrolü Western blotlar murin akciğer (A) ve insan meme karsinoma ksenogreft (B) Aşağıdaki antikorlar kullanılarak numuneler üzerinde gerçekleştirilmiştir. Tavşan anti-aktin (klon 14-1) ve tavşan anti- -β1 laboratuvarda üretilen antikorların integrin; tavşan anti-kolajen I, fare anti-GAPDH ve tavşan anti-pan-histon antikor Millipore'dan edildi. Primer antikor inkübasyonunun ardından zarlar yıkandı ve HRP-konjuge keçi anti-tavşan veya keçi anti-MM varlığında inkübeJackson ImmunoResearch Laboratuvarı se ikincil antikor. Son olarak zarlar yıkandı ve Batı Yıldırım ™ kimyasal parıltı maddesi (PerkinElmer LAS) içinde kuluçkalanmıştır. * ECM zengin fraksiyonun minimal rezidüel histon kontaminasyonu gösterir. ** CS fraksiyonunda monomerik (karine birleştirilmemiş) kollajen I kısmi tükenmesi gösterir. *** ECM zengin fraksiyonun kalan aktin kirlenmesini gösterir. anti-kollajen antikoru ile tespit yayma post-translasyonel modifikasyonlar (örneğin, çapraz-bağlama, glikosilasyon) farklı düzeylerde gösterir.
Discussion
Değişiklikler
Biz 8 on doku ve tümör tiplerinden ECM zenginleştirmek için bu tam prosedürü istihdam rağmen - 10, protokolün değişiklikler aşağıdaki durumlarda dikkate alınmalıdır:
Ara fraksiyonlardaki ECM proteinleri 1) tespiti.
Fibronektin ve Lamininler için yukarıda tarif edildiği gibi farklı dokular ya da tümör tipleri arasında, hücre dışı matrislerin kendi ekstrakte / çözünmezlik ile farklılık gösterebilir. Örneğin, fibrotik doku ya da yeniden modelleme dokuların ECM ait dinamik üzerinde döner düşünülmektedir ve bu yüzden bir kere daha kolayca 12 ekstrakte olduğu dokularda ECM proteinlerinin daha yüksek bir oran dikkate olabilir. ECM proteinleri tespit edildiği fraksiyonuna bağlı olarak, ECM proteinlerinin çıkarma neden olan veya bu adımı atlayarak aşamasının inkübasyon süresini azaltmak öneriyoruz.
2) DECM-zenginleştirilmiş pelet hücre içi bileşenlerin önemli bir oranda etection. Bazı doku veya tümör tipleri oranı hücreleri içinde: ECM, özellikle yüksek (örneğin, karaciğer, dalak, sigara desmoplastik tümörler) 'dir. Bu durumda, (özellikle sitoskeletal proteinler ve / veya Histonların) hücre içi proteinleri tarafından ECM'nin zenginleştirilmiş fraksiyonun önemli bir kirlenme gözlenebilir. Verimli, biz Tampon M ve / veya Tampon CS (her ikisi de içeren deterjanlar, bu genellikle bol hücre içi proteinleri tüketir) iki kez inkübasyon yinelenen öneririz hücre içi proteinlerin tüketmek. Diğer bir alternatif (bir sonraki paragrafa bakınız), bu da nispeten daha fazla çözünür ECM proteinlerinin tükenmesine neden olabilir bu uyarı ile, daha yüksek deterjan konsantrasyonları alternatif tamponlar kullanmak olacaktır.
Bir ticari kit kullanılarak 3) Alternatif.
Bu ileri geri tampon maddenin kesin bileşimini elde etmek için, özel sebeplerden dolayı, yapamazkomparmantal Protein Ekstraksiyonu kiti tedarikçisi m. Ancak, biz Tablo benzer çekimi yapmak için tanımlanan deterjan ile ev yapımı tamponlar (NP-40, sodyum deoksikolat ve SDS) konsantrasyonları kullanarak kendi deneyimlerine dayanarak 1 notları dahil ettik. Yeni yapılan bir çalışmada da ECM proteinleri 13 korumak için decellularization tamponların pH önemine değindi.
Tekniğin Sınırlamalar
Burada sunulan yöntem, ECM proteinleri özünde daha çözünmez en hücre içi proteinlerin daha olduğu gerçeğine dayanır. Ancak, decellularization yöntemi burada açıklanan kesinlikle böyle bir büyüme faktörleri veya ECM-biçimlenme enzimler gibi ECM içinde bulunan çözülebilir bileşenleri ayıklar. Tarif edildiği gibi sıkı bir şekilde ECM proteinleri bağlı ECM ile ilişkili proteinler hazırlanan örneklerde proteomik ile tespit edilmiştir, ancak, bu yöntem tam olarak bileşimini profil çok katı olabilir matrisome ile ilişkiliproteinler.
Diğer yöntemlere göre tekniğin önemi
ara adımlar ihmal edilebilir ya da ECM protein kaybını önlemek ya da sırasıyla, hücre içi proteinlerin kirletici tükenmesi geliştirmek için tekrarlanır: diğer yöntemlere göre, burada sunulan yöntemin avantajı, ilgi ECM doğasına uygun olmasıdır. Bu yöntem, aynı zamanda, sadece takip eden peptid hazırlanması ve kütle spektrometrisi ile etkileşimi önlemek için kapalı durulanır deterjan az miktarda kullanılır. Son olarak, peptidlere ECM zengin protein preparatları sindirimi için tarif edilen yöntem aynı zamanda proteinler çözünür ve sanayide "ham" ECM zenginleştirilmiş fraksiyonları üzerinde yapılabilir gerekmeyen avantajına sahiptir.
(Örneğin, guanidin hidroklorür gibi) çaotroplar kullanan alternatif decellularization yöntemleri kütle spektrometresi ile ECM'lerin kompozisyon incelemek için b vareen (14 gözden) literatürde bildirilen ve kıkırdak 15,16, kalp 17, meme bezi 18 ve damar 19 ve glomerüler 20 temel zarların ECM bileşiminin karakterize edilmesi için kütle spektrometresi ile kombinasyon halinde kullanılmıştır.
Öneriler
ECM analiz takip eden proteomik için zenginleştirilmiştir halinde tripsinizasyon kısmen ECM sindirim ve ECM protein ve peptid kaybına neden olacak şekilde hücreleri sindirimi tripsin kullanılarak Decellularization yöntemleri, kullanılmamalıdır. Kollajenaz sindirim dokusu bozulması yardım için kullanılacak olsaydı ECM sindirim ve ECM protein ve peptid kaybına neden olur Benzer şekilde, dikkatle takip edilmesi gerekir.
Gelen çözeltisi genel olarak jel sindirim? ECM proteinleri 3x Laemmli tampon maddesi içinde yeniden süspansiyon haline getirildi bile ve 100 mM DTT, ayrı bir PO (% 6 SDS ihtiva eden), çapraz bağlanmış ve yüksek çözünürlüğü olan veSDS jelleri üzerinde orly. Böylece-jel sindirim tercih edilen bir yöntem değildir.
Gelecekteki uygulamalar
Burada tartışılan olmasa da, decellularization sırasında toplanan ara fraksiyonların her birinin kompozisyonu da kütle spektrometresi ile analiz edilebilir, dikkati çekiyor. Çok küçük bir numune (örneğin, insan biyopsileri) ya da eğitim Bu, özellikle yararlı olabilir bilgileri, diğer hücresel fraksiyonları üzerinde arzu edilir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue homogenizer: Bullet blender + beads | Next Advance | BB24-AU | |
| Compartmental Extraction kit | Millipore | 2145 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Ribonuclease A | Qiagen | 19101 | |
| HPLC-grade water | Sigma-Aldrich | 34877 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | |
| Dithiotreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | |
| Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| Peptide-N-Glycosidase F (PNGaseF) | New England Biolabs | P0704S | |
| Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade | Wako | 125-05061 | |
| Trypsin, mass spectrometry-grade | Promega | V5111 | |
| Trifluoro-acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Acetonitrile, mass spectrometry-grade | Thermo Scientific | 51101 | |
| Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge | Waters | 186000383 |
References
- Hynes, R. O., Naba, A. Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (1), a004903 (2012).
- Mouw, J. K., Ou, G., Weaver, V. M. Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), (2014).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).
- Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nat Nanotechnol. 6 (1), 13-22 (2011).
- Wilson, R. The extracellular matrix: an underexplored but important proteome. Expert Rev Proteomics. 7 (6), 803-806 (2010).
- Naba, A., Hoersch, S., Hynes, R. O. Towards definition of an ECM parts list: an advance on GO categories. Matrix Biol. 31 (7-8), 371-372 (2012).
- Naba, A., Clauser, K. R., Hoersch, S., Liu, H., Carr, S. A., Hynes, R. O. The matrisome: in silico definition and in vivo. characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices. Mol. Cell Proteomics. 11 (4), M111.014647 (2012).
- Naba, A., Clauser, K. R., Whittaker, C. A., Carr, S. A., Tanabe, K. K., Hynes, R. O. Extracellular matrix signatures of human primary metastatic colon cancers and their metastases to liver. BMC Cancer. 14 (1), 518 (2014).
- Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters. eLife. 3, e01308 (2014).
- Naba, A., Ding, H., Whittaker, C. A., Hynes, R. O., et al. Proteomic analysis of altered extracellular matrix turnover in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Mol. Cell Proteomics. 13 (7), 1741-1752 (2014).
- Tsuchiya, T., Balestrini, J. L., Mendez, J. J., Calle, E. A., Zhao, L., Niklason, L. Influence of pH on extracellular matrix preservation during lung decellularization. Tissue Eng Part C Methods. 20 (12), 1028-1036 (2014).
- Byron, A., Humphries, J. D., Humphries, M. J. Defining the extracellular matrix using proteomics. Int J Exp Pathol. 94 (2), 75-92 (2013).
- Wilson, R., Diseberg, A. F., et al. Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics. Mol. Cell Proteomics. 9 (6), 1296-1313 (2010).
- Belluoccio, D., Wilson, R., Thornton, D. J., Wallis, T. P., Gorman, J. J., Bateman, J. F. Proteomic analysis of mouse growth plate cartilage. Proteomics. 6 (24), 6549-6553 (2006).
- Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Doménech, N., Mayr, M. A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis. In. Heart Proteomics: Methods and Protocols. 1005, 215-223 (2013).
- Hansen, K. C., Kiemele, L., et al. An in-solution ultrasonication-assisted digestion method for improved extracellular matrix proteome coverage. Mol. Cell Proteomics. 8 (7), 1648-1657 (2009).
- Didangelos, A., Yin, X., Mandal, K., Baumert, M., Jahangiri, M., Mayr, M. Proteomics characterization of extracellular space components in the human aorta. Mol. Cell Proteomics. 9 (9), 2048-2062 (2010).
- Lennon, R., Byron, A., et al. Global analysis reveals the complexity of the human glomerular extracellular matrix. J. Am. Soc. Nephrol. 25 (5), 939-951 (2014).
