Diffondere superfici e Immunostaining di cromosomi del lievito

Summary

Viene presentato un metodo per la diffusione superficiale dei cromosomi dal lievito in gemmazione. Questo metodo è derivato da un metodo precedentemente descritto da Loidl e Klein. Inoltre, dimostriamo una procedura per l'immunocolorazione dei cromosomi diffusi.

Abstract

Le piccole dimensioni dei nuclei del lievito Saccharomyces cerevisiae limitano l'utilità della microscopia ottica per l'analisi della distribuzione subnucleare delle proteine legate alla cromatina. La diffusione superficiale dei nuclei di lievito provoca l'espansione della cromatina senza perdita di proteine legate. Un metodo per la diffusione superficiale bilancia la fissazione delle proteine legate al DNA con il trattamento detergente. Il metodo dimostrato è leggermente modificato da quello descritto da Josef Loidl e Franz Klein^1,2. Il metodo è stato utilizzato per caratterizzare la localizzazione di molte proteine legate alla cromatina in vari stadi del ciclo cellulare mitotico, ma è particolarmente utile per lo studio delle strutture cromosomiche meiotiche come i ricombinosomi meiotici e il complesso sinaptonemale. Descriviamo anche una modifica che non richiede l'uso di Lipsol, un detergente proprietario, che era richiesto nella procedura originale, ma non più disponibile in commercio. Viene inoltre descritto un protocollo di immunocolorazione compatibile con il metodo di diffusione cromosomica.

Introduction

Il lievito Saccharomyces cerevisiae in erba offre numerosi vantaggi per gli studi di meccanismi molecolari di processi biologici, tra cui lo studio delle proteine ​​che controllano la funzione cromosoma. Anche se ci sono vantaggi ben noti di gemmazione di lievito per gli studi genetici, molecolari e biochimici, gli studi citologici della distribuzione delle proteine ​​nel nucleo della cellula è complicata dalla sua piccola dimensione. Il tipico nucleo lievito ha un diametro inferiore a un micron, che è solo circa 5 volte il limite di risoluzione di luce visibile. Pertanto, la quantità di informazioni sulla distribuzione delle proteine ​​nucleari che possono ....

Protocol

NOTA: Alcune fasi del protocollo di seguito richiedono che lavora in una cappa aspirante pulito. Inoltre, il metodo richiede un microscopio di dissezione lievito tetrad dotato di un obiettivo 10X distanza di funzionamento lunga monitorare spheroplasting. Il microscopio dovrebbe essere istituito nel cofano prima del tempo. Rimuovere il braccio micromanipolatore e portatarga dal campo di applicazione e inserire questi elementi in un luogo sicuro, lontano dalla zona di lavoro.

1. Preparazione di sferoplasti

1. Crescere lievito in condizioni desiderate. Uso circa 2 x 10 ⁸ cellule per ogni campione, ad esempio 4 ml di una co....

Results

La comparsa di nuclei di diffusione dipende in modo critico sul bilanciamento tra cromosomi fissazione e de-compattazione. Anche quando i reagenti sono correttamente bilanciati, variazione del grado del cromosoma de-compattazione può verificarsi in diverse regioni della stessa diapositiva e / o tra diverse diapositive. Pertanto, la qualità di spread in una data regione di un vetrino deve essere valutato prima immagini vengono interpretati.

Gli effetti della "invadendo" e "underspreading" pos.......

Discussion

La comparsa di nuclei diffusi dipende in modo critico dall'equilibrio tra fissazione e lisi/trattamento detergente. Come discusso in precedenza, la conservazione di strutture cellulari variabili richiede l'uso di diverse concentrazioni di PFA. Per la maggior parte delle proteine, il 3% di PFA è ottimale. Tuttavia, la conservazione dei fusi richiede l'uso di PFA al 4%. Anche con un singolo set di reagenti, anche la tempistica della lisi rispetto alla fissazione può influenzare la qualità dei nuclei diffusi. Per ottener.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zymolyase	US Biological	Z1004	Preparare una soluzione di 20 mg/mL in 50 mM Tris pH 7,5 addizionato con glucosio al 2%. Prepara fresco ogni esperimento e conservalo a 4 gradi; C fino al momento dell'uso.
Lipsol	L.I.P. Ltd	non più disponibile in commercio	Preparare una soluzione all'1% (v/v) in acqua. Conservare con ghiaccio.
NP-40	USB	19628	Preparare una soluzione all'1% (v/v) in acqua. Conservare con ghiaccio.
Tween 20	Sigma	P2287
Vetrini	Corning	2948-75x25
Vetrino coprioggetti standard	Fisher	12-544-E o 12-540-B
Vetrini coprioggetti ad alta risoluzione	Fisher	12-542-B
Photo-Flo 200 soluzione	Kodak	P-7417	Preparare la soluzione allo 0,2% (v/v) in acqua.
TBS			137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 24,7 mM Tris, pH 8
BSA	Sigma	A2153	Preparare una soluzione all'1% (p/v) in TBS. Conservare a 4 gradi C per un massimo di un mese.
Anticorpo
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit	Invitrogen	A-21206
IgG (H+L) Anticorpo
Vectashield supporti di montaggio con DAPI	Vector Laboratories	H-1200
ProLong Gold	Invitrogen	P36930
Scatola di vetrini in plastica	Fisher	03-448-1	Conservare i vetrini contenenti creme spalmabili essiccate in fessure a -20°C. Inoltre, utilizzare come camera umida.
Scatola di cartone per vetrini	Fisher	12-587-10	Utilizzare per trasportare comodamente vetrini macchiati/sigillati o per conservarli a 4 gradi.
Barattolo Coplin	Fisher	08-816	Utilizzabile come lavabo per scivoli.