Los astrocitos en el SNC cambian sus propiedades funcionales y estructurales en respuesta a estímulos dañinos. Este informe presenta un protocolo para la evaluación de la morfología tridimensional de los astrocitos en condiciones de enfermedad o después de intervenciones terapéuticas.
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Artículo de método
Protocolo para tridimensional confocal morfométrico Análisis de astrocitos
En este artículo
Resumen
Resumen
Como las células gliales en el cerebro, los astrocitos tienen diversos papeles funcionales en el sistema nervioso central. En presencia de estímulos nocivos, los astrocitos modifican sus propiedades funcionales y estructurales, una condición llamada astrogliosis reactiva. Aquí, se presenta un protocolo para la evaluación de las propiedades morfológicas de los astrocitos. Este protocolo incluye la cuantificación de 12 parámetros diferentes es decir, la superficie y el volumen del tejido cubierto por un astrocito (territorio de astrocitos), todo el astrocito incluyendo sucursales, cuerpo celular y núcleo, así como la longitud total y el número de sucursales, la intensidad de la fluorescencia inmunorreactividad de los anticuerpos utilizados para la detección de astrocitos, y la densidad de astrocitos (número / 1000 m 2). Para ello se crearon tres dimensiones (3D) imágenes microscópicas confocal, y la imagen 3D software de análisis, como se utilizó Volocity 6.3 para mediciones. Tejido cerebral de rata expuestos a beta amiloide 1-40 1-40) con o sin una intervención terapéutica para presentar el método. Este protocolo también se puede utilizar para el análisis morfométrico 3D de otras células a partir de ya sea in vivo o in vitro condiciones.
Introducción
En el sistema nervioso central saludable (CNS), los astrocitos desempeñan un papel importante en la regulación del flujo sanguíneo, el metabolismo energético, la función sináptica y la plasticidad, y el ion extracelular y neurotransmisor homeostasis a 1-3. Además, los astrocitos responden a diferentes estímulos nocivos y condiciones anormales, tales como trauma, infección, isquemia o la neurodegeneración a través de astrogliosis reactiva que se caracteriza por la hipertrofia, proliferación y remodelación funcional de astrocitos 4,5.
Astrogliosis reactiva puede diseñar la respuesta inflamatoria y proceso de reparación en el tejido y, por lo tanto, puede afectar a la evolución clínica de las intervenciones terapéuticas. En consecuencia, los astrocitos han recibido atención por parte de neurólogo durante las últimas décadas como objetivos potenciales para las intervenciones terapéuticas para una variedad de enfermedades que afectan el sistema nervioso central.
Los astrocitos tienen normalmente una forma estrellada con el bienestar dramas efined que se extienden alrededor del soma 6. En una condición de enfermedad en el cerebro, se convierten en las ramas de astrocitos enrevesada hinchados y muestran extremos 7, por ejemplo en la presencia de beta amiloide (Aß).
En este artículo se presenta un protocolo para el análisis de imágenes en 3D de astrocitos adquiridos por microscopía confocal. Se midieron doce parámetros cuantitativos diferentes para cada astrocito: las áreas superficiales y volúmenes de astrocito el territorio (el tejido cubierto por un astrocito), célula entera (incluyendo ramas), cuerpo de la célula, y el núcleo; la longitud total y el número de sucursales; la intensidad de fluorescencia de los anticuerpos utilizados para la detección de astrocitos; y la densidad de los astrocitos (número / 1000 m 2). Para este fin, hemos utilizado las secciones del cerebro de ratas expuestas a intrahipocampal inyección de Aß 1-40 con o sin tratamiento genisteína como una sustancia anti-inflamatorio. El protocolo descrito se puede utilizar para una morfométricoÁLISIS de diferentes tipos de células in vitro o in vivo en diferentes condiciones.
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Protocolo
Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las políticas establecidas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NIH) aprobadas por el Comité de Ética de Irán Universidad de Ciencias Médicas (Teherán, Irán).
1. Los animales, la cirugía y de muestras Preparaciones
NOTA: Prepare el tejido cerebral para el análisis microscópico confocal 3D.
- Divida a los animales al azar en dos grupos: Aß 1-40: inyección (n = 8), y Aß 1-40: inyección con el tratamiento genisteína (n = 8); administrar la genisteína (10 mg / kg diluido en un vehículo tal como aceite de ricino polietoxilado) por sonda 1 hr antes de la cirugía.
- Anestesiar a los animales con ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg). Confirme la anestesia adecuada por falta de reflejo de retirada después de pellizcar el dedo del pie. Use ungüento en los ojos durante la cirugía para prevenir la sequedad.
- Colocar los animales en un aparato estereotáxico y la cabeza afeitada. Aplicar iodine solución para limpiar el cuero cabelludo antes de la incisión y mantener el lugar de la operación estéril durante la cirugía para reducir el riesgo de infección. Inyectar Aß 1-40 estereotáxicamente (4 l) en el hipocampo en -3,5 mm posterior al bregma, ± 2 mm lateral a la línea media, y -2.8 mm por debajo de la duramadre, de acuerdo con la rata cerebro atlas 8. Para el método estereotáxico consulte publicación anterior 9.
- Proporcionar postoperatorio observación / cuidado hasta que los animales son totalmente consciente para garantizar la comodidad de los animales. Mantenga los animales cálido durante la recuperación, y no devolverlos a una jaula con otros animales hasta la recuperación completa. Preste atención a cualquier signo de infección en los animales después de la cirugía.
- Anestesiar a los animales profundamente por ketamina (150 mg / kg) tres semanas después de la cirugía. Realizar la fijación por perfusión transcardial los animales con 0,9% de solución salina, seguido de paraformaldehído al 4% en PBS 0,1 M (pH = 7,4), a continuación, quitar y fijar cerebro como se describe en 10 </ sup>.
- Post-fijar los cerebros en paraformaldehído al 4% durante 2-3 días a 4 ° C.
- Incrustar el tejido en bloques de parafina mediante el uso de equipos de incrustación de tejidos, y evitar menores de llenado o sobre-llenar el casete ya que puede interferir con la alineación correcta o seccionamiento. Preste atención a la orientación del tejido en el bloque de parafina.
NOTA: El hipocampo de rata, por ejemplo, se encuentra cerca de la parte posterior del hemisferio cerebral. Por lo tanto, el tejido debe ser empotrado en una forma que de seccionamiento comienza en parte posterior del cerebro. Utilice el atlas de Paxinos 8 como una guía para llegar a la estructura anatómica deseada. - Coloque el microtomo lejos de corrientes de aire o entradas de aire ya los movimientos del aire hacen que el manejo de las secciones difíciles.
- Utilice secciones con un espesor micras ≥20 como con ser necesaria esta profundidad para producir imágenes Z-Stack de astrocitos completos. No utilice los primeros tramos de la pareja, ya que pueden tener un espesor no deseado debido a la térmica de correoXpansion.
- Coloque las secciones en la superficie del agua caliente (5 ± 2 ° C, por debajo de la temperatura de fusión de la parafina) el tiempo suficiente para aplanar las secciones.
NOTA: Durante la expansión de la sección puede perturbar la morfología de la estructura. Utilice pequeña brocha para transferir cuidadosamente secciones. Suma dos o tres secciones en cada diapositiva. - Diapositivas de las tiendas en un estante en una posición vertical y déjelos secar a 37 ° C durante varias horas o O / N.
2. La inmunohistoquímica
- Desparafinar secciones en xileno, 2 x 10 min, y se rehidratan a través de gradiente de alcohol (99,8%, 95%, y el 70%, 10 min cada uno) y PBS.
- Incubar con anticuerpos contra la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) diluido 1: 1500 en PBS que contenía 0,25% de albúmina de suero bovino (BSA), 0,25% de Triton X-100 y 3,5% de suero normal (O / N a 4 C).
- Lávese las secciones en PBS durante 3 x 5 min.
- Incubar con antibodie conjugado con fosfatasa alcalina secundarias durante 1 hora (1: 100, 21 ° C, se diluyó en PBS).
- Lávese las secciones en PBS durante 3 x 5 min.
NOTA: Es importante lavarse las secciones correctamente después de anticuerpos secundarios para reducir al mínimo la tinción de fondo. - Incubar las secciones en la oscuridad con líquido Permanente Red cromógeno (15-20 min). Nota: Preparar la solución de no más de 30 min antes de su uso.
- Lávese las secciones en PBS durante 3 x 5 min.
- Finalmente, teñir los núcleos con 4-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; 1: 500, diluido en PBS) antes de cubrir-deslizamiento. Guarde las diapositivas en el refrigerador 24 a 48 horas antes de la microscopía.
3. Microscopía Confocal
NOTA: Para la evaluación cuantitativa (ver más abajo), seleccione un astrocito con un núcleo DAPI-manchado claramente visible con un mínimo de superposición de ramas para reducir el riesgo de errores. Producir imágenes Z-Stack es mucho tiempo. Sea paciente y no se detenga durante el procesamiento. Confocal láser vertical microscopio de barrido es de used para crear imágenes en 3D a partir de astrocitos.
- Poner la diapositiva en la platina del microscopio, y seleccione el objetivo 63X.
- Abra el software de imagen y haga clic en sistema Start. Haga clic en la ficha Localizar. Ir a Asignar y seleccione las buenas prácticas agrarias para ajustar la luz adecuada.
- Abra el obturador para reflejar la luz. Encuentra el revólver reflector en el lado derecho de obturación y elegir el color que debe ser reflejada por los astrocitos (verde, rojo o violeta); de color rojo (FSet20 wf) se utiliza aquí.
NOTA: No se olvide de enfocar la imagen directamente en el ocular del microscopio. - Para encontrar el mejor enfoque, haga clic en Todos cerrada, ponga el pasador microscopio en el modo de pantalla y haga clic en la ficha Adquisición.
- Haga clic en Configuración de Smart en la ficha Adquisición; se abre una ventana. Seleccione el fluoróforo adecuado (es decir DAPI y Alexa Fluor 555, en el proyecto actual) de la lista. El color se selecciona automáticamente.
- Haga click en la mejor señal y Aplicar, luego haga clic en Ajuste de exposición; el ordenador se ajusta automáticamente los parámetros de exposición.
- Para la optimización de la imagen, vaya a la ventana de Canales. Desmarcar Track2, resalte Track1 y haga clic en Live. Enfoque la imagen si es necesario.
- En la ventana de Canales ajustar las siguientes teclas; haga clic en 1AU optimizar automáticamente el agujero. Es muy importante hacer este paso de lo contrario las imágenes confocal serán no óptima. Ajuste de ganancia para tener la mejor intensidad (mantener esta configuración por debajo de 800 para reducir el ruido extra). Por último, establezca la ganancia digital entre 2 y 3.
- Desmarcar Track1, haga clic en Track2 y repita el paso 3.8 para Track2. Entonces deja de Live.
- Vaya a la ventana Modo de adquisición. Mejorar la imagen mediante la optimización del tamaño constructivo y de promedio. Con el fin de cambiar el tamaño de fotograma ir a X * Y y seleccione 1024 x 1024. Elija una velocidad lenta para crear una mejor imagen.
- Ir a promediado y seleccione un Número ≥4. Este valor promedio indica el número de exploraciones que se promedian para produccióne la imagen adquirida. Ahora haga clic en el botón Snap, y guardar la imagen en 2D capturado.
- Para imágenes en 3D, marque el elemento Z-Stack bajo Smart Setup causando la ventana Z-Stack para abrir.
- Establecer las primeras y últimas posiciones para la Z-Stack, es decir, la profundidad de la célula. En primer lugar, haga clic en Live. A continuación, utilice la unidad de enfoque del microscopio para centrarse en la posición más alta de los astrocitos en el tejido, en el que el Z-Stack es empezar. Haga clic en Configurar Primera. Entonces centrarse abajo a la posición más baja de la astrocitos en el tejido, en donde se debe detener la exploración Z-Stack. Haga clic en Configurar Última. Entonces deja de Live.
- Elija el intervalo; 1,01 micras se usa en el presente estudio; intervalo de la elección se puede hacer haciendo clic en Óptima para establecer el número de rebanadas.
- Haga clic en Inicio Experimento. Guardar las imágenes una vez finalizada la exploración. Esta imagen se utilizará para la medición de los siguientes parámetros: área de superficie y el volumen del territorio de astrocitos, todo el astrocito incluyendo sujetadorpinzones, cuerpo de la célula, y el núcleo.
- Adquirir una imagen 2D usando un objetivo 10X o 20X, como se describe en los pasos 3.6-3.11. Esta imagen se puede utilizar para la medición de la intensidad de la fluorescencia inmunorreactividad de anticuerpos, y la densidad de astrocitos (número / 1000 m 2).
4. Densidad Astrocyte y GFAP + intensidad de fluorescencia
- Abra la imagen 20X 2D. Haga clic en Histo (Hisogram) en el lado izquierdo de la ventana de la imagen.
- Para calcular la densidad de astrocitos, seleccione tres campos visuales consecutivos bajo el objetivo 20X. Cuente el número de astrocitos que muestran un soma clara con un mínimo, sucursales en los campos de la superposición.
- Para cuantificar la intensidad de fluorescencia, seleccione una herramienta adecuada (rectángulo o círculo) en el pie de página de la ventana de imagen y elegir un área para la medición. Tenga en cuenta el valor medio y la desviación estándar aparecen automáticamente en la imagen. En el estudio actual, un área rectangular de 0,7 mm 2 entre strse utilizó iatum y la cuchilla medial del giro dentado.
5. Ramas astrocitos
- Para cuantificar la longitud y el número total de sucursales, utilizar imágenes 3D (adquiridos con 20X) en el software de análisis de imágenes. Dibuja una línea manualmente a lo largo de la longitud de cada rama del astrocito seleccionado. A continuación, seleccione la herramienta de medición que está especializada para la medición de la línea de longitud. Con el fin de cuantificar el número de sucursales, seleccione la cuenta-herramienta para contar el número de elementos marcados.
6. Volumen y Superficie
NOTA: Marcar una estructura de forma manual en 3D software de análisis de imágenes requiere concentración y la formación. Practique varias veces antes de iniciar un experimento.
- Para cuantificar el volumen y el área de superficie del núcleo de astrocitos, soma, cuerpo de la célula y el territorio, transferir las imágenes 3D (adquiridas en los Pasos 3.1-3.16) a un software de análisis de imagen en 3D tales como Volocity 6.1.
- Abra el software y crear una nuevabiblioteca. Arrastre todas las imágenes a la columna gris que queda en la nueva biblioteca. A continuación, seleccione una imagen en 3D. A la derecha, hay diferentes canales con diferentes colores. Encienda un canal de interés; por ejemplo, el canal azul para DAPI al medir el núcleo. Cambie el brillo de forma manual para obtener un contraste óptimo.
- Seleccione el menú Herramientas, vaya a Hacer Volumen y producir una sola imagen en 3D de imágenes Z-stack. Haga clic en Propiedades en el menú Edición y asegúrese de que X, se presentan Y y Z propiedades; de lo contrario es imposible llevar a cabo el análisis 3D.
- Haga clic en icono de la herramienta Freehand RIO en la barra de herramientas. Para medir el volumen y el área superficial del núcleo de astrocitos dibujar una línea alrededor del núcleo DAPI marcado.
- Para medir el volumen y el área superficial del cuerpo celular de astrocitos dibujar una línea alrededor del soma excluyendo ramas.
- Para medir el volumen y el área superficial de los astrocitos entero (cuerpo celular incluyendo sucursales) dibujar una línea alrededor del soma tras lasuperficie de todas las ramas.
- Para evaluar el volumen y el área de superficie del territorio astrocito trazar una línea entre las puntas de las ramas.
NOTA: Presione la tecla Supr en el teclado para borrar dibujos no deseados. - Haga clic en el menú de mediciones en la parte superior de la ventana de imagen para crear un protocolo de medición; se abre una ventana con diferentes herramientas.
- Arrastre Encuentra objetos a la parte superior de la ventana (panel). Dé un nombre descriptivo para la Población 1, seleccione el color asociado, y haga clic en Medida. Se abrirá otra ventana.
- Elija un área de parámetros, es decir, el volumen o superficie. Haga clic en Aceptar. Aparecerán los datos en una tabla.
- Para guardar los datos, haga clic en el menú Medición y seleccione Crear artículo Medición.
- Seleccione un nuevo elemento de medida llamada desde la ventana abierta. A continuación, dar un nombre a los datos y haga clic en Aceptar.
- Por último, exportar los datos al software de estadísticas como Graph almohadilla o programa de superación. Utilice la prueba t para analizar los datos, y luego trazar 2D grHPA.
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Resultados
Esta sección presenta algunos ejemplos de las observaciones cualitativas y cuantitativas producidos por análisis morfométrico 3D. Para los resultados completos de los 12 parámetros mencionados anteriormente, por favor, consulte nuestra publicación anterior 10.
Observaciones cualitativas
Los astrocitos mostraron ramas delgadas o gruesas que eran por lo general mucho tiempo en Aß 1-40 ratas inyectadas (Figura 1). Se observaron...
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Discusión
En el protocolo actual, hemos empleado morfometría confocal 3D para evaluar 12 parámetros diferentes que se asociaron con la morfología de astrocitos. Para este fin, el tejido del hipocampo de ratas con Aß 1-40 - se utilizaron astrogliosis inducida, con o sin pretratamiento genisteína como un agente anti-inflamatorio. Mediante el uso de imágenes en 3D y software morfométricos, hemos sido capaces de mostrar el efecto de la genisteína en astrogliosis es decir, la morfología de los astrocitos.
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Divulgaciones
Este trabajo fue apoyado por becas de la Diputación Provincial de Östergötland, (Suecia) y el Celular y Molecular Research Center en Irán Universidad de Ciencias Médicas (Teherán, Irán).
Agradecimientos
Los autores no tienen nada que revelar.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Beta amiloide 1-40 | Sigma Aldrich | 79793 | Mantener en -70 ° C |
| Genistein | Sigma Aldrich | 446-72-0 | mantener en -20 ° |
| Anticuerpos policoloniales C de conejo contra la proteína ácida fibrilar glial | DAKO | Z0334 | |
| Anticuerpos IgG anti-conejo conjugados con fosfato alcalino | DAKO | ||
| K0640 | |||
| Tampón de sustrato rojo permanente líquido | DAKO | K0640 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | 27963 | Aceite de ricino polietoxilado - Paso 1.1 |
| LSM 700 Microscopía de escaneo láser confocal | Carl Zeiss | ||
| Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc., | ||
| Análisis de imágenes 2000 | Tekno Aparato | ||
| estresutáxico | óptico Stoelting | ||
| 5 | Software de almohadilla gráfica Inc. |
Referencias
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- Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).
- Pekny, M., Nilsson, M. Astrocyte activation and reactive gliosis. Glia. 50 (4), 427-434 (2005).
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- Anderova, M., et al. Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).
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- Bagheri, M., et al. Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study. PloS One. 8 (10), e76526(2013).
- Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices. J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).
- Kulkarni, P. M., et al. Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images. J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).
- Wagner, D. C., et al. Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury. Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).
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Reimpresiones y permisos
