A espectrometria de massa de tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS) e as técnicas moleculares (sequenciamento do gene 16S rRNA) permitem a identificação de patógenos bacterianos raros em diagnósticos de rotina. O objetivo deste protocolo reside na combinação de ambas as técnicas, o que leva a dados mais precisos e confiáveis.
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Artigo de método
Identificação de patógenos bacterianos raras, seqüência do gene 16rRNA e MALDI-TOF MS
Neste artigo
Resumo
Resumo
Há um certo número de agentes patogénicos bacterianos raras e, por conseguinte, suficientemente descritas, que são relatados para causar infecções graves, especialmente em pacientes imunocomprometidos. Na maioria dos casos, apenas alguns dados, em sua maioria publicados como relatos de casos, estão disponíveis que investigar o papel desses agentes patogênicos que um agente infeccioso. Por conseguinte, a fim de clarificar o carácter patogénico dos referidos microorganismos, é necessário levar a cabo estudos epidemiológicos os quais incluem um grande número dessas bactérias. Os métodos utilizados em tal estudo de vigilância tem que seguir os seguintes critérios: a identificação das estirpes tem que ser precisos de acordo com a nomenclatura válida, devem ser fácil de manusear (robustez), econômico em diagnósticos de rotina e eles têm para gerar comparáveis resultados entre diferentes laboratórios. De um modo geral, existem três estratégias para a identificação de estirpes bacterianas num local de rotina: 1) identificação fenotípica caracterizar o Biochemical e metabólicas propriedades das bactérias, 2) técnicas moleculares como a sequenciação do gene 16S rRNA e 3) espectrometria de massa como uma abordagem baseada em romance proteoma. Uma vez que a espectrometria de massa e abordagens moleculares são as ferramentas mais promissores para a identificação de uma grande variedade de espécies bacterianas, são descritos estes dois métodos. Avanços, limitações e potenciais problemas ao utilizar estas técnicas são discutidas.
Introdução
identificação segura de agentes patogénicos raros em diagnósticos de rotina é dificultada pelo fato de que os métodos culturais e bioquímicos clássicos são complicados e, por vezes questionável. Além disso, um laboratório de diagnóstico microbiologia tem de processar um grande número de agentes patogénicos, que vão desde algumas centenas a vários milhares, diariamente, o que requer o uso de sistemas automatizados. Em adição à gestão de um alto rendimento diária, é necessária a identificação precisa de espécies bacterianas. Isso se justifica, uma vez que diferem em seu padrão de susceptibilidade antimicrobiana e identificação, portanto, correta fornece o clínico com i....
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Protocolo
1. Extracção de DNA bacteriano
- Preparação de solução de PBS
- Pesar 1,65 g de Na 2 HPO 4 x 2H 2 O, 0,22 g de NaH 2 PO 4 x 2H 2 O e 8,80 g de NaCl, num balão e encher com água destilada para um volume final de 1000 ml. Ajustar o pH para 7,4. Para utilização final filtrar a solução através de uma bactéria-proof (0,22) filtro.
- Bactérias Extracção de DNA de bactérias Gram-negativas
- Streak o material do paciente em meio de cultura adequado (por exemplo, Columbia ágar sangue), identificar e isolar patógenos potenciais.
- Prepare cultura pura e e....
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Resultados
MALDI-TOF MS é um método rápido e barato para diagnósticos de rotina microbiológicos romance,. Identificação de espécies bacterianas por MALDI-TOF MS produz espectros composta principalmente de proteínas ribossomais, mas também outras "proteínas muito conservadas com funções casa de manutenção afetados o menos possível e por condições ambientais" 17 banco de dados .A deste MMIs contém um grande conjunto de espectros de referência e até mesmo bactérias, que raramente .......
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Discussão
Ambos MALDI-TOF MS e 16S rRNA sequenciação genética oferecem a possibilidade de identificar um grande número de diferentes bactérias. MALDI-TOF MS é um método rápido e barato, o que é fácil de manusear e de grandes bases de dados de espectros de massa bacteriana estão disponíveis. Por esta razão, MALDI-TOF MS é um custo método rápido, eficaz e de confiança para realizar os estudos de rastreio focados em agentes patogénicos bacterianos raras 17,20,39,51. Em um estudo prospectivo comparando MALDI-TOF MS com out.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer ao Prof. Enno Jacobs por seu apoio contínuo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| CHROMASOLV, água de grau HPLC, 1 L | Sigma-Aldrich Chemie, Mü nchen, Alemanha | 270733 | |
| Tissue Lyser LT | Qiagen, Hilden, Alemanha | 85600 | Homogeneizador oscilante |
| Esferas de vidro de 1,0 mm | VWR International, Darmstadt, Alemanha | 412-2917 | |
| Thermomixer 5436 | Eppendorf, Hamburgo, Alemanha | 2050-100-05 | |
| QIAamp DNA Mini Kit (250) | Qiagen, Hilden, Alemanha | 51306 | |
| Kit de núcleo de PCR Taq (1.000 U) | Qiagen, Hilden, Alemanha | 201225 | |
| Forward Primer TPU1 (5&agudo;-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3') | biomers.net, Ulm, Alemanha | - | |
| Primer reverso RTU4 (5&agudo;-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3&agudo;) | biomers.net, Ulm, Alemanha | - | |
| Mastercycler | Eppendorf, Hamburgo, Alemanha | - | Termociclador |
| Tubo de reação 1,5 ml | SARSTEDT, Nü mbrecht, Alemanha | 72.692 | |
| Tubo de reação 2 ml | SARSTEDT, Nü mbrecht, Alemanha | 72.693.005 | |
| PCR 8er-CapStrips | Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Alemanha | 711040X | |
| PCR 8er-SoftStrips | Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Alemanha | 711030X | |
| Sharp R-ZV11 | Sharp Electronics, Hamburgo, | Alemanha-Microondas | |
| Titriplex III (EDTA Na><2-sal desidratado; 1 kg) | Merck, Darmstadt, Alemanha | 1084211000 | |
| SeaKem LE Agarose | Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Alemanha | 849006 | |
| SmartLadder SF - 100 a 1.000 pb | Eurogentec, Lü ttich, Bélgica | MW-1800-04 | |
| Azul de bromofenol (25 g) | Sigma-Aldrich Chemie, Mü nchen, Alemanha | B0126 | |
| Xileno cianol FF (10 g) | Sigma-Aldrich Chemie, Mü nchen, Alemanha | X4126 | |
| ComPhor L Maxi | Biozym, Hessisch Oldendorf, | Alemanha-Solução | |
| de brometo de etídio 1% (10 ml) | Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha | 2218.1 | |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad Laboratories, Mü nchen, | Alemanha-Sistema | de documentação em gel |
| ExoSAP-IT (500 reações) | Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, Reino Unido | 78201 | |
| Buffer (10x) com EDTA | Life Technologies, Darmstadt, Alemanha | 402824 | |
| BigDye Terminator Kit v1.1 | Life Technologies, Darmstadt, Alemanha | 4337450 | |
| Hi-Di formamida (25 ml) | Life Technologies, Darmstadt, Alemanha | 4311320 | |
| DyeEx 2.0 Spin Kit (250) | Qiagen, Hilden, Alemanha | 63206 | |
| 3130 Analisador Genético | Life Technologies, Darmstadt, Alemanha | - | Sequenciador |
| MicroAmp placa de reação óptica de 96 poços com código de barras | Life Technologies, Darmstadt, Alemanha | 4306737 | |
| 3130 Analisador Genético, base de placa 96 poços | Life Technologies, Darmstadt, Alemanha | 4317237 | |
| 3130 Analisador Genético, retentor de placa 96 poços | Life Technologies, Darmstadt, Alemanha | 4317241 | |
| 3130 Analisador Genético, bem septos de placas | Life Technologies, Darmstadt, Alemanha | 4315933 | |
| 3130 Analisador Genético, Polímero POP-7, 7 ml | Life Technologies, Darmstadt, Alemanha | 4352759 | |
| 3130 Analisador Genético, 4-Capillary Array, 50 cm | Life Technologies, Darmstadt, Alemanha | 4333466 | |
| Software de Análise de Sequenciamento 5.4 | Life Technologies, Darmstadt, Alemanha | - | |
| microflex | Bruker Daltonik, Bremen, Alemanha | - | Nosso mMIS |
| VITEK MS | bioMé rieux, Nü rtingen, Alemanha | 2nd mMIS | |
| flexControl 3.4 | Bruker Daltonik, Bremen, | Alemanha-Software de | controle de dispositivos |
| Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC) | Bruker Daltonik, Bremen, | Alemanha-Software de | análise |
| &alfa;-ciano-4-ácido hidroxicinâmico, HCCA, 1 g | Bruker Daltonik, Bremen, Alemanha | 201344 | |
| Padrão de Calibração de Peptídeos II | Bruker Daltonik, Bremen, Alemanha | 222570 | |
| MSP 96 alvo de aço polido | Bruker Daltonik, Bremen, Alemanha | 8224989 | |
| peqGREEN | peqlab | 37-5010 | |
| MALDI Biotyper Galaxy | Bruker Daltonik, Bremen, Alemanha | Parte nº 1836007 | Sistema automatizado de preparação de amostras |
| Vitek 2 | bioMé rieux, Nü rtingen, Alemanha | Nosso aMIS | |
| MicroScan | Beckman Coulter, Krefeld, Alemanha | 2nd aMIS | |
| BD Phoenix™ Sistema Automatizado de Microbiologia | BD, Heidelberg, Alemanha | 3rd aMIS | |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) | Coleção de Cultura de Tipo Americano (ATCC), Padrões LGC, Molsheim, França | Controle positivo para PCR |
Referências
- Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. (2010).
- Ch. 5. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. 81-104 (2010).
- Adekambi, T., Drancourt, M., Raoul....
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Reimpressões e permissões
