Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تحت الجلد أنجيوتنسين II تسريب باستخدام الأسموزي مضخات يقنع الأورطي تمدد الأوعية الدموية في الفئران

Published: September 28, 2015 doi: 10.3791/53191
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Saha Cardiovascular Research Center, University of Kentucky, 2Department of Pharmacology and Nutritional Sciences, University of Kentucky

Summary

يوفر زرع تحت الجلد من مضخات التناضحي نهج مناسب للتسليم لفترات طويلة وثابت من المركبات. وقد استخدم هذا الأسلوب على نطاق واسع لدراسة كل تمدد الشريان الأورطى البطنى والصدر في الفئران.

Introduction

تمدد الشريان الأورطى يحمل التوسع اللمعية الدائمين في الشريان الأورطي الذي ينذر تمزق ويؤدي إلى الوفاة عادة. يحدث هذا المرض في كل من المناطق الأبهر في البطن والصدر، والتي توصف بأنها تمدد الأوعية الدموية في البطن الأورطي (تمدد) وتمدد الأوعية الدموية الأبهري الصدري (TAAS)، على التوالي. بسبب نقص فهم الآليات الجزيئية والعمليات الفسيولوجية المرضية، لا يوجد علاج طبي ثبت التي يمكن أن تمنع توسع أو تمزق أي نوع من تمدد الشريان الأورطى. وبما أنه من الصعب الحصول على عينات المريض وإجراء التجارب على البشر مباشرة، والبحوث التي تركز على تحديد آليات تمدد تم في كثير من الأحيان استقراء من نماذج حيوانية. A نموذج حيواني شيوعا هو التسريب تحت الجلد أنجيوتنسين II (AngII) في الفئران. مقارنة مع النهج جراحية أخرى لإحداث تمدد في الفئران، مثل داخل الأبهر نضح الإيلاستاز أو تطبيق شبه الأبهري من كلوريد الكالسيوم التي تتطلب فتح البطن 1،2، هذا methoد لا تتطلب الدخول إلى تجويف الجسم وتتطلب الحد الأدنى من الخبرة الجراحية 3،4.

وذكر التسريب تحت الجلد AngII من خلال مضخات التناضحي للحث على التمدد في البداية في منخفض الكثافة البروتين الدهني (LDL) مستقبلات - / - الفئران التي غذيت على التخصيب الدهون النظام الغذائي المشبع 3، وبعد ذلك في APOE - / - تغذية الفئران حمية مختبر طبيعي 4. وقد أثبتت العديد من الدراسات الحديثة أيضا أن AngII يدفع تمدد في الفئران normolipidemic 5-7. وقد تم تطبيق هذا النهج من غرس AngII للحث على التمدد واستكشاف الآليات الجزيئية فضلا عن وضع استراتيجيات علاجية محتملة (على سبيل المثال، 5-15) لأن هذا النموذج يلخص العديد من الميزات التي لوحظت في تمدد الإنسان. على سبيل المثال، عوامل خطر تمدد الإنسان مثل التدخين، والشيخوخة، والذكورة أيضا تزيد تمدد AngII التي يسببها في الفئران 16،17. جمعية فرط كوليسترول الدم مع تمدد في البشر يتطلب التوضيح. ومع ذلك، فقد يكونأون يتفق أن ارتفاع الكولسترول تقوي AngII الناجم عن تمدد في الفئران 18. الأمراض من تمدد AngII التي يسببها في الفئران هي غير متجانسة للغاية وتتميز تسلل عميق بلعم، وتدهور الكولاجين، وتشكيل الجلطات والقرار، واتساع الأوعية الدموية 19-21. وعلى النقيض من موقع الأبهر infrarenal الأكثر شيوعا للتمدد في البشر، AngII الناجم عن تمدد في الفئران تحدث في منطقة الأبهري الكظرية. ميزة في كل مكان آخر من AngII التي يسببها التمدد هو كسر وسطي بطريق، مما يؤدي إلى تجلط الدم بطريق. ومن غير الواضح ما إذا كان بطريق الإيلاستين تمزق يحدث في البشر منذ المرضية الناتجة عن التمدد في البشر لم يتم دراستها بشكل خاص نظرا لعدم وجود أنسجة أم الدم من المراحل السابقة.

AngII التسريب في الفئران يؤدي أيضا إلى التوسع العميق للمنطقة الأبهري الصدري، أن يقتصر في الغالب إلى الأبهر الصاعد والذي هو المنطقة الأكثر شيوعا لTAAS في البشر 25. ومع ذلك، وعلى النقيض من تمدد AngII التي يسببها، لا ترتبط TAAS AngII التي يسببها مع ارتفاع الكولسترول وليس لديهم الفروق بين الجنسين.

الهدف العام المتمثل في ضخ AngII تحت الجلد في الفئران هو دراسة الخصائص المرضية والآليات الجزيئية للتمدد وTAAS.

Protocol

بيان الأخلاق: يتم إجراء دراسات الفأرة مع موافقة من جامعة كنتاكي المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC البروتوكول رقم: 2006-0009). يصرح باستخدامها الفئران في إنهاء باستخدام كوكتيل جرعة زائدة من الكيتامين (~ 210 ملغ / كلغ) وزيلازين (~ 30 ملغ / كلغ).

1. حساب AngII المبلغ

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول مثال ضخ AngII (1000 نانوغرام / كغ / دقيقة) لمدة 4 أسابيع في 4 الذكور مستقبلات LDL - / - تغذية الفئران حمية التخصيب الدهون المشبعة.

  1. تزن دراسة الفئران قبل احتساب مبلغ AngII اللازمة للتسريب.
  2. استخدام القالب (الجدول 1) لحساب كتلة AngII اللازمة للتجربة. استخدام "معدل يعني ضخ" المشار إليها في التعليمات مضخات باسم "معدل الضخ" في الخطوة 4 من القالب. في القالب، سجل الخطوات 1-5 يدويا، وخطوات 6-10 تحسب تلقائيا.
    1. في القالب، افترض أنسوف الفئران كسب 1 غرام من وزن الجسم خلال ضخ AngII 1000 نانوغرام / كغ / دقيقة لمدة 4 أسابيع.
      ملاحظة: قد يكون لكل ماوس مختلفة جدا الزيادة في وزن الجسم من شأنها أن تعتمد على العديد من المتغيرات، مثل سلالة الماوس والنظام الغذائي. نحن نستخدم بشكل روتيني "0" أو "1 ز" بناء على خبرتنا من الدراسات السابقة.
    2. حساب الحجم الكلي 300 ميكرولتر من محلول AngII لكل الماوس لأن كل مضخة تتطلب ما يقرب من 250 ميكرولتر.

2. حل من AngII

  1. متجر مجفف بالتجميد قارورة AngII في -20 ° C. تتوازن قارورة AngII لRT قبل الافتتاح.
  2. تزن كتلة AngII المحسوبة (7.3 ملغ كما هو مبين في الجدول رقم 1) في أنبوب بلاستيكية معقمة.
    ملاحظة: مؤشر ميرك لكل، لا تستخدم أنابيب زجاجية لحل منذ محلول مائي من AngII له صلة قوية للربط إلى الزجاج.
  3. إضافة حجم المحسوبة لملحي معقم (1200 μل) في أنبوب من البلاستيك تحتوي على مجفف بالتجميد AngII، وكأب، ومزيج دقيق من قبل انعكاس حتى حل واضح.
  4. أرقام التسمية الماوس # 1، # 2، # 3، # 4 وعلى الفردية أنابيب بلاستيكية معقمة مع قبعات (0،5-1،5 مل). يعد حل AngII تحت غطاء الصفحي لكل الماوس على أساس وزن الجسم كما المحسوبة في الخطوة 1.2 و الجدول 1.
    1. على سبيل المثال، ماصة 3.6 ملحي معقم ميكرولتر في أنبوب رقم 1، ثم 296.4 ميكرولتر AngII الحل، ومزيج دقيق من قبل pipetting صعودا وهبوطا بلطف.
  5. أرقام التسمية الماوس على أنابيب من البلاستيك مع قبعات (4 مل، معقمة). وسوف تستخدم هذه لاحتضان مضخات كما هو موضح في الخطوة 3.13.

3. الأسموزي مضخة تعبئة

  1. الحصول على مضخات في جزأين منفصلين: الجزء الرئيسي من المضخة ومشرف تدفق (الشكل 1). كل مربع يحتوي الهيئات 10 مضخة والمشرفين تدفق التي ملفوفة بشكل فردي. تسجيل الكثير الرقم.
    ملاحظة: دائما ارتداءقفازات لأن الزيوت نقلها من يد إلى الغلاف الخارجي للمضخات يؤثر سلبا على ضخ وظيفة. استخدام قفازات معقمة والشاش، وأنابيب، وملء الإبرة، وتزن القوارب لإعداد مضخات، لتجنب خطر العدوى من الزرع.
  2. فقط فتح عدد من الهيئات مضخة والمشرفين تدفق اللازمة للدراسة، وهذه لا يمكن خزنها فتحت مرة واحدة. إذا كانت هناك حاجة أكثر من 10 مضخات، تأكد من أن الكثير أعداد المضخات هي نفسها لدراسة واحدة، منذ مضخات من أرقام مختلفة ومختلفة الحجم المتوسط ​​التعبئة ومضخة أسعار.
  3. تزن كل مضخة (بما في ذلك كل من الجسم الرئيسي وتدفق المشرف)، ولاحظ الوزن إلى 4 منازل عشرية (على سبيل المثال، 1.1443 غرام من الماوس # 1). هذا الوزن، ويطلق عليه "مضخة الوزن فارغة" في القالب (الجدول 1)، وسوف تستخدم لحساب نسبة شغلها.
  4. إرفاق مضخة تعبئة الإبرة إلى حقنة معقمة 1 سم مكعب وملء بعناية المحاقن مع حل AngII من نحو مناسبأنبوب بلاستيكي معدودة. من المهم تجنب سحب الهواء في حقنة.
  5. إزالة جميع فقاعات الهواء بعناية من حقنة أثناء وضع الإبرة إلى أسفل. الحفاظ على إبرة / محقنة في هذا الموقف لمنع دخول فقاعات في المضخة.
  6. إدراج بلطف الإبرة ملء في الجسم مضخة. تقدم غيض من الإبرة إلى المضخة. لا تضع رأس الإبرة بإحكام على الجزء السفلي من المضخة.
  7. دفع المكبس حقنة ببطء لملء المضخة مع حل AngII. A الظل الداكن داخل المضخة يشير إلى مستوى التعبئة. حجم ملء ما يقرب من 246 ميكرولتر، في التعليمات.
  8. وقف ملء المضخة وإزالة بعناية إبرة في أقرب وقت حبة من السائل ترتفع من المضخة.
  9. إدراج مشرف التدفق إلى مضخة من خلال ثقب في أعلى جسم المضخة حتى يتم النظر إلى وجود فجوة بين رئيس مشرف تدفق والجزء العلوي من الجسم مضخة (الشكل 1).
  10. ادراج moderatأو في جسم المضخة يؤدي إلى بعض تسرب السائل من افتتاح مشرف التدفق. وصمة عار بعناية جميع السوائل الزائدة التي قد تسربت خلال وضع المشرفين.
  11. تزن المضخة شغلها. تسجيل وزن تحت "مضخة الوزن معبأ" في القالب.
  12. حساب ملء نسبة (٪) = (مضخة الوزن "شغل" - "فارغ") × 1000 / يعني ملء حجم × 100.
    1. حساب نسبة ملء كما هو مبين في الجدول رقم 1. ومن الناحية المثالية، ينبغي ملء نسبة تكون مساوية أو أكبر من 100٪. مضخة الملء إذا كانت نسبة الملء هو <95٪ (فى اشارة الى ان فقاعات الهواء قد تكون موجودة في مضخة).
  13. وضع مضخة شغل في المسمى 4 مل أنبوب (الخطوة 2.5) مع رئيس مشرف تواجه التصاعدي. إضافة كمية كافية من المياه المالحة عقيمة لتغطية المضخة. الحفاظ مضخة في أنبوب من المياه المالحة حتى الزرع.
  14. أنابيب مكان في حاضنة 37 درجة مئوية. احتضان مضخات O / N (لا يقل عن 12 ساعة) للسماح فتيلة الجزئي، ومن ثم زرع في الفئران. مضخةجي من AngII يبدأ ما يقرب من 24 ساعة بعد الزرع، والذي يسمح الفئران للتعافي من عملية جراحية قبل أي ضغوط محتملة تنشأ أثناء AngII التسريب.

4. التحضير لزرع مضخة

  1. الأوتوكلاف (الوضع خطورة، دورة الجافة، 15 دقيقة) الشاش، ومسحات قطنية والأدوات الجراحية بما في ذلك مقص، مرقئ، ملقط، والدبابيس، ودباسة 1 في اليوم على الاقل قبل الجراحة.
  2. في غرفة الإجراءات، وإعداد المرذاذ للتخدير باستخدام الأيزوفلورين. فتح الستائر معقمة في غطاء تدفق الصفحي، ووضع مخروط الأنف للتخدير الأيزوفلورين. وضع betadine، و 70٪ من الإيثانول، الماء المعقم، حبة تعقيم، handrub مطهر، ومسحات والشاش، ومضخات شغل في غطاء الصفحي.
  3. دون قناع وثوب، ثم تفتح الستارة الخارجية في غطاء الصفحي مع الأيدي النظيفة. وضعت على قفازات معقمة وفتح حزمة داخل معقمة.

5. إجراء العمليات الجراحية لزرع مضخة

  1. مكان الماوس في شام التعريفيالبر مع تدفق الأيزوفلورين بمعدل تدفق 1،5-2٪. رصد الماوس لعدد إضافي من 2-3 دقيقة بعد الاستلقاء. حلاقة منطقة حول حجم ربع، على الكتف الأيسر أو الأيمن.
  2. ضع الماوس في غطاء محرك السيارة الصفحي، مع أنفها مطاردة مع مخروط متصلة تدفق الأيزوفلورين (الشكل 2A). وضع رئيس الماوس نحو يدك المهيمنة الجراح. استخدام البيطري مرهم على العينين الماوس لمنع جفاف بينما تحت التخدير. تأكد من أن الفأر لديه أي رد على تحفيز الألم قبل الجراحة. على سبيل المثال، استجابة دواسة يعد مؤشرا جيدا للألم.
  3. المسحة ومسح منطقة حلق مع betadine تليها ثلاث مناديل مع 70٪ من الإيثانول. دون تغيير أو قفازات معقمة.
  4. استخدام مشرط جراحي لإجراء سم شق ~ 1 خلف الأذن على الكتف من الساق الأمامية. وينبغي أن يكون هذا شق عمودي على الذيل. استخدام الرعاية لقطع أنسجة الجلد فقط وليس الكامنة.
  5. عقد forcالعائد على السهم في يد واحدة لفتح الشق، واستخدام اليد الأخرى لجعل نفق تحت الجلد تحت الجلد باستخدام مرقئ (الشكل 2B).
  6. تقدم مرقئ طرف تجاه الذيل، وخلق جيب للمضخة. يتم ذلك عن طريق فتح بعناية بين فكي مرقئ تحت الجلد لفتح الحقيبة. سحب مرقئ من شق.
  7. إدراج مضخة في شق مع رئيس مشرف وضعه على الجزء الخلفي من الماوس (الشكل 2C). دفع بلطف مضخة تماما في الجيب. يجب أن يكون هناك مساحة كافية لإغلاق الجرح مع أي توتر أو شد الجلد.
  8. مرة واحدة وقد تم إدراج مضخة، قرصة بقوة كلا الجانبين من شق، واستقامة الحواف بحيث تلبي، ووضع 1 أو 2 الجرح لقطات لإغلاق (الشكل 2D). تفقد موقع شق لضمان عدم وجود إغلاق كامل للجرح، وأن المضخة لا تضغط مباشرة على الموقع.
  9. تطبيق موضعي كريم يدوكائين(4٪ وزن / وزن) مع تنظيف الماوس القطن swab.Remove من مخروط الأنف، ووضعه على وسادة التدفئة حتى يستعيد وعيه. بعد تعافيه، وعاد الماوس لقفصه.
  10. وضع الأدوات الجراحية في التعقيم حبة لمدة 10 ثانية بين الفئران. تسمح أدوات ليبرد قبل الاستخدام. قفازات نظيفة مع handrub مطهر بين الفئران. رصد جميع الفئران حتى يتحقق الشفاء التام.
  11. مراقبة عن كثب الفئران بعد الجراحة. حقن البلعة من ملحي معقم (0،2-0،3 مل) تحت الجلد إذا تبين ماوس علامات الشدة، والجفاف أو فقدان الوزن واضحة. مراقبة الفئران على الأقل مرتين في اليوم خلال 10 أيام الأولى، ومرة ​​واحدة على الأقل كل يوم في وقت لاحق. إجراء تشريح على الفور إن وجدت الفئران تموت أثناء AngII التسريب. إزالة مقاطع الجرح بين 7-14 أيام بعد الجراحة.

6. حصاد، إصلاح، تنظيف، والتصوير من Aortas

  1. خفض فتح الصدر الماوس وتجاويف البطن من الناحية البطنية، خفض مكتب مستشار رئيس الوزراءن الأذين الأيمن، يروي مع المياه المالحة من خلال البطين الأيسر من القلب لإزالة الدم في الشريان الأبهر، ومن ثم حصاد الشريان الأورطي 27.
  2. وضع aortas حصادها في أنابيب بلاستيكية تحتوي على 3 مل على الأقل من 4٪ لامتصاص العرق أو 10٪ من الفورمالين مخزنة بشكل محايد ل24 - 48 ساعة 27.
  3. إزالة الأنسجة الغلالة البرانية بعناية. الشريان الأورطي دبوس على الشمع الأسود مع دبابيس. الحصول على صور الأورطي مع نفس التكبير. تشمل الحاكم في كل صورة للمعايرة، كما هو مبين في الشكل (3).

7. أون التصوير مواجهة Aortas

  1. قطع الشريان الأبهر مفتوحة طوليا من خلال انحناء الخارجي والداخلي من قوس الأبهر، وقطع الفروع الرئيسية مفتوحة بما في ذلك اللامسماة، الشريان السباتي الأيسر، والشريان تحت الترقوة الأيسر. دبوس الشريان الأورطي شقة مع براني الخارجية زرع المجاورة لالشمع الأسود.
  2. الحصول أون الصورة مواجهة سطح باطنة الأبهر في نفس التكبير. تشمل الحاكم في كل صورة للمعايرة، كما تظهرن في الشكل (4).

Representative Results

الموت الرحيم كانت الفئران الموضحة في قسم البروتوكول بعد 4 أسابيع من AngII التسريب - 4 الذكور مستقبلات LDL - /. تم حصاد Aortas، وتنظيفها، وتصوير لتصور التوسعات الأبهري. كما هو مبين في الشكل (3)، aortas لها عدة خصائص مختلفة بما في ذلك التوسع في المنطقة الكظرية (تمدد؛ الشكل 3A)، والتوسع في المنطقة تصاعدي (TAAS؛ الشكل 3B)، أو التوسع في المنطقتين (وجود كل من التمدد وTAAS؛ الشكل 3C)، في حين التشكل في الماوس واحد كان بشكل فاضح وضعها الطبيعي (الشكل 3D). وكميا تمدد الشريان الأورطي البطني عن طريق قياس خارج الحي العرض القصوى من المنطقة الكظرية، كما يتضح من الخط الأحمر في الشكل 3A. لقياس تصاعدي تمدد الشريان الأورطي، وقطعت aortas مفتوحة ومعلقة كما هو مبين في الشكل (4). وقد تم قياس مساحة السطح باطنة في المنطقة الأبهر الصاعد (منطقة محاطة عشرخطوط حمراء الإلكترونية في الشكل 4A) ل quantitate TAAS. وأدرج الحاكم في كل صورة لتوحيد المقاييس، كما هو مبين في كلا الرقمين 3 و 4.

الشكل 1
الشكل 1. صورة الممثل من شغل مضخة التناضحي تحتوي كل مضخة جزأين منفصلين: هيئة الرئيسي والمشرف التدفق. بعد ملء جسم المضخة مع AngII، يتم إدراج مشرف تدفق لختم المضخة.

الرقم 2
الشكل 2. عملية جراحة زرع مضخة (A) يتم وضع الماوس في غطاء الصفحي مع مخروط الأنف الذي هو مستمر الإفراج الأيزوفلورين والأكسجين؛ يتم إدخال (B) A مرقئ على التوالي في شق الجلد لجعل نفق تحت الجلد. يتم إدخال (C) مضخة من خلال شق الجلد بلطف. وتدبيس (D) شق الجلد بعد ضخ الإدراج.

الشكل (3)
الشكل 3. الصور الأبهري (خارج الجسم الحي) من الفئران التي غرست مع AngII AngII 1000 نانوغرام / كغ / وقد أكسب دقيقة في LDL مستقبلات الذكور - / - الفئران لمدة 28 يوما. (A) تمدد يرافقه تجلط الدم. خط أحمر (2.05 ملم) يظهر قياس عرض الأبهر القصوى في المنطقة الكظرية. (B) تصاعدي تمدد الشريان الأورطي (TAA) مع الشريان الأورطي البطني العادي بشكل صارخ. (C) التوسعات عميقة في كل من المناطق الأبهر الصاعد والكظرية (TAAS وتمدد)؛ (D) الشريان الأورطي العادي بشكل صارخ مع عدم وجود تمدد واضح إما تصاعدي أو منطقة الأبهري الكظرية.

4.jpg و"/>
الرقم 4. أون الصور مواجهة المناطق الأبهر الصدري من الفئران يملؤه AngII AngII 1000 نانوغرام / كغ / وقد أكسب دقيقة في الذكور مستقبلات LDL - / - الفئران لمدة 28 يوما. مساحة التي حددها خط أحمر تمثل المنطقة الأبهر الصاعد بما في ذلك جزء من قوس الأبهر.

1 الجرعة المطلوبة 1000 نانوغرام / كغ / دقيقة
2 بدء وزن الجسم (أكبر الماوس) 24.8 ز
3 إجمالي الزيادة في وزن الجسم المقدرة 1 ز
4 معدل الضخ 0.25 ميكرولتر / ساعة
5 نوmber من الفئران 4
6 الجرعة كل ساعة للحيوان 1518 نانوغرام
7 اضرب المطلوبة 6072 نانوغرام / ميكرولتر
8 300 حل المجاهدين 1.82 ملغ / 300 ميكرولتر
SOLUTION هناك حاجة
9 مجموع AngII (ملغ) 7.3 ملغ
10 الذائبة في المياه المالحة و# 160؛ 1200 ميكرولتر
فأر وزن الجسم عامل التخفيف الحجم (ميكرولتر) مضخة الوزن (ز) نسبة شغل
# (ز) AngII ملحي فارغ متخم (٪)
1 24.5 1.0 296.4 3.6 1.1443 1.3877 99
2 23.0 0.9 278.2 21.8 1.1677 1.4145 100
3 24.8 1.0 300.0 0.0 1.1438 1.3904 100
4 21.8 0.9 263.7 36.3 1.1438 1.3904 100
تخفيف عامل = وزن الجسم من وزن الفأر / جسم من أكبر الماوس
فأر وزن الجسم عامل التخفيف الحجم (ميكرولتر) مضخة الوزن (ز) نسبة شغل
# (ز) AngII ملحي فارغ متخم (٪)
1 24.5 1.0 296.4 3.6 1.1443 1.3877 99
2 23.0 0.9 278.2 21.8 1.1677 1.4145 100
3 24.8 1.0 300.0 0.0 1.1438 1.3904 100
4 21.8 0.9 263.7 36.3 1.1438 1.3904 100

الجدول 1: حساب للتسريب 28 يوما عن طريق المضخات الأسموزية.

Discussion

مضخات التناضحي تقديم AngII تحت الجلد هو نهج روتيني لإحداث تمدد الشريان الأورطى في الفئران. استنادا إلى بيانات من العديد من المختبرات، كانت هناك نتائج متسقة أن هذه هي طريقة موثوق بها وقابلة للتكرار لدراسة كل تمدد 3،4 وTAAS 22-26 في الفئران. ولذلك، يعتبر هذا نموذج الفأر نموذجا يلخص العديد من الميزات من تمدد الشريان الأورطى الإنسان، ورؤى الآلية الخاصة بمثل هذه الأمراض المدمرة.

بينما الشيخوخة هو أحد عوامل الخطر لتمدد في البشر، فإنه لم يدرس بشكل منهجي للتمدد AngII التي يسببها في الفئران. ومع ذلك، يبدو حدوث وشدة تمدد AngII التي يسببها تشبه في الفئران في سن 8-48 أسابيع 4،5،7. حاليا، لا يوجد سوى عدد قليل من الدراسات الإبلاغ TAAS AngII التي يسببها في الفئران في سن 8-24 أسابيع 22-26، والتي لم تظهر الفروق المرتبطة بالعمر واضحة على تشكيل TAA.

الفئران الإناث لديهم معدلات أقل بكثير من التمدد من الفئران الذكور التي غرست مع AngII 4،28. ومن الجدير بالذكر أيضا أن وقوع AngII التي يسببها التمدد هو أعلى من ذلك بكثير في فرط من الفئران normo-cholesterolemic، التي هي أكثر من 50٪ مقابل أقل من 30٪، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، وتمزق الأبهر المتكرر (حوالي 10-30٪) في كل من الفئران normo- ومفرط كوليستيرول الدم خلال AngII التسريب. ضخ AngII بمعدل 1000 نانوغرام / كغ / دقيقة في الفئران مفرط كوليستيرول الدم، مثل LDL مستقبلات - تغذية الفئران غذاء غربيا أو ئي (APOE) - - / / - تغذية الفئران اتباع نظام غذائي عادي أو غربي، له آثار القصوى على AAA تطوير 3،4،29. هذا المعدل التسريب هو الأمثل لدراسة شارك فيها التلاعب الجيني للاهتمام في الفئران مفرط كوليستيرول الدم ومن المتوقع للحد من التمدد. إذا كان من المتوقع التلاعب في الفئران مفرط كوليستيرول الدم لزيادة التمدد، فمن المستحسن للبث AngII بمعدل 500 نانوغرام / كغ / دقيقة أو أقل 30. في المقابل إلى التمدد، لا يوجد تجريبيجمعية nstrated بين الجنسين من الذكور أو ارتفاع الكولسترول وAngII التي يسببها TAAS 25. ومع ذلك، على غرار تمدد، إذا كان من المتوقع التلاعب في الجينات التي تهم زيادة TAAS، نوصي معدل ضخ أقل من 1000 نانوغرام / كغ / دقيقة لAngII التسريب.

ومن المهم أيضا أن نعرف أن حدوث وشدة تمدد الشريان الأورطى AngII التي يسببها تختلف بين الفئران الفردية وبين الدراسات. إذا الفئران لا تتطور تمدد الشريان الأورطى، إمكانية محتملة واحدة هي أن AngII قد لم يتم تسليمها بنجاح في الفئران. للتأكد من صحة معدل ضخ عالية من AngII، مثل 1000 نانوغرام / كغ / دقيقة، وينصح بقياس ضغط الدم قبل وأثناء، AngII التسريب باستخدام غير الغازية طريقة الذيل الكفة 31. AngII ضخ بمعدل 1000 نانوغرام / كغ / دقيقة يزيد ضغط الدم الانقباضي لدى الفئران. أيضا، يمكن قياس تركيزات الرينين البلازما خلال AngII التسريب أو في إنهاء منذ AngII ديه ردود فعل سلبية على صإفراز العينين. ولذلك، AngII ضخ يؤدي إلى تخفيضات في تركيزات الرينين البلازما. إذا كان الماوس يملؤه AngII لا يوجد لديه الأمراض الظاهرة الأبهري، أي زيادة ضغط الدم، وأي انخفاض تركيز الرينين البلازما، فإنه يشير إلى أن AngII لم يتم تسليمها بكفاءة من خلال زرع مضخة صغيرة التناضحي. نود أن نوصي إزالة هذا الفأر من الدراسة. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن بعض الفئران لا تتطور تمدد الشريان الأورطى على الرغم من زيادة الضغوط الدم الانقباضي وانخفضت تركيزات الرينين البلازما. ينبغي أن تظل هذه الفئران في الدراسة.

باختصار، ويتحقق AngII التسريب عن طريق زرع تحت الجلد باستخدام مضخات التناضحي للحث على تمدد الشريان الأورطى في الفئران. هذه الطريقة توفر AngII باستمرار بمعدل محددة لفترات المعينة التي تستخدم لدراسة كل تمدد وTAAS.

Disclosures

برعاية نشر هذا المقال من قبل Alzet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Angiotensin II Bachem H-1705 compound used to induce aortic aneurysms
Alzet Osmotic Pumps DURECT Corporation Alzet Model 2004 feasible for 28-day infusion in mice weighed > 20 g
Saturated fat-enriched diet Harlan Teklad TD.88137 42% calories/calories to stimulate hypercholesterolemia in LDL receptor -/- mice

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pyo, R., et al. Targeted gene disruption of matrix metalloproteinase-9 (gelatinase B) suppresses development of experimental abdominal aortic aneurysms. J Clin Invest. 105 (11), 1641-1649 (2000).
  2. Chiou, A. C., Chiu, B., Pearce, W. H. Murine aortic aneurysm produced by periarterial application of calcium chloride. J Surg Res. 99 (2), 371-376 (2001).
  3. Daugherty, A., Cassis, L. Chronic angiotensin II infusion promotes atherogenesis in low density lipoprotein receptor -/- mice. Ann NY Acad Sci. 892 (1), 108-118 (1999).
  4. Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. J Clin Invest. 105 (11), 1605-1612 (2000).
  5. Deng, G. G., et al. Urokinase-type plasminogen activator plays a critical role in angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm. Circ Res. 92 (5), 510-517 (2003).
  6. King, V. L., Trivedi, D., Gitlin, J. M., Loftin, C. D. Selective cyclooxygenase-2 inhibition with celecoxib decreases angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (5), 1137-1143 (2006).
  7. Uchida, H. A., Poduri, A., Subramanian, V., Cassis, L. A., Daugherty, A. Urokinase-type plasminogen activator deficiency in bone marrow-derived cells augments rupture of angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (12), 2845-2852 (2011).
  8. Wang, Y. X., et al. Angiotensin II increases urokinase-type plasminogen activator expression and induces aneurysm in the abdominal aorta of apolipoprotein E-deficient mice. Am J Pathol. 159 (4), 1455-1464 (2001).
  9. Bruemmer, D., et al. Angiotensin II-accelerated atherosclerosis and aneurysm formation is attenuated in osteopontin-deficient mice. J Clin Invest. 112 (9), 1318-1331 (2003).
  10. Gavrila, D., et al. Vitamin E inhibits abdominal aortic aneurysm formation in angiotensin II-infused apolipoprotein E-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (8), 1671-1677 (2005).
  11. Wang, J., et al. IgE actions on CD4+ T cells, mast cells, and macrophages participate in the pathogenesis of experimental abdominal aortic aneurysms. EMBO Mol Med. 6 (7), 952-969 (2014).
  12. Yoshimura, K., et al. Regression of abdominal aortic aneurysm by inhibition of c-Jun N-terminal kinase. Nat Med. 11 (12), 1330-1338 (2005).
  13. Usui, F., et al. Inflammasome activation by mitochondrial oxidative stress in macrophages leads to the development of angiotensin II-induced aortic aneurysm. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (1), 127-136 (2015).
  14. Mellak, S., et al. Angiotensin II mobilizes spleen monocytes to promote the development of abdominal aortic aneurysm in apoe-/- mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (2), 378-388 (2015).
  15. Krishna, S. M., et al. Peptide antagonist of thrombospondin-1 promotes abdominal aortic aneurysm progression in the angiotensin II-infused apolipoprotein-E-deficient mouse. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (2), 389-398 (2015).
  16. Norman, P. E., Curci, J. A. Understanding the effects of tobacco smoke on the pathogenesis of aortic aneurysm. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (7), 1473-1477 (2013).
  17. Daugherty, A., Powell, J. T. Recent highlights of ATVB: aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 691-694 (2014).
  18. Liu, J., Daugherty, A., Lu, H. Angiotensin II and abdominal aortic aneurysms: an update. Curr Pharm Design. , (2015).
  19. Rateri, D. L., Howatt, D. A., Moorleghen, J. J., Charnigo, R., Cassis, L. A., Daugherty, A. Prolonged infusion of angiotensin II in apoE(-/-) mice promotes macrophage recruitment with continued expansion of abdominal aortic aneurysm. Am J Pathol. 179 (3), 1542-1548 (2011).
  20. Saraff, K., Babamusta, F., Cassis, L. A., Daugherty, A. Aortic dissection precedes formation of aneurysms and atherosclerosis in angiotensin II-infused, apolipoprotein E-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (9), 1621-1626 (2003).
  21. Daugherty, A., Cassis, L. A., Lu, H. Complex pathologies of angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms. J Zhejiang Univ Sci B. 12 (8), 624-628 (2011).
  22. Daugherty, A., Rateri, D. L., Charo, I. F., Owens, A. P., Howatt, D. A., Cassis, L. A. Angiotensin II infusion promotes ascending aortic aneurysms: attenuation by CCR2 deficiency in apoE-/- mice. Clin Sci (Lond). 118 (11), 681-689 (2010).
  23. Rateri, D. L., et al. Endothelial cell-specific deficiency of Ang II type 1a receptors attenuates Ang II-induced ascending aortic aneurysms in LDL receptor-/- mice). Circ Res. 108 (5), 574-581 (2011).
  24. Rateri, D. L., et al. Depletion of endothelial or smooth muscle cell-specific angiotensin II type 1a receptors does not influence aortic aneurysms or atherosclerosis in LDL receptor deficient mice. PLoS One. 7 (12), 10-1371 (2012).
  25. Rateri, D. L., et al. Angiotensin II induces region-specific medial disruption during evolution of ascending aortic aneurysms. Am J Pathol. 184 (9), 2586-2595 (2014).
  26. Davis, F. M., et al. Smooth muscle cell deletion of low-density lipoprotein receptor-related protein 1 augments angiotensin II-induced superior mesenteric arterial and ascending aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (1), 155-162 (2015).
  27. Daugherty, A., Rateri, D. Development of experimental designs for atherosclerosis studies in mice. Methods. 36 (2), 129-138 (2005).
  28. Henriques, T. A., Huang, J., D'Souza, S. S., Daugherty, A., Cassis, L. A. Orchidectomy, but not ovariectomy, regulates angiotensin II-induced vascular diseases in apolipoprotein E-deficient mice. Endocrinology. 145 (8), 3866-3872 (2004).
  29. Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Antagonism of AT2 receptors augments angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms and atherosclerosis. Br J Pharmacol. 134 (4), 865-870 (2001).
  30. Wang, S., et al. Deficiency of receptor-associated protein attenuates angiotensin II-induced atherosclerosis in hypercholesterolemic mice without influencing abdominal aortic aneurysms. Atherosclerosis. 220 (2), 375-380 (2011).
  31. Daugherty, A., Rateri, D., Lu, H., Balakrishnan, A. Measuring blood pressure in mice using volume pressure recording, a tail-cuff method. J Vis Exp. (27), e1291 (2009).

Tags

الطب، العدد 103، مضخة التناضحي، والتسريب تحت الجلد، أنجيوتنسين، تمدد الشريان الأورطى البطنى
تحت الجلد أنجيوتنسين II تسريب باستخدام الأسموزي مضخات يقنع الأورطي تمدد الأوعية الدموية في الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lu, H., Howatt, D. A., Balakrishnan, … More

Lu, H., Howatt, D. A., Balakrishnan, A., Moorleghen, J. J., Rateri, D. L., Cassis, L. A., Daugherty, A. Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice. J. Vis. Exp. (103), e53191, doi:10.3791/53191 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter