Het is van cruciaal belang in de neurobiologie en neurovirologie om een betrouwbaar, reproduceerbaar in vitro systeem te hebben dat dient als een translationeel model voor wat zich in vivo in menselijke neuronen voordoet. Dit protocol beschrijft hoe SH-SY5Y humane neuroblastomacellen te kweken en te differentiëren in levensvatbare neuronen voor gebruik in in vitro toepassingen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Differentiatie van de SH-SY5Y Human Neuroblastoom Cell Line
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het beschikken over geschikte in vivo en in vitro systemen die translationele modellen voor menselijke ziekten bieden, is een integraal onderdeel van onderzoek in de neurobiologie en de neurowetenschappen. Traditionele in vitro experimentele modellen die in de neurobiologie worden gebruikt, omvatten primaire neuronale culturen van ratten en muizen, neuroblastoomcellijnen, waaronder rat B35 en muis Neuro-2A cellen, rat PC12 cellen en kortetermijnsnedecultures. Hoewel veel onderzoekers op deze modellen vertrouwen, ontbreekt er een menselijke component en de waargenomen experimentele effecten kunnen exclusief zijn voor de respectieve soorten en komen mogelijk niet identiek voor bij mensen. Bovendien, hoewel het neuronen zijn, kunnen deze cellen onstabiele karyotypen hebben, waardoor hun gebruik problematisch is voor studies van genexpressie en reproduceerbare studies van celsignalering. Het is daarom belangrijk om meer consistente modellen van menselijke neurologische ziekten te ontwikkelen.
De volgende procedure beschrijft een eenvoudig te volgen, reproduceerbare methode om homogene en levensvatbare menselijke neuronale culturen te verkrijgen, door differentiatie van de chromosomaal stabiele menselijke neuroblastoomcellijn, SH-SY5Y. Deze methode integreert verschillende eerder beschreven methoden1-4 en is gebaseerd op sequentiële verwijdering van serum uit het medium. De tijdlijn omvat geleidelijke serum-starvatie, met introductie van extracellulaire matrix eiwitten en neurotrofe factoren. Dit stelt neuronen in staat te differentiëren, terwijl epitheliale cellen worden geselecteerd, wat resulteert in een homogene neuronale cultuur. Representatieve resultaten demonstreren de succesvolle differentiatie van SH-SY5Y neuroblastoomcellen van een initieel epitheelachtig celfenotype naar een meer uitgebreid en vertakt neuronaal fenotype. Dit protocol biedt een betrouwbare manier om homogene populaties van neuronale culturen te genereren die kunnen worden gebruikt voor verdere biochemische en moleculaire analyses, wat onderzoekers een nauwkeuriger translationeel model van menselijke infectie en ziekte biedt.
Inleiding
De mogelijkheid om te gebruiken in vitro model systeem is sterk verbeterd op het gebied van neurobiologie en de neurowetenschappen. Cellen in cultuur zorgen voor een efficiënt platform om eiwitten functionaliteit en moleculaire mechanismen van specifieke verschijnselen te karakteriseren, aan de pathologie van de ziekte en infecties te begrijpen, en de voorlopige drugstests evaluaties uit te voeren. In neurobiologie, de belangrijkste soorten van celcultuur modellen omvatten primaire neuronale culturen afkomstig van ratten en muizen, en neuroblastoma cellijnen zoals ratten B35 cellen 5, Neuro-2A muizencellen 6, en ratten PC12 cel....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Algemene overwegingen
- Zie de tabel van Materialen / Apparatuur voor een lijst van noodzakelijke reagentia. Voer alle stappen onder strikte aseptische omstandigheden.
- Gebruik warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (hiFBS) voor alle media voorbereidingen die FBS bevatten. Aan hitte-geïnactiveerd, warm een 50 ml aliquot van FBS bij 56 ° C gedurende 30 min, omkeren elke 10 minuten (zie ook tabel 1).
Opmerking: Als FBS wordt zonder warmte-inactivatie, het epitheel fenotype sneller verloopt gedurende kweken van SH-SY5Y-cellen. - Voor gebruik, zodat media opwarmen en....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Momenteel zijn er veel gevallen op het gebied van neurobiologie en Neurovirology waarbij gedifferentieerde SH-SY5Y cellen als een functioneel model voor humane neuronen 27-36, en belangrijker nog, ongedifferentieerde cellen missen fenotypes worden gebruikt, zoals virale optimale opname 2 die noodzakelijk voor nauwkeurige interpretatie. Het is essentieel dat bij gebruik van SH-SY5Y cellen of andere in vitro neuronale systeem, cellen gedifferentieerde in neuronen, om gegevens die de best mog.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het bovenstaande protocol voorziet in een eenvoudige en reproduceerbare methode om homogene en levensvatbare menselijke neuronale culturen te genereren. Dit protocol maakt gebruik van technieken en praktijken die een aantal eerder gepubliceerde werkwijzen 1-4 en doelstellingen te integreren om de best practices van elkaar af te bakenen. Differentiatie van SH-SY5Y cellen berust op een geleidelijke serum deprivatie; de toevoeging van retinoïnezuur, neurotrofe factoren en extracellulaire matrixeiwitten; en serië.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We zijn dankbaar voor de bijdragen van Yolanda Tafuri bij het optimaliseren van de omstandigheden voor SH-SY5Y differentiatie, en voor de steun van Dr. Lynn Enquist, in wiens lab dit werk werd geïnitieerd. Y. Tafuri leverde de afbeeldingen die in Figuur 3 zijn getoond. Dit werk werd ondersteund door het NIH-NIAID Virus Pathogens Resource (ViPR) Bioinformatics Resource Center (MLS en L. Enquist) en K22 AI095384 (MLS).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| B-27 | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | Zie Tabel 1 voor voorbereiding |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | Sigma | SRP3014 (10 μg)/B3795 (5 μg) | Zie Tabel 1 voor voorbereiding |
| dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | Zie Tabel 1 voor voorbereiding |
| DMSO | ATCC | 4-X | - |
| Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) | Sigma | M5650 | - |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | Zie Tabel 1 voor voorbereiding |
| GlutamaxI | Life Technologies | 35050-061 | - |
| Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | - |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-1 | Zie Tabel 1 voor voorbereiding |
| MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution | Sigma | E0282 | Zie stap 11 van het protocol |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | - |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Life Technologies | 15140-122 | - |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Moet donker worden bewaard bij 4 °C omdat dit reagens lichtgevoelig is |
| SH-SY5Y Cells | ATCC | CRL-2266 | - |
| 0.5% Trypsin + EDTA | Life Technologies | 15400-054 | - |
| Falcon 35 mm TC dishes | Falcon (A Corning Brand) | 353001 | - |
Referenties
- Christensen, J., Steain, M., Slobedman, B., Abendroth, A. Differentiated Neuroblastoma Cells Provide a Highly Efficient Model for Studies of Productive Varicella-Zoster Virus Infection of Neuronal Cells. Journal of Virology. 85 (16), 8436-8442 (2011).
- Gimenez-Cassina, A., Lim, F., Diaz-Nido, J.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
