ヒトのニューロンで起こることの翻訳モデルとして機能する、信頼性のある複製可能なin vitroシステムを持つことは、神経生物学および神経ウイルス学において非常に重要です。このプロトコールでは、SH-SY5Yヒト神経芽腫細胞を培養し、in vitroアプリケーションで使用するための生存ニューロンに分化する方法を説明しています。
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この記事について
サマリー
要約
>jove_content<人間の疾患の翻訳モデルを提供する適切なin vivoおよびin vitroシステムを持つことは、神経生物学と神経科学の研究の不可欠な側面です。神経生物学で使用される従来のin vitro実験モデルには、ラットおよびマウスの初代ニューロン培養、ラットB35およびマウスNeuro-2A細胞を含む神経芽腫細胞株、ラットPC12細胞、および短期スライス培養が含まれます。多くの研究者がこれらのモデルに依存していますが、ヒトの要素がなく、観察された実験効果はそれぞれの種に限定されている可能性があり、ヒトでは同じようには発生しない可能性があります。さらに、これらの細胞はニューロンであるにもかかわらず、不安定な核型を持っている可能性があるため、遺伝子発現の研究や細胞シグナル伝達の再現性のある研究に使用が困難になります。したがって、ヒトの神経疾患のより一貫したモデルを開発することが重要です。
次の手順は、染色体的に安定なヒト神経芽腫細胞株SH-SY5Yを分化することにより、均一で生存可能なヒト神経細胞培養を得るための、従順で再現性のある方法を説明しています。この方法は、前述のいくつかの方法1〜4を統合し、培地からの血清の逐次除去に基づいています。タイムラインには、細胞外マトリックスタンパク質と神経栄養因子の導入を伴う、段階的な血清飢餓が含まれています。これにより、ニューロンは分化し、上皮細胞はそれに対して選択され、均一なニューロン培養が得られます。代表的な結果は、SH-SY5Y神経芽腫細胞が初期の上皮様細胞表現型から、より広範で分岐したニューロン表現型への分化に成功したことを示しています。このプロトコルは、その後の生化学的および分子的分析に使用できるニューロン培養の均質な集団を生成する信頼性の高い方法を提供し、研究者にヒトの感染および疾患のより正確な翻訳モデルを提供します。
概要
ビトロモデル系で使用する能力は、神経生物学と神経科学の分野を大幅に強化しました。培養中の細胞は、タンパク質の機能と特定の現象の根底にある分子メカニズムを特徴づけるために病気や感染症の病態を理解するために、予備薬物検査の評価を実施するための効率的なプラットフォームを提供します。神経生物学では、細胞培養モデルの主要なタイプは、ラットB35細胞5、ニューロ2Aマウスセル 6、およびラットPC12細胞を7としてラットおよびマウス、および神経芽細胞腫細胞株に由来する初代神経細胞培養物を含みます。このような細胞株の使用が大幅にフィールドを進めているが、非ヒト細胞および組織を処理に関連するいくつかの交絡因子が存在します。人間と比較した場合、これらは理解種特異的代謝過程の違い、病気の症状、および病原性の表現型が含まれます。ことに注意することも重要です再齧歯類モデルおよび経路は、げっ歯類およびヒト8-11との間で保存されているの理解の重要性の限界を強調し、マウスとヒトの遺伝子発現と転写因子のシグナル伝達の間に有意な差です。他のものはN-テラ-2（NT2）ヒト奇形癌細胞株および誘導多能性幹細胞（iPS細胞）を含むヒト神経細胞株の使用を採用しています。これらの細胞株は、 インビトロでのヒト・システムのための優れたモデルを提供します。しかしながら、レチノイン酸（RA）、ニューロン、星状細胞の混合集団の発生をもたらし、さらなる精製工....
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プロトコル
1.一般的な考慮事項
- 必要な試薬のリストについては、 マテリアル/機器の表を参照してください。厳格な無菌条件下で、すべての手順を実行します。
- FBSを含むすべてのメディアの準備のための熱不活性化ウシ胎児血清（hiFBS）を使用します。熱-不活性化するために、10分毎に反転、30分間56℃でFBS 50mlのアリコートを温める（ 表 1 参照）。
注：FBSを熱不活性化なしで使用される場合、上皮様表現型は、SH-SY5Y細胞の培養を通してより迅速に進行します。 - 使用前に、メディアが温め、すべてのステップの前に、適切なpHバランスを確立するためのインキュベーターで平衡化することを可能にします。例えば、培地の50mlを完全に平衡化するのに約1時間かかり液（pH 7、37℃、5％CO 2）。
注：このプロトコルは、部分的に分化したSH-SY5Y細胞をトリプシン処理し、再メッキされている必要があり2段階の分割手順を使用しています。これはストレスが多いですこれらの非常に脆弱な細胞のためのプロセス。したがって、最小限の時間のために、トリプシンで細胞をインキュベートすることが重要です。これはまだ皿に付着した上皮様細胞を残して、ニューロンの優先リフトオフが可能になります。 - 細胞を含有する円錐管の底部に対して先端と10ミリリットル....
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結果
現時点では、未分化SH-SY5Y細胞は、ヒトのニューロン27-36のための機能モデルとして使用されている神経生物学と神経ウイルス学の分野で多くのインスタンスがあり、重要なのは、未分化細胞である、そのような最適なウイルスの取り込み2のような表現型を欠いてもよいです正確な解釈のために必要な。 SH-SY5Y細胞または他のin vitroの神経系を使用する場合、細胞は適切にインビボで神経細胞に発生することができるものの可能な限り最高の表現であるデータを得るために、神経細胞に分化することが重要です。その後の生化学的およびイメージングのために使用することができる18日以内に高い生存、均質、分化した神経細胞の培養上プロトコル収率は、分析します。細胞を分化しつつ、未分化SH-SY5Y神経芽腫細胞は、外向きに延びる多数の短いプロセスと大、フラット、上皮様表現型（ 図2A）を実証しますsが周囲の細胞（ 図2B）に接続し、いくつかの神経突起の突起を有しています。 SH-SY5Y細胞の分化と、細胞は、ニューロンの.......
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ディスカッション
上記のプロトコルは、均質かつ実行可能な人間の神経細胞培養を生成するための簡単で再現性のある方法を提供します。このプロトコルは、いくつかの以前に公開された方法1-4を統合手法と実践を利用し、それぞれのベストプラクティスを描写することを目指しています。 SH-SY5Y細胞の分化は、緩やかな血清欠乏に依存しています。レチノイン酸、神経栄養因子および細胞外マトリックスタンパク質の添加。シリアル分割は分化し、成熟した付着性ニューロンを選択しました。この細胞株は、付着性と懸濁された細胞の異種集団として始まります。このプロトコルは、継代またはメディア変更前のPBS洗浄を源泉徴収することにより、両方の集団を維持することを目指していたが、懸濁された細胞のいくつかの損失が死んだ上皮細胞の除去を可能にすることが必要です。提示された方法は、更なる実験のために分化したヒトSH-SY5Y神経細胞の均質な集団を生成します。
パーソナルプラグインが、R剤は、コリン作動性またはアドレナリン作動性表現型16,17へのニューロンの分化を誘導するために使用することができ、S.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
SH-SY5Y分化のための条件の最適化におけるYolanda Tfuriの貢献と、この研究が始まった研究室のLynn Enquist博士の支援に感謝します。Y. Tafuriは図3に示す画像を提供しました。この研究は、NIH-NIAID Virus Pathogens Resource(ViPR)、Bioinformatics Resource Center(MLSおよびL. Enquist)、およびK22 AI095384(MLS)の支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| B-27 | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | <><脳 |
| 由来神経栄養因子 (BDNF) | Sigma | SRP3014 (10 μg)/B3795 (5 μg) | |
| ジブチリル環状AMP(db-cAMP) | グマ | D0627 | 調製については<>表<1>を参照してください |
| DMSO | ATCC | 4-X-Minimum | |
| Essential Medium Eagle (EMEM) | Sigma | M5650-Fetal | |
| Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | 調製については表 1 |
| GlutamaxI | Life Technologies | 35050-061-Glutamine | |
| Hyclone | SH30034.01 | - | |
| 塩化カリウム (KCl) | Fisher Scientific | BP366-1 | の調製については表 1 |
| シグマ | E0282 | プロトコルのステップ11を参照してください | |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | - |
| ペニシリン/ストレプトマイシン(ペン/連鎖球菌) | Life Technologies | 15140-122 | - |
| レチノイン酸(RA) | シグマ | R2625 | で4°Cで保管する必要があります。この試薬は光感受性であるため、この試薬は光感受性 |
| SH-SY5Y細胞 | ATCC | CRL-2266-0.5 | |
| %トリプシン+ EDTA | ライフテクノロジー | ズ15400-054 | - |
| ファルコン35ミリメートルTC皿 | ファルコン(コーニングブランド) | 353001 | - |
参考文献
- Christensen, J., Steain, M., Slobedman, B., Abendroth, A. Differentiated Neuroblastoma Cells Provide a Highly Efficient Model for Studies of Productive Varicella-Zoster Virus Infection of Neuronal Cells. Journal of Virology. 85 (16), 8436-8442 (2011).
- Gimenez-Cassina, A., Lim, F., Diaz-Nido, J.
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再版と許可
