Las espinas dendríticas de las neuronas piramidales son los sitios de la mayoría de las sinapsis excitadoras en la corteza cerebral de los mamíferos. Este método describe un análisis cuantitativo 3D de morfologías de la columna vertebral en las neuronas glutamatérgicas piramidal corticales humanos derivadas de células madre pluripotentes inducidas.
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Artículo de método
La cuantificación tridimensional de espinas dendríticas de piramidal neuronas derivadas de células madre humanas pluripotentes inducidas
En este artículo
Resumen
Resumen
Las espinas dendríticas son pequeñas protuberancias que corresponden a los compartimentos post-sinápticos de las sinapsis excitadoras en el sistema nervioso central. Se distribuyen a lo largo de las dendritas. Su morfología es dependiente en gran medida de la actividad neuronal, y son dinámico. Las espinas dendríticas expresan receptores glutamatérgicos (receptores AMPA y NMDA) en su superficie y en los niveles de densidades postsinápticas. Cada columna vertebral permite la neurona para controlar su actividad estatal y local de manera independiente. Morfologías la columna vertebral han sido ampliamente estudiados en las células piramidales glutamatérgicas de la corteza cerebral, el uso de ambos enfoques in vivo y cultivos neuronales obtenidas a partir de tejidos de roedores. Condiciones neuropatológicos pueden estar asociados a la inducción de la columna vertebral y la maduración alterada, como se muestra en roedores neuronas cultivadas y el análisis cuantitativo unidimensional 1. El presente estudio describe un protocolo para el análisis cuantitativo 3D de morfologías de columna usando cortic humanacol neuronas derivadas de células madre neurales progenitoras corticales (finales). Estas células se obtuvieron inicialmente a partir de células madre pluripotentes inducidas. Este protocolo permite el análisis de la morfología de la columna vertebral en diferentes períodos de la cultura, y con posibilidad de comparación entre las células madre pluripotentes inducidas obtenidos de individuos de control con los obtenidos a partir de pacientes con enfermedades psiquiátricas.
Introducción
Las espinas dendríticas de las neuronas piramidales corticales son protuberancias pequeñas y delgadas que se distribuyen a lo largo de las dendritas basales y apicales de estos subtipos neuronales en los roedores, primates, y el cerebro humano. Son los sitios de la mayoría de las sinapsis excitadoras y mostrar funciones clave en el aprendizaje y los procesos cognitivos. Las estructuras detalladas de las espinas dendríticas humanas se han estudiado técnicamente por microscopía electrónica 2. Sin embargo, este enfoque lleva mucho tiempo y representa la carga de trabajo pesado. Más recientemente, un tridimensional (3D) de reconstrucción de la morfología de la....
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Protocolo
1. Neuronal Cultura
Nota: la reprogramación de fibroblastos en células madre pluripotentes, el compromiso con el linaje telencéfalo dorsal, derivación, amplificación, y la banca de progenitores finales corticales (LCP) se describe en Boissart et al 4. La diferenciación neuronal de las células-LCP como también se realizó de acuerdo a Boissart et al 4 con ligeras modificaciones. Otros procedimientos han sido desarrollados para la reprogramación directa de los fibroblastos en células madre pluripotentes inducidas seguido por su diferenciación en neuronas. Este protocolo fue retenido ya que permite la pro....
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Resultados
El presente estudio describe un protocolo estandarizado para la columna vertebral cuantificación de las dendritas de las neuronas piramidales cultivadas derivadas de IPSC. Este protocolo permite el análisis de la maduración de la columna vertebral en las neuronas humanas y su posible relación con la maduración de espinas en cultivos neuronales roedores estándar, así como en modelos animales in vivo.
La figura 1A representa un esquema de las diferentes etapas d.......
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Discusión
La cuantificación de las características morfológicas de las neuronas piramidales se basó en el software. La interfaz Filament trazador se utilizó para la segmentación de las neuronas y espinas, y el módulo XT se utilizó para su análisis.
Analizar la precisión de nuestra técnica, lo primero que comparó los parámetros morfológicos medidos (longitud, superficie, volumen y total de la columna vertebral en su caso), con los publicados utilizando ratas neuronas piramidales maduros en la cultura <.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el Institut Pasteur, la fundación Bettencourt-Schueller, el Centre National de la Recherche Scientifique, la Universidad Paris Diderot, la Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), la Fundación Benéfica Conny-Maeva, la Fundación Cognacq Jay, la Fundación Orange y la Fundación Fondamental. L.G. cuenta con el apoyo de una beca de pregrado del Ministerio de Salud. Agradecemos la ayuda de BitPlane, en particular de Georgia Golfis, en la etapa inicial de este trabajo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| D-PBS (1x), sin Calcio, Magnesio y Fenol Rojo | Gibco/ Life Technologies | 14190169 | |
| Solución de poli-L-ornitina Biorreactivo | Sigma Aldrich | P4957 | |
| Laminina de ratón | Dutscher Dominique | 354232 | |
| N2 Suplemento | Gibco/ Life Technologies | 17502048 | |
| B-27 sin vitamina A (50 veces) | Gibco/ Life Technologies | 12587010 | |
| DMEM/NUT. MIX F-12 W/GLUT-I | Gibco/ Life Technologies | 31331028 | |
| Neurobasal Med SFM | Gibco/ Life Technologies | 21103049 | |
| 2-mercaptoetanol | Gibco/ Life Technologies | 31350-010 | |
| Penicilina-Steptomycin | Gibco/ Life Technologies | 15140-122 | |
| GFP Anticuerpo policlonal de suero de conejo | Gibco/ Life Technologies | A-6455 | |
| Suero de caballo | Gibco/ Life Technologies | 16050130 | |
| Alexa Fluor 488 Cabra Anti-Conejo | Gibco/ Life Technologies | A11034 | |
| Anticuerpo policlonal anti-tubulina betaIII | Millipore | AB9354 | |
| Cubreobjetos 13 mm | VWR | 631-0150 | |
| Reactivo antidecoloración Prolong Gold con DAPI | Gibco/ Life Technologies | P36931 | |
| Tween(R) 20 Bioextra, líquido viscoso | Sigma Aldrich Chimie | P7949 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich Chimie | X100-100ML | |
| Fibroblastos humanos Biorepositorio de | la línea celular de Coriell | GM 4603 y GM 1869 | Instituto Coriell para la Investigación Médica, Camden, NJ, EE. UU |
| Microscopio de barrido láser confocal | Zeiss (Alemania) | LSM 700 | |
| Imaris Software | Bitplane AG, versión | 6.4.0 | de Zúrich Filament Tracer y son necesarios los módulos Imaris XT |
| Huygens Software | Huygens software, SVI, Países Bajos | Versión Pro | Opcional (para pruebas de deconvolución) |
Referencias
- Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).
- Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J.
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