Abstract
Le cellule staminali neurali (NSC) nella zona subventricolare dei ventricoli laterali (SVZ) sostenere la neurogenesi olfattiva per tutta la vita nel cervello dei mammiferi. Hanno successivamente generano cellule transito amplificando (TAC) e neuroblasti che si differenziano in neuroni una volta che integrano i bulbi olfattivi. Emerging fluorescente cellule attivate ordinamento tecniche (FACS) hanno permesso l'isolamento di cellule staminali neurali e la loro progenie e hanno iniziato a far luce sulle reti di regolazione genica in nicchie neurogeni adulti. Riportiamo qui una tecnica separazione delle cellule, che permette di seguire e distinguere le dinamiche del ciclo cellulare delle popolazioni cellulari di cui sopra dalla SVZ adulto con un LeX / EGFR / CD24 colorazione tripla. Cellule isolate vengono poi placcati come cellule aderenti da scoprire dettagli loro progressione del ciclo cellulare mediante microscopia time-lapse video. A tal fine, usiamo transgenico fluorescenza Ubiquitinazione Indicatore ciclo cellulare (FUCCI) topi in cui le cellule sono di colore rosso fluorescente during G 1 fase a causa di un G 1 specifica giornalista rosso-CDT1. Questo metodo ha recentemente rivelato che le cellule staminali neurali proliferanti progressivamente allungano la loro fase G 1 durante l'invecchiamento, con conseguente perdita di valore neurogenesi. Questo metodo è facilmente trasponibile ad altri sistemi e potrebbe essere di grande interesse per lo studio della dinamica del ciclo cellulare delle cellule cerebrali nel contesto di patologie cerebrali.
Introduction
Cellule quiescenti staminali neurali (NSC) sono la fonte per neurogenesi adulta 1 e possono convertire in loro proliferante "attivato" forma che esprime i EGFR (aNSCs) 2. Una volta attivato, danno origine a cellule di transito amplificare (TAC) 3 e poi neuroblasti che migrano verso i bulbi olfattivi (OB) attraverso un tubo di astrociti e, infine, si differenziano in neuroni 4,5. NSC e la loro progenie sono organizzati in "nicchie" specializzati architetture lungo i ventricoli laterali, implicando una miriade di fattori che controllano la proliferazione 6. L'isolamento e la purificazione di cellule neurogena SVZ è necessario illuminare la regolazione molecolare complessa di loro proliferazione, ma sono rimasti una sfida per lungo tempo a causa della mancanza di marcatori specifici e tecniche adatte.
Nuovi approcci in citometria a flusso hanno reso possibile l'isolamento di cellule staminali neurali e their progenie dall'adulto SVZ 2,7-11. Usando il marcatore di cellule staminali LeX 12 lungo con neuroblasto marcatore CD24 13 e FEG a fluorescenza per etichettare EGFR in cellule proliferanti 2, abbiamo recentemente messo a punto una strategia FACS che permette la purificazione di cinque dei principali SVZ popolazioni neurogena: riposo e attivato NSC, TAC, immaturi nonché migrazione neuroblasti 9. Qui, descriviamo in dettaglio questa cella cernita e come Lex / EGFR / CD24 colorazione tripla permesso per la prima volta l'isolamento di entrambi NSC quiescenti e attivati.
Anche se la neurogenesi persiste durante l'età adulta, la produzione di nuovi neuroni è drasticamente diminuito nel cervello che invecchia 14. La maggior parte degli studi concordano su una progressiva riduzione del numero di cellule proliferanti progenitrici nella SGZ e SVZ 15-20. Le conseguenze non sono innocuo come il declino relativo all'età nella neurogenesi nel SVZ provoca una diminuzione di nneuroni ewborn nei bulbi olfattivi del cervello in età, in ultima analisi, che porta alla perdita di valore in una discriminazione olfattiva in età compresa tra 18 topi. Chiarire cinetica del ciclo cellulare dei progenitori neurali è un passo fondamentale per comprendere i meccanismi alla base dell'evoluzione della neurogenesi adulta durante l'invecchiamento. Recenti studi hanno indagato il ciclo cellulare e la progressione stirpe di cellule staminali neurali adulte in vitro 21 e in vivo, 22 ma nessuno di loro ha approfittato di tecniche di separazione delle cellule e le sonde del ciclo cellulare fluorescenti geneticamente codificate per visualizzare le fasi del ciclo cellulare delle cellule isolate a livello di singola cellula.
Qui si descrive un protocollo che sfrutta i topi transgenici Fucci in cui le cellule sono fluorescenti durante il loro ciclo cellulare, che permette la distinzione tra G 1 e SG 2 / M 23 fasi. Questo protocollo dimostra come potenziale isolamento di cellule staminali neurali e la loro progenie da adulto mi FUCCIce combinato con videomicroscopia time-lapse consente lo studio della dinamica del ciclo cellulare a livello di singola cellula.
Protocol
Questo protocollo è stato progettato in conformità alle Comunità europee Direttiva del Consiglio del 24 novembre 1986 (86/609 / CEE) ed è stato approvato dal nostro benessere degli animali comitato istituzionale (CETEA-CEA DSV IDF).
1. Basic Setup Prima di Cultura e Videomicroscopy
- Utilizzare vetro piastre di coltura fondo o μ-Piastre per la microscopia confocale il video. Per 1 - 5 x 10 3 cellule / pozzetto, utilizzare piastre a 96 pozzetti e piastre da 24 pozzetti per più di 5 x 10 3 cellule / pozzetto.
- Almeno un giorno prima dell'inizio dell'esperimento, preparare sterile poli-D-lisina (PDL) piastre rivestite per colture monostrato aderenti. Aggiungere abbastanza PDL (10 mg / ml in dH2O) per rivestire il fondo di ciascun pozzetto e incubare O / N a 37 ° C. Rimuovere la soluzione PDL e sciacquare tre volte con dH 2 O prima di consentire la piastra si asciughi nella cappa per almeno 2 ore, sotto flusso laminare. Se non utilizzato immediatamente, conservare la piastra rivestita in-20 ° C.
- Preparare terreno di coltura mescolando NSC Basal Medium e NSC proliferazione Supplemento a rapporto 9: 1 (vedi tabella Materiale) con 2 mg / eparina ml, 20 ng / ml purificato umano fattore di crescita epidermico ricombinante (EGF), e 10 ng / ml umano fibroblasti crescita fattore ricombinante 2 (FGF-2). Riscaldare il terreno di coltura a 37 ° C in un bagno d'acqua prima dell'uso.
- Per la dissociazione SVZ, preparare la soluzione di papaina: 1 mg / ml papaina (15 UI / ml) in Balance Salt Solution Earl (EBSS) contenente 0,2 mg / ml di L-cisteina, 0,2 mg / ml di EDTA, e 0,01 mg / ml DNasi I in PBS. Sterilizzare la soluzione passa attraverso un filtro da 0,2 micron. Equilibrare la soluzione a 37 ° C prima dell'uso.
- Per fermare la reazione enzimatica, preparare una soluzione inibitore della proteasi (ovomucoid): media F12 contenente 0,7 mg / ml di tripsina inibitore di tipo II: DMEM. Filtrare la soluzione con un filtro da 0,2 micron.
- Preparare PBS 0,6% soluzione di glucosio per raccogliere il cervello e PBS 0,15% BSA sOLUZIONE per fasi di lavaggio e per la colorazione degli anticorpi.
- Preparare strumenti di dissezione: forbici, sezionando e legando pinze, bisturi. Ammollo in etanolo al 70%.
2. La raccolta di topo adulto Brains e SVZ Microdissections
- Sacrificio adulto FUCCI topi 23 (2-3 mesi e / o 12 mesi per gli studi invecchiamento) l'esecuzione di una dislocazione cervicale in conformità con le linee guida istituzionali appropriate.
- Spruzzare il mouse utilizzando etanolo al 70% e tagliare la testa con le forbici affilate.
- Fare un'incisione lungo il cuoio capelluto per rivelare il cranio.
- Eseguire una linea mediana taglio longitudinale a partire dalla base del cranio verso bulbi olfattivi utilizzando un piccolo paio di forbici. Assicurati di evitare di danneggiare il cervello sottostante con le lame a forbice. Rimuovere la parte superiore aperta del cranio con pinze curve per esporre il cervello.
- Raccogliere il cervello in una capsula di Petri 15 mm contenente 0,6% di glucosio in PBS.
- Dissect via bulbi olfattivi. Posizionare il cervello sulla sua superficie dorsale e fare una sezione coronale attraverso il chiasma ottico con un bisturi.
- Sotto un microscopio da dissezione, posizionare la parte rostrale della sezione cervello con la superficie rivolta verso l'alto taglio coronale verso sperimentatore.
- Per sezionare la SVZ, rimuovere il setto con una pinza sottile curva quindi inserire una punta di una pinza sottile nello striato immediatamente adiacente al ventricolo e staccare il SVZ dal tessuto circostante. Per ulteriori dettagli, fare riferimento a Azari et al. 24. Posizionare la SVZ sezionato in una capsula di Petri contenente 1 ml di PBS-0,6% di glucosio.
3. SVZ Tissue dissociazione
- Tritare la SVZ sezionato nella capsula di Petri finché non rimangono pezzi di grandi dimensioni.
- Trasferire il tessuto tritato insieme alla% di glucosio PBS-0.6 in una provetta da 15 ml e centrifugare a 200 xg per 5 min.
- Eliminare il supernatante e aggiungere 1 ml di papaina pre-riscaldato (1mg / ml, preparato al punto 1.4) integrato con 0,01 mg / ml DNasi I. Incubare per 10 minuti in un bagno d'acqua a 37 ° C. Usare 1 ml di papaina per mouse.
- Centrifugare a 200 xg per 5 minuti e scartare il surnatante.
- Aggiungere 1 ml di pre-riscaldato ovomucoid (0,7 mg / ml, preparato al punto 1.5) per fermare le attività papaina. Meccanicamente dissociare il tessuto tritato ulteriormente in una cella singola sospensione pipettando gentilmente su e giù per 20 volte attraverso una punta p1000 micropipetta. Evitare di bolle d'aria.
- Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro da 20 micron sterile in un nuovo tubo 15 ml. Assicurarsi di lavare il filtro cella con PBS 0,15% BSA per evitare di perdere le cellule.
- Centrifugare a 200 xg per 10 minuti e scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 100 l di PBS contenente 0,15% di BSA.
4. immunofluorescenza per l'ordinamento delle cellule
Per l'ordinamento delle cellule utilizzando FUCCI-Red topi (Figura 2A), utilizzare la seguenteAnticorpi: CD24 ficoeritrina-cyanine7 coniugati [PC7]; CD15 / LeX isotiocianato di fluorescina [FITC] coniugata e Ax647 FEG coniugato ligando.
Nota: + cellule LeX + EGFR e + cellule EGFR non sono abbondanti nella SVZ adulta: ≈ 600 e 1500 cellule / topo rispettivamente 9. Si consiglia di mettere in comune le cellule SVZ da 2 a 3 topi di avere abbastanza materiale. Non lavorare con più di 12 topi nello stesso giorno in modo che la durata di ordinamento delle cellule non supera 3 ore. Tenete a mente che lavorare con troppi topi nello stesso giorno porterà ad un aumento della durata cell sorting possibilmente con conseguente aumento della morte cellulare e / o di differenziazione cellulare.
- Eseguire la colorazione FACS in 100 ml di PBS 0,15% BSA per topo (o in 200 microlitri per un gruppo di 2 a 3 topi per la colorazione ottimale).
- Preparare le provette di controllo. Utilizzare sfere di compensazione per preparare singoli tubi di controllo del colore in base al produttore9; s protocollo. Selezionare una frazione di cellule (1/10 delle cellule estratte da un mouse è sufficiente) e separarlo in 4 tubi per preparare 1 tubo negativo di controllo (cellule non marcate) e 3 di fluorescenza meno uno (FMO) provette di controllo. Risospendere le cellule in 200 ml di PBS 0,15% BSA per provetta.
Suggerimento: Per il controllo Lex-FITC FMO, etichettare le cellule con CD24-PC7 (01:50) e Ax647 coniugato EGF ligando (1: 200); per il controllo CD24-PC7 FMO, etichettare le cellule con CD15 / LEX-FITC (01:50) e Ax647 coniugato EGF ligando (1: 200) e per Ax647 coniugato controllo FMO FEG ligando, etichettare le cellule con CD15 / Lexmark FITC (01:50) e CD24-PC7 (01:50). - Per i tubi utilizzati per l'ordinamento delle cellule, utilizzare i seguenti anticorpi alla diluizione indicata in PBS 0,15% BSA: CD24-PC7 (01:50), CD15 / LEX-FITC (01:50) e Ax647 coniugato ligando EGF (1: 200).
- Incubare per 20 minuti a 4 ° C al buio. Lavare con 1 ml di PBS 0,15% BSA e centrifugare a 200 xg per 10 min. Risospendere le cellule in 20081; l di PBS 0,15% BSA per cerebrale. Mantenere i tubi di ordinamento delle cellule su ghiaccio e procedere immediatamente alla separazione delle cellule.
- Se si utilizzano topi FUCCI-verdi, frazioni LEX-positivi e Lex negativi separati utilizzando colonne di separazione prima cellula di smistamento delle azioni anticorpi LEX-FITC stessa lunghezza d'onda di emissione di fluorescenza FUCCI-verde (Figura 3A, B).
- Innanzitutto, etichettare le cellule con un anti-umano LeX-anticorpo di topo (01:50) per 15 minuti a 4 ° C al buio in 100 ml di PBS 0,15% BSA.
- Lavare le cellule con 1 ml di PBS 0,15% BSA e centrifugare a 200 xg per 10 min, quindi etichettare le cellule con microsfere IgM anti-topo (1:10) per 15 minuti a 4 ° C al buio.
- Lavare le cellule con 1 ml di PBS 0,15% BSA e centrifugare a 200 xg per 10 min. Risospendere le cellule in 500 microlitri di PBS 0,15% BSA e versare le cellule attraverso colonna di separazione nel campo magnetico come schematizzato in figura 3 C. Lavare la colonna con 1 ml di PBS 0,15% BSA di ottenere frazione negativo Lex.
- Per ottenere frazione LeX-positivo, rimuovere la colonna di separazione dal campo magnetico ed eluire le cellule con 2 ml di PBS 0,15% BSA.
- Procedere alla CD24-PC7 e Ax647 coniugati ligando EGF colorazione come indicato al punto 4.2.
5. cella Ordinamento
Nota: Le cellule sono state ordinate su una selezionatrice FACS a 40 Psi con un 86 micron noozle. La fluorescenza è stato raccolto utilizzando il seguente set di filtri: 520/35 nm (CIC), 575 / 26nm (PE), 670 / 20nm (Ax647) e 740LP (PC7). Compensazione è necessaria per evitare segnali falsi-positivi come una sovrapposizione si trova tra gli spettri di emissione di fluorescenza FUCCI rosso e il colorante PC7.
- Immediatamente prima separazione delle cellule, aggiungere un colorante vitale per discriminare vivo dalle cellule morte. Abbiamo usato HO (vedi tabella materiali) a 2 mg / ml concentrazione finale. Eseguire la provetta del controllo negativo (cellule non marcate) attraverso il sorter FACS e selezionare °cellule e utilizzando side scatter (SSC) e parametri forward scatter (FSC) (Figura 1A).
NOTA: Le cellule morte sono stati esclusi dal gating solo la frazione HO-negativo (Figura 1A ') e poi doppiette stati esclusi selezionando Pulse Width frazione negativo (Figura 1A' '). - Eseguire i controlli monocolore previste al punto 4.2 e regolare il tubo fotomoltiplicatore (PMT) tensioni (scala cellule cioè popolazione negativa, troppo alte e / o positivi off) se necessario. Eseguire compensazione del colore nella finestra di compensazione del software.
- Esegui FMO controlli disposti a passo 4,2 (LEX-FITC controllo FMO, CD24-PC7 controllo FMO e Ax647 coniugato controllo FMO EGF legante) e disegnare le porte di ordinamento (Figura 1). Ordinare le cellule direttamente in 100 ml di terreno di coltura in 1,5 ml microtubi.
6. Preparazione di cellule di Microscopia
- Piatto della cella appena ordinatos ad una densità di 1 - 3 x 10 3 cellule / pozzetto in Poly-D-Lysine- rivestite 96 pozzetti μ-Plate con 300 ml di terreno di coltura.
- Prima videomicroscopia, incubare le piastre di coltura a 37 ° C e 5% CO 2 per almeno 1 ora per consentire l'adesione cellulare.
Setup 7. Microscopio e Image Acquisition
- Eseguire immagini dal vivo con obiettivo Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0,75) in un sistema confocale microscopio a scansione laser collegata ad una camera termostatata invertita a 37 ° C sotto 5% di CO 2 nell'atmosfera.
- Posizionare il 96 pozzetti μ-Plate all'interno della camera termostatata pre-riscaldato ed equilibrato e sostituire il coperchio da un coperchio termostatato.
- Aprire il software NIS-Elements e cliccare nella barra dei menu "Acquire / Acquisizione controlla / acquisizione ND" per selezionare le opzioni del time-lapse (lunghezza, posizioni di scena, confocale z-sezioni, ...), "Acquisire / controlli di acquisizione / Pad Ti221; per selezionare gli obiettivi e "Acquire / controlli di acquisizione / A1plus Impostazioni" per selezionare il livello di PMT per ogni fluorescenza nella barra dei menu. Selezionare la cartella in cui salvare i file di dati.
- Utilizzando la finestra di acquisizione ND, impostare il centro di ogni pozzetto come posizione organizzare e selezionare l'opzione immagine grande da 7 x 7 mm². Questo crea un'immagine mosaico intorno al centro di ciascun pozzetto. Impostare la sovrapposizione per l'immagine grande mosaico 5%. Scattare foto ogni 20 minuti per 24 ore. Selezionare l'obiettivo del piano Apo VC 20x DIC (NA: 0,75) nella finestra Ti Pad.
- Nella finestra A1plus Impostazioni, acquisire immagini utilizzando lo scanner di risonanza ad alta velocità in un formato di 512 x 512 pixel con una risoluzione di 1,26 micron / pixel. Utilizzare campo chiaro di visualizzare forme cellulari. In caso di topi FUCCI-rossi, eccitare la fluorescenza a 561 nm rosso e raccogliere utilizzando un 595/50 nm filtro. Nel caso di FUCCI-Green topi, eccitare la fluorescenza verde a 488 nm e raccogliere con un 530/40 nm filtro. Determinare la PM ottimaleLivello di T, offset e potenza del laser per ogni lunghezza d'onda.
NOTA: Si consiglia di utilizzare la funzione di autofocus per il canale campo chiaro per consentire al software di autofocus in ogni posizione prima di ogni fase di acquisizione. Suggerimento: un Piano Apo VC 20x obiettivo DIC (NA: 0,75) è stato utilizzato per la sua eccellente risoluzione, senza la necessità di petrolio. Altri obiettivi possono essere utilizzate a seconda della risoluzione ottica desiderata. - Selezionare il pulsante 'Esegui ora' nella finestra di acquisizione ND per iniziare l'acquisizione.
Suggerimento: seguire il lavoro al computer per 1 ciclo per essere sicuri che tutto funzioni correttamente.
8. Image Processing and Analysis
- Analizzare i dati direttamente sul software NIS-Elements tenendo traccia delle cellule singolarmente. Suggerimento: per guadagnare tempo, risparmiare ogni posizione in formato .avi utilizzando il software NIS-Elements e analizzare i film con ImageJ.
- Nel software ImageJ, monitorare le singole cellule in fase di almeno 2 divisioni (cioè una cellulauna colonia quattro celle). Ritagliare una piccola area intorno alla cella e selezionare 'Immagine / Duplica'.
- Seleziona 'Immagine / Pile / Fai Montage' nella barra dei menu per effettuare un montaggio. Specifica i fotogrammi da includere, le dimensioni delle immagini e salvare il montaggio come file .tif per risoluzione ottimale.
- Per calcolare la prima SG 2 / M lunghezza fase (Figura 2C, D), selezionare una singola cella fluorescente rossa (in G 1) e quindi impostare t = 0 (fase S inizierà quando il rosso-fluorescenza spegne). Contare il numero di fotogrammi finché la cellula si divide per stimare la lunghezza SG 2 / M.
NOTA: Il tempo calcolato dipende dall'intervallo di tempo tra ogni fotogramma. - Per calcolare la successiva fase G1 (Figura 2C, D), continuerà a monitorare la cella che appena diviso. Se la cella divisa entra nella fase G1, ci sarà un accumulo di proteine rosso fluorescente CDT1. Calcolare il numero di fotogrammi fino a rosso-fluorescenza spegne agaa ciascuna cella.
Suggerimento: All'inizio del G 1 fluorescenza rossa potrebbe essere debole in modo da scegliere l'inizio della fase G 1 sul fotogramma in cui la cella è diviso per evitare approssimazioni.
Representative Results
La capacità di discriminare in modo affidabile tra le diverse popolazioni di cellule del topo adulto stirpe di cellule staminali SVZ è primordiale per indagare le loro proprietà funzionali. A questo scopo, abbiamo sviluppato un / EGFR / CD24 strategia triple-etichettatura LeX che permette la purificazione di specifiche popolazioni di cellule dalla SVZ adulta: NSC quiescenti (LEX luminosi), le cellule staminali neurali attivati (LEX + EGFR +), TAC (EGFR +) , neuroblasti immaturi e migrazione (CD24 + CD24 + e EGFR +, rispettivamente) 9 (Figura 1). Applicato a Fucci topi transgenici, la cella di cernita consente di imaging dal vivo delle fasi del ciclo cellulare delle diverse popolazioni neurogenici a livello di singola cellula 25. Topi FUCCI-Red sono stati usati per seguire il G 1 fase con fluorescenza rossa usando la microscopia time-lapse video (Figura 2A). Cellule neg FUCCI-rossi rappresentano le cellule in S-G 2 / M fasi del ciclo cellulare, le cellule pos FUCCI-rossi sono G 1 cellule e cellule brillanti FUCCI-rossi sono cellule che escono o fuori del ciclo cellulare (Figura 2B) 23,26. LeX + EGFR + e cellule EGFR + da giovane adulto (Figura 2C) e topi di mezza età (Figura 2D) sono stati placcati come cellule aderenti su piastre di coltura rivestite di poli-D-lisina. La prima fase SG 2 / M è stato identificato su cellule singole volta la fluorescenza rossa spegne finché la cellula si divide. Come già osservato il SG 2 / M lunghezza fase non ha mostrato differenze tra LeX + EGFR + e + cellule EGFR, sia in topi giovani o di mezza età. Poi abbiamo calcolato il prossimo G 1 lunghezza di fase dalla prima divisione fino alla fluorescenza rossa si spegne. È interessante notare che, una fase di allungamento G 1 è stato trovato durante l'invecchiamento in + cellule LeX + EGFR, ma nonin cellule EGFR + 25 (figura 2C, D). Di conseguenza, neurosfere ottenute 5 giorni dopo la placcatura sono più piccole cellule LeX + EGFR + ottenuti da topi anziani, come mostrato nella Figura 2E.
FUCCI-Green topi può essere utilizzato anche per visualizzare il SG 2 / M fase con fluorescenza verde (figura 3A, B), ma le cellule devono essere pre-ordinato con colonne di separazione come anticorpo LEX-FITC condivideva la stessa lunghezza d'onda di emissione rispetto al FUCCI- fluorescenza verde (Figura 3C). Un esempio di fluorescenza FUCCI-verde per la prima SG 2 / M fase giovani adulti LeX + EGFR + e cellule EGFR + è mostrato in Figura 3D.
Figura 1:. Strategia di selezione cellulare mediante FACS (A) Le cellule sono state prima selezionati secondo tmorfologia erede utilizzando dispersione laterale (SSC) vs parametri forward scatter (FSC). Per ulteriori dettagli sulla selezione cancello morfologia, si riferiscono a Daynac et al. 9 (A ') Le cellule morte sono stati etichettati con HO marcatore ed esclusi dalla selezione. (A' ') Farsetti sono stati esclusi con il parametro di larghezza di impulso. (Etichettatura LEX-FITC / FUCCI-Red / EGF-Ax647; B) per impostare la cernita cancelli, Fluorescenza meno uno (FMO) controlla per CD24-PC7 e Lex-FITC (FUCCI-Red / EGF-Ax647 / CD24 etichettatura -PC7; B ') sono stati utilizzati (C, C'.) Quindi, porte di smistamento sono stati determinati in / EGF-Ax647 / CD24-PC7 tubi etichettati insieme con i controlli FMO LEX-FITC / FUCCI-Red. Le percentuali medi delle cellule totali sono rappresentati all'interno dei cancelli. Se si seleziona CD24 + cellule (neuroblasts), fare attenzione a escludere le cellule che esprimono CD24 brillanti dal cancello. Infatti, CD24 luminoso corrispondono a ce ependimalells 2,9. C 'rappresenta le cellule negative CD24 (quadrati nero in C). Solo LeX + EGFR + e EGFR + (C ') porte di smistamento sono stati utilizzati per questo studio.
Figura 2: analisi diretta del ciclo cellulare utilizzando topi FUCCI-Rosso (A) Rappresentazione schematica del ciclo cellulare FUCCI-Rosso, dove le cellule sono di colore rosso fluorescente in fase G1 e incolore durante SG 2 / M fasi 23 rappresentazione (B) FACS di.. fluorescenza FUCCI-rosso sulle cellule SVZ. (C, D) la microscopia Video con LeX + EGFR + e EGFR + cellule ordinati da giovane (C) e di mezza età (D) topi FUCCI-rosso permette il tracciamento della fase G 1 con fluorescenza rossa mentre l'SG 2 / M fasi possono essere dedotte when la fluorescenza rossa si spegne. Immagini successive vengono visualizzate con una scala temporale presentato in Re. (E) Immagini rappresentative della colonie (neurosfere) ottenuti 5 giorni dopo la placcatura. Scala bar:. 10 micron (C, D), 30μm (E) Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:.. Strategia per le analisi in tempo reale del ciclo cellulare utilizzando topi FUCCI-Verdi (A) Rappresentazione schematica del ciclo cellulare FUCCI-verde in cui le cellule sono verdi durante SG 2 / M fase e incolore durante G1 fase 23 (B) la rappresentanza FACS di FUCCI-Green fluorescenza: cellule neg FUCCI-verdi rappresentano le cellule in G1 fase del ciclo cellulare durante FUCCI-Green cellule pos sono cellule in SG 2 / M 23. (C) Al fine di seguire la SG verde fluorescente 2 / M fasi della lex + EGFR + e cellule EGFR +, le cellule SVZ dovevano essere pre-ordinato con colonne di separazione. Le cellule sono state marcate con anti-topo LeX anticorpi e frazione LeX + è stato mantenuto sulla colonna utilizzando microsfere anti topo (vedi protocollo 4). Poi, Lex + e Lex - frazioni sono state eluite ed etichettati con EGF-Ax647 e gli anticorpi CD24-PC7 per FACS ordinamento (D) microscopia video della lex + EGFR + e EGFR + cellule ordinati da giovani topi FUCCI-verde consente il tracciamento di. la SG 2 / M fasi con fluorescenza verde. Immagini successive vengono mostrati con una scala temporale presentato in D. Scala bar: 10 micron (D).
Discussion
La tecnica di ordinamento delle cellule qui descritta permette discriminazione affidabile tra NSC quiescente, le cellule staminali neurali attivati ei loro studi progenie consentendo di loro proprietà e la dinamica del cervello adulto 9. Accoppiato con la tecnologia FUCCI che permette la visualizzazione del ciclo cellulare in cellule viventi 23, abbiamo sviluppato una tecnica rapida ed efficiente per seguire le G 1 e SG 2 / M fasi del ciclo cellulare da cellule cerebrali del mouse invecchiati e giovani adulti.
La tecnica cell sorting utilizzata in questo protocollo è stata la prima combinazione convalidato di marcatori che permettono la purificazione dei cinque principali popolazioni neurogenici dalla SVZ 9. È stata anche la prima tecnica validata consente la distinzione di NSC quiescenti ed attivati. È interessante notare che questa tecnica non richiede l'uso di topi transgenici per sé, che è necessaria quando adattato su modelli di topi transgenicich come FUCCI. Da allora, Codega et al. 10 hanno usato una combinazione di etichettatura tripla GFAP-GFP / CD133 / EGFR distinguere NSCs quiescenti dalla loro controparte attiva, ma non può essere adattato alla tecnologia FUCCI quanto richiede l'utilizzo di GFAP-GFP topi transgenici. Mich et al. 11 hanno sviluppato un / EGFR / CD24 strategia di etichettatura tripla Glast che condivide i risultati comuni con la tecnica utilizzata in questo studio 9. In effetti, una forte correlazione tra Lex e marcatori Glast NSC è stato già osservato in Daynac et al. 9 studiare. Tuttavia, l'anticorpo Glast utilizzato nella tecnica Mich et al. È accoppiato alla ficoeritrina e quindi non può essere adattato con l'uso di topi FUCCI-rossi.
Ci sono alcuni importanti punti tecnici che richiedono attenzione prima della cernita cellule SVZ. Innanzitutto, il passaggio di dissociazione è molto importante in quanto il tessuto cerebrale deve essere dissociate in singole cellule preservando la strutturaleintegrità delle proteine utilizzate per la strategia di etichettatura anticorpo. 0,05% tripsina-EDTA ha dimostrato di essere molto efficace nel dissociare SVZ tessuto 27 ma l'antigene LeX è risultato essere altamente sensibile come quasi tutti LeX-FITC immunofluorescenza era perso (dati non mostrati). Così, papaina è stato utilizzato come era più efficiente e meno distruttivo di altre proteasi su tessuto cerebrale. Inoltre, né LeX nè EGFR né CD24 sono stati influenzati dal trattamento papaina. Va notato che l'etichettatura anticorpo è stato modificato se il trattamento papaina superato 15 min. Abbiamo ottenuto ottimi risultati con un trattamento papaina 10 min associato ad una dissociazione meccanica (pipetta su e giù per 20 volte).
Il rivestimento poli-D-lisina permette coltura di cellule aderenti e la formazione di colonie dopo diversi giorni di coltura. E 'ormai ampiamente riconosciuto che in vitro viene fornito con i loro limiti 28,29. Si consiglia di determinare solo il primo ciclo cellulare perle cellule in almeno una successiva divisione per rimanere il più vicino possibile al fenotipo cellulare in vivo.
È degno di nota ricordare che le proteine Geminin (fluorescenza verde) e CDT1 (fluorescenza rossa) utilizzati per progettare il sistema FUCCI 23 sono stati precedentemente dimostrato di essere espressa abbondantemente dai progenitori neurali durante le prime fasi neurogenesi nei topi 30 e cervello adulto tessuti 9,25 . Anche se il mKO2-hCdt1 (30/120) costrutto è stato utilizzato prevalentemente nel presente studio per seguire la fase G1 con fluorescenza rossa, l'utilizzo di entrambi i costrutti [mKO2-hCdt1 (30/120) e MAG-hGem (1/110) ] potrebbe essere previsto per consentire la visualizzazione delle principali fasi del ciclo cellulare (G 1 e SG 2 / M) e G 1 / S transizione 23. Il principale svantaggio di imaging bicolore È gli insiemi compatibili limitate di fluorescenza che può ancora essere utilizzato per la marcatura delle cellule. Una soluzione è quella di utilizzare Separatisu colonne. Ad esempio, abbiamo esaurito con successo la frazione CD24-positivo da cellule utilizzando colonne di separazione prima cellula di smistamento e live-imaging abbiamo utilizzato un anticorpo CD24-PE che condivideva la stessa lunghezza d'onda di emissione di fluorescenza FUCCI-Rosso 25.
Pochi studi hanno indagato la durata del ciclo cellulare delle popolazioni del mouse SVZ adulta. La lunghezza totale del ciclo cellulare ottenuta con la nostra tecnica è vicino a quello stimato in vitro da Costa et al. 21, ma siamo riusciti per la prima volta per distinguere le diverse fasi del ciclo cellulare. In uno studio in vivo, Ponti et al. 22 utilizzato l'incorporazione di analoghi della timidina per determinare la dinamica proliferazione delle diverse popolazioni cellulari SVZ. Tuttavia, esse non potevano né eseguire un monitoraggio continuo del ciclo cellulare né monitorare le cellule a livello di singola cellula. Questo potrebbe essere un problema in quanto è stato dimostrato che una forte eterogeneità esiste spiritohin una data popolazione di cellule SVZ 22,25. Descriviamo qui un'alternativa tecnica vitro, facile da configurare, che consente l'imaging dal vivo delle fasi del ciclo cellulare di diverse popolazioni adulte neurogena a livello di singola cellula.
Comprendere la regolazione del ciclo cellulare delle cellule staminali neurali e progenitori rimane una sfida per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici nel contesto di invecchiamento o di patologie del cervello. Il nostro protocollo può quindi avere una vasta gamma di applicazioni. Nel contesto di invecchiamento, questa tecnica potrebbe rivelarsi utile per capire gli effetti dell'invecchiamento sulla NSC differenziazione. Infatti, è possibile identificare neurali cellule staminali / progenitrici entrano differenziazione loro intensità fluorescente rossa è tipicamente superiore 26. Infine, potrebbe anche essere di interesse per sfruttare la continua imaging dal vivo a livello di singola cellula per studiare la cellula processi intrinseci ed estrinseci responsabili della pro lignaggioprogressione di NSC adulte.
Acknowledgments
Siamo in debito con C Joubert, V Neuville, V Barroca, J Tilliet e tutto il personale delle strutture di origine animale; a J Baijer e N Dechamps per separazione delle cellule; O. Etienne per l'assistenza tecnica, e A. Gouret per la sua assistenza amministrativa. Citometria a flusso e di smistamento delle cellule sono state effettuate presso il IRCM citometria a flusso di risorse condivise, istituito con contributi in conto impianti da DIM-Stem-Pôle, INSERM, Fondation ARC, e CEA. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni di Electricité de France (EDF). MD ha una borsa di studio da La Ligue Contre le Cancer e LM dalla regione Ile-de-France (DIM bioterapie). Marc-André Mouthon e François D. Boussin paternità quota co-maggiore.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well uncoated glass bottom culture plates | MatTek Corp. | P96G-1.5-5-F | |
| µ-Plates 96-well | Ibidi | 89626 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A003E | |
| NeuroCult NSC Basal Medium | STEMCELL Technologies | 5700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplement | STEMCELL Technologies | 5701 | |
| Heparin | STEMCELL Technologies | 7980 | |
| EGF | Millipore | GF144 | |
| FGF-2 | Millipore | GF003 | |
| Papain | Worthington | LS003119 | |
| EBSS | Invitrogen | 24010-043 | |
| L-cysteine | Sigma | C-7352 | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Promega | V4231 | |
| DNase I | Sigma | D5025-15KU | |
| Trypsin inhibitor type II | Sigma | T9128 | Ovomucoid |
| DMEM:F12 medium | Life Technologies | 31330-038 | |
| 20 µm filter | BD Medimachine Filcon | 340622 | |
| Eppendorf microtubes 3810X | Sigma | Z606340-1000EA | |
| BSA | Sigma | A1595 | Bovine serum albumin solution |
| CD24 phycoerythrin-cyanine7 conjugate [PC7] | Life Technologies | A14776 | Mouse IgM; clone MMA. 1:50 |
| CD15/LeX fluorescein isothiocyanate [FITC] - conjugated | BD Biosciences | 332778 | Rat IgG2b; clone M1/69. 1:50 |
| Mouse anti-human LeX antibody | BD Pharmingen | 559045 | Mouse IgM; clone MAM. 1:50 |
| Alexa647 - conjugated EGF ligand | Life Technologies | E35351 | 1:200; Ax647-conjugated EGF ligand in the text |
| CompBeads | BD Biosciences | 644204 | |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | separation columns (in the manuscript) |
| Anti-mouse IgM microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-301 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 861405 | HO (in the manuscript) |
| INFLUX cell sorter | BD Biosciences | FACS sorter (in the text) | |
| Nikon A1R confocal laser scanning microscope system attached to an inverted ECLIPSE Ti | Nikon Corp. | confocal laser scanning microscope (in the manuscript) | |
| NIS-Elements AR.4.13.01 64-bit software | Nikon Corp. | NIS-Elements software (in the manuscript) | |
| Plan Apo VC 20x DIC objective (NA: 0.75) | Nikon Corp. | ||
| ECLIPSE Ti thermostated chamber | Nikon Corp. | thermostated chamber (in the manuscript) | |
| ImageJ | RBS | ||
| FlowJo | Tree Star, Ashland, OR | ||
| FUCCI mice | RIKEN BioResource Center, JAPAN | Sakaue-Sawano et al. 2008 |
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