Viene presentato un protocollo per lo screening di piccoli farmaci molecolari basato sulla sintesi in situ di nanocluster d'oro fluorescenti ultrapiccoli (Au NCs) utilizzando proteine caricate con farmaci come modello. Questo metodo è semplice per determinare l'affinità di legame dei farmaci a una proteina bersaglio mediante un segnale fluorescente visibile emesso dalle NC Au modellate con
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Articolo metodologico
Una rapida e quantitativa metodo fluorimetrico per lo screening di stupefacenti piccole molecole di proteine Targeting
In questo articolo
Sommario
Abstract
Si dimostra un nuovo metodo di screening di farmaci per determinare l'affinità di legame di piccole molecole farmaceutiche per una proteina bersaglio formando nanocluster fluorescenti oro (Au NC) all'interno della proteina-droga caricata, sulla base del segnale di fluorescenza emessa dal differenziale Au NC. Proteine albumina come l'albumina sierica umana (HSA) e albumina sierica bovina (BSA) sono selezionati come le proteine modello. Quattro piccole farmaci molecolari (ad esempio, l'ibuprofene, il warfarin, fenitoina, e sulfanilamide) di diverse affinità di legame alle proteine albumina sono testati. Si è constatato che il tasso di formazione di fluorescenti Au CN all'interno farmaco caricata albumina in condizioni denaturanti (cioè, 60 ° C o in presenza di urea) è più lenta di quella formata nella proteina intatta (senza farmaci). Inoltre, l'intensità fluorescente del CN come formata è risultato essere inversamente correlato alle affinità di legame di questi farmaci alle proteine albumina. In particolare,maggiore è l'affinità di legame farmaco-proteina, più lenta è la velocità di formazione Au NC, e quindi una minore intensità di fluorescenza della risultante Au NC viene osservata. L'intensità di fluorescenza della risultante Au NC fornisce quindi una misura semplice della forza di legame relativa di diversi farmaci testati. Questo metodo è anche estensibile per misurare la costante legame specifico farmaco-proteina (K D) semplicemente variando il contenuto droga precaricato nella proteina ad una concentrazione proteica fissa. I risultati misurati corrispondono bene con i valori ottenuti con altri metodi di prestigio ma più complicati.
Introduzione
Albumine siero come albumina sierica umana (HSA) e albumina di siero bovino (BSA) sono la proteina più abbondante nel plasma e svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento della pressione osmotica del comparto sangue. Sono inoltre riconosciuti come proteine di trasporto per le piccole molecole di bassa solubilità in acqua, come gli steroidi, acidi grassi, ormoni tiroidei, e una vasta gamma di farmaci. L'associazione di proprietà (ad esempio, siti di legame, affinità o la forza vincolante) di queste molecole di siero albumine costituisce un tema importante nella farmacocinetica. 1-4 diversi metodi analitici sono stati sviluppati per studia....
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Protocollo
Attenzione: consultare le schede di sicurezza (SDS) di tutte le sostanze chimiche coinvolte prima dell'uso. L'esperimento screening di stupefacenti prevede la sintesi e la manipolazione dei nanomateriali, che possono avere rischi aggiuntivi rispetto alla loro controparte massa. Si prega di verificare le misure di controllo necessarie per essere praticato tutto l'esperimento, compreso l'uso di controlli tecnici (cappa) e dispositivi di protezione individuale (DPI, ad esempio, i pantaloni di lunghezza di sicurezza, scarpe chiuse, guanti resistenti ai prodotti chimici, e occhiali di protezione).
1. Preparazione dei rea....
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Risultati
Protein dispiegarsi un importante metodo per la formazione di proteina-templated Au NC perché gruppi funzionali più reattivi (per esempio, residui di tirosina di una proteina) possono essere esposti per ridurre gli ioni Au incapsulati e accelerare il tasso di formazione di Au NC così. Agenti di riscaldamento e di denaturazione esterno sono due mezzi comuni per promuovere il processo di svolgimento delle proteine. La Figura 1 mostra l'effetto di riscaldamento e l'aggiunta di agenti di de.......
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Discussione
Ci sono diversi passaggi critici che devono essere evidenziate in questo metodo. Nel protocollo di screening della affinità di legame relativo dei diversi farmaci molecolari piccoli passi 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 e sono fondamentali per ottenere buoni risultati mostrano tendenza coerente per la forza vincolante relativa. In queste fasi, le azioni di aggiunta di sostanze chimiche e disegno di soluzioni di reazione per la misura dovrebbe essere il più rapidamente possibile per minimizzare l'effetto ritardo e la stessa sequ.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Y.N.T. ringrazia l'Agenzia per la Scienza, la Tecnologia e la Ricerca (A*STAR) di Singapore per il sostegno finanziario nell'ambito della sovvenzione JCO CDA 13302FG063.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione di cloruro d'oro (III), 30% | Sigma-Aldrich | 484385 | Corrosivo, irritante |
| Albumina sierica umana, 96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
| Albumina sierica bovina, 96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ibuprofene, 98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
| warfarin, 98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
| fenitoina | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
| sulfanilamide, 99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
| dimetil solfossido | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| Idrossido di sodio | Sigma-Aldrich | ||
| Agitatore magnetico | IKA | RT5 | |
| Lettore di micropiastre | Tecan | Infinite M200 | |
| Piastra a 384 pozzetti | Corning | ||
| Pipetta a spostamento d'aria da 5 ml | Eppendorf | ||
| 1.000 μ l. pipetta a spostamento d'aria | Eppendorf | ||
| 100 μ l pipetta a spostamento d'aria | Eppendorf | ||
| 5.000 μ l Punte | |||
| 1.000 μ l Punte | |||
| 100 μ l. Puntali | |||
| provetta da 1,5 ml | Eppendorf | ||
| Fiala in vetro da 20 ml con tappo | |||
| Fiala in vetro da 4 ml con tappo |
Riferimenti
- Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin. Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).
- Vuignier, K., Veuthey, J. -L., Carrupt, P. -A., Schappler, J.
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Ristampe e permessi
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