Abstract
A imunidade adaptativa é regulada por interações dinâmicas entre as células T e células apresentadoras de antígenos ('APCs') conhecido como 'sinapses imunológicas. Dentro destas interfaces de célula-célula íntimos agrupamentos sub-celular discretas de MHC / Ag-TCR, F-actina, adesão e moléculas de sinalização formar e remodelar rapidamente. Essas dinâmicas são pensados para ser determinantes críticos tanto da eficiência e qualidade das respostas imunes que se desenvolvem e, portanto, de proteção contra a imunidade patológica. Compreensão atual das sinapses imunológicas com fisiológico APCs é limitado pela inadequação da resolução de imagem obtidos. Embora modelos substrato artificial (por exemplo, bicamadas lipídicas planas) oferecem excelente resolução e têm sido ferramentas extremamente valiosas, eles são inerentemente não-fisiológica e simplista. As células endoteliais vasculares e linfáticas surgiram como um tecido periférico importante (ou estroma) compartimento de "semi-profissãoai APCs '. Estas APCs que expressam (a maioria da maquinaria molecular de APCs profissionais) têm a característica única de formação da superfície celular praticamente plana e são facilmente transfectáveis (por exemplo, com os repórteres de proteína fluorescente). Aqui uma abordagem básica para implementar as células endoteliais como uma nova e fisiológico "planar modelo celular da APC 'para melhorar a imagiologia de interrogação e de processos fundamentais de sinalização antigénicos irá ser descrito.
Introduction
Os linfócitos T são um ramo do sistema imunitário adaptativo, caracterizado por a capacidade de reconhecer eficientemente antigénio peptídico (Ag) ligado ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC) através dos seus receptores de células T (TCRs) 1. Linfócitos naive constitutivamente migrar e digitalizar 'Ag células apresentadoras de profissionais "(APCs; por exemplo, células dendríticas) dentro de gânglios linfáticos, enquanto as células de memória / T efetoras precisa fazer um levantamento efetivamente uma gama extremamente ampla de APCs e células alvo em potencial dentro tecidos periféricos.
Na min após o reconhecimento inicial de cognato Ag em um APC, linfócitos prender sua migração e começam a formar uma interface célula-célula íntimo especializado denominado "sinapse imunológica" (IS). Sustentada (ie, 30-60 min) É contatos são necessários para ampliar e sustentar a sinalização 2-7. Estudos emergentes identificar que no seja, é a formação contínua e rápida remodeling de micro-aglomerados discretos sinalização sub-celular (ou seja, contendo MHC / Ag-TCR, F-actina, adesão e moléculas de sinalização) que determinam a força e qualidade dos resultando respostas imunes 2-7. No entanto, detalhes dinâmicos e mecanismo de regulação deste processo são completamente compreendidas 8,9. Isso decorre, em grande parte dos desafios técnicos associados com topologias de superfícies irregulares APC e orientação mal controlada dos planos de interação célula-célula, as questões que limitam profundamente a imagem espaço-temporal requisito aproxima 8-10 (Figura 1A).
Figura 1. Um Fisiológica Planar Modelo APC celular for Imaging imunológica Synapse Dynamics. O esquema ilustra imagem tradicional da sinapse imunológica entre uma célula T e um professio nal APC (A) e de células T e um lipídicas planas modelo tradicional bicamada APC (B) em comparação com este modelo planar APC endotelial novel (C). APCs profissionais fornecer sinapses imunológicos fisiológicos, mas oferecem interface de mal orientadas célula-célula (isto é, em relação ao plano de imagem XY óptima; resolução ~ 0,2 ^ M), o que compromete dramaticamente espacial (plano de imagem z resolução ~ 1 mm) e temporal (isto é, devido à necessidade de digitalizar repetidamente através de todos os planos de imagem z) resolução de imagem. Modelos de duas camadas tem uma topologia plana que fornece melhor resolução de imagem espaço-temporal, mas também são altamente simplificado, não-fisiológica e rígida. Este modelo combina células endoteliais a topologia planar de camadas duplas lipídicas com o substrato fisiológico de um APC clássico para oferecer resolução de imagem espacial e temporal ideal em um ambiente fisiológico.m / files / ftp_upload / 53288 / "target =" _ blank 53288fig1large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Trabalhos anteriores contornada parcialmente estes obstáculos através do desenvolvimento de modelos de substrato planar (isto é, as bicamadas lipídicas e das superfícies revestidas com anticorpo) que fornecem resolução espaço-temporal óptimo (ou seja, através de fixação superfície a activação das células T num único plano que é paralelo ao imagiologia XY óptima avião) 11-15 (Figura 1B). Estes modelos têm facilitado importantes insights sobre a dinâmica subcelulares / molecular que controlam a sinalização antigênico nas células T, incluindo a descoberta de actina dinâmica / TCR sinalização micro-aglomerados 7,11-14. No entanto, tais modelos são inerentemente muito simplificado, assim como rígida (impedindo o desenvolvimento / estudo de características topológicas 3-dimensional) (Figura 1B). Portanto, permanece incerto como relacionar esses achados para phycélula-célula siologic vigilância imunológica.
Embora ainda pouco estudadas, vascular e células endoteliais linfáticas estão emergindo como uma grande (ou seja, maior em número do que todos os APCs profissionais, por ~ 1.000 vezes) compartimento periférico de "semi-profissional" APCs 16-18. Estas células expressam MHC-I, MHC-II e uma multiplicidade de moléculas co-estimuladoras (por exemplo, CD40, LFA3, ICOSL, 4-1BB, OX40L, TL1A, PD-L1, mas não CD80 e CD86) e são estrategicamente posicionada na interface de sangue-tecido onde servem funções especializadas sentinela 16-18. Estudos anteriores demonstraram que as células endoteliais podem efetivamente re-estimular efector / memória, mas não naïve, células T 19-25. Assim, as células endoteliais são susceptíveis de desempenhar papéis exclusivos da APC na fase efectora da resposta imune adaptativa no interior dos tecidos periféricos, tais como a influência local sobre a activação de células T, a diferenciação, a memória e a tolerância 16,17,26. Criticalmente, quando cultivadas in vitro, as células endoteliais formam superfícies celulares praticamente planares e estão facilmente transfectáveis (por exemplo, com os repórteres de proteína fluorescente). Estas características são ideais para imagens de alta resolução espacial e temporal da dinâmica topológica durante as interações célula-célula 19,27. Assim, as células endoteliais pode servir como um fisiológico "planar celular da APC modelo extremamente adequado para o estudo dos mecanismos de remodelação subcelulares / moleculares que conduzem o reconhecimento do antigénio e regulam as respostas (Figura 1C) 19,20.
Previamente estabelecida técnicas de imagem complementares (incluindo a transfecção de células endoteliais com fabricantes de proteína fluorescente da membrana de plasma e citossol) para estudar os detalhes da interacção de leucócitos-endotélio durante a adesão e a migração transendotelial de 27, mostraram que os leucócitos sondar activamente a superfície do endotélio por dinâmico inserção de umd retração de sub-mícron-escala, saliências cilíndricas ricas em actina (~ 200-1.000 nm de diâmetro e profundidade) denominado saliências invadosome-like (ou seja, 'ILPS') 27,28. Estas abordagens de imagem têm sido expandida, juntamente com a criação de protocolos para tirar proveito da função endotelial APC para desenvolver os primeiros métodos para imagens de alta resolução espacial e temporal da célula endotelial sinapse imunológica T como relatado 19,20 e ainda descrever aqui. Uma constatação fundamental derivado dessa modelo APC celular romance planar é que procedimentos ILP células T funcionar tanto na promoção da detecção Ag inicial e na manutenção de sinalização subsequente. Na verdade, matrizes de múltiplos procedimentos ILP (que foram estabilizados e acumulados em resposta a rubricar o fluxo de cálcio) mostram enriquecimento em TCR e moléculas de sinalização sugestivos activa, tais PKC-Q, ZAP-70, fosfotirosina e HS1. Portanto, procedimentos ILP parecem representar um equivalente fisiológico tridimensional para o micro-TCR sinalizaçãoaglomerados observados nos modelos de duas camadas planas. Esta abordagem, assim, com sensibilidade revela / relatórios dinâmica molecular e arquitetônicos (e implícitas biomecânico) de outra forma não detectável.
O método descrito aqui deve ser útil para fazer a ponte entre APC profissional e modelos artificiais de substrato APC a fim de aumentar a nossa capacidade de interrogar mecanismos básicos da resposta imune adaptativa. Embora aqui o foco é sobre a activação das células T CD4 + do tipo Th1 efector / célula de memória, esta abordagem básica pode ser facilmente modificado para estudar uma ampla gama de tipos de células T e Ags, como discutido abaixo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todas as experiências descritas neste protocolo são realizadas com células T humanas primárias e células humanas primárias disponíveis comercialmente endoteliais (dérmica ou microvascular pulmonar ECs) protocolo de pesquisa .any envolvendo seres humanos deve ser aprovado por um conselho de revisão institucional e consentimento informado por escrito deve ser fornecida a partir de cada doador de sangue. Experimentos conduzidos utilizando este protocolo foi aprovado pelo IRB do Beth Israel Deaconess Medical Center.
1. Preparar as células CD4 + Th1 Humano Effector / T de memória
- Aplicar torniquete no braço do doador, limpe veia com álcool, e inserir a agulha. Desenhar lentamente 15 ml de sangue para vacutainer usando EDTA como anticoagulante. Quando o sangue tiver sido tirada, desatar o torniquete antes de retirar a agulha. Aplicar imediatamente pressão para ferida com gaze estéril quando a agulha é removida.
- Transferir o sangue para um tubo de 50 ml. Adicionar RPMI-1640 à TA a uma diluição 1: 1 (volume final 30 mL). Sobrepor cuidadosamente a diluídad sangue em dois tubos de 50 ml contendo 15 ml de pré-filtrada linfócitos meio de isolamento, tais como Ficoll-Paque à TA.
- Centrifuga-se o gradiente a TA durante 30 min a 1.200 x g num rotor de balde oscilante. Enquanto centrifugação preparar o meio de células T (500 ml de RPMI-1640, FCS a 50 ml, 5 ml penicilina / estreptomicina).
- Após a remoção do tubo de 50 ml de centrífuga, observar quatro camadas: um sedimento de glóbulos vermelhos no fundo, o paque, uma camada de células que contém células brancas do sangue (incluindo linfócitos) e o plasma. Remova cuidadosamente a camada de células brancas do sangue com uma pipeta de pasteur e transferência em um tubo Falcon 50 ml.
- Lava-se a camada de células brancas do sangue, adicionando RT RPMI-1460 (até 20 ml) e centrifugação à TA durante 5 min a 1200 x g. Ressuspender as células brancas do sangue, em 1 ml de meio de células T. Adiciona-se 5 mL da suspensão de 1 ml de células para meio de células T de 250 ul num tubo de centrífuga de 1,5 ml, e misturar suavemente cima e para baixo com uma pipeta.
- Adicionar 25 ul diluird suspensão de células a 25 uL de 0,4% azul de Tripano. Adicionar 10 ul de mistura a cada um dos lados de um hemocitómetro padrão.
- Coloque hemocit�etro em uma luz baixa potência microscópio. Utilizando uma objectiva de 10X contar o número de células que excluem o corante azul de tripano e que se encontram presentes no quadrado do meio de ambos os lados do hemocitómetro vivo.
- Para calcular a concentração de células, multiplicar a média dos quadrados por 2 100 (factor de diluição) e, em seguida, multiplicar por 10 4 para se obter o número de células / ml.
- Ajustar a concentração final de 0,5 x 10 6 células / ml em meio de células T. Adicionar uma concentração final de 1 ug / ml de cada um dos superantigénios bacterianas enterotoxina B de estafilococos (SEB) e toxina de síndroma de choque tóxico 1 (TSST) para as células. Cultura durante 72 horas (37 ° C e 5% de CO 2) para expandir a população de células T CD4 +.
- As células T da pelota (1200 xg, 5 minutos) e ressuspender em 0,5 x 10 6 células / ml em meio de células T com oadição de IL-15 humana (20 ng / mL). Transferir para um balão de linfócitos T150. Continuar a expandir / células divididas em pleno meio-IL-15 a cada 24-48 horas, conforme necessário (com base na cor da mídia, ou seja, sempre que a mídia passa de rosa a ligeiramente amarelo) depois. Manter a população de linfócitos resultante por até 15 dias.
NOTA: Por design, este protocolo irá ativar e ampliar especificamente subconjunto de células T CD4 + que são reativos a SEB e TSST e, em seguida, levá-los em direção a um tipo Th1 fenótipo efetor / memória. Outras células brancas do sangue não conseguem sobreviver e crescer sob estas condições, de tal modo que a passo 1.10 as células irão ser, pelo menos, 95% de CD4 +, CD45RO + de células T 19, como pode ser prontamente avaliada por citometria de fluxo. Se desejado, a purificação pode ser facilmente conseguida por meio de kits de selecção baseados positivos ou negativos de anticorpos disponível comercialmente / magnética-grânulo.
2. A partir Cultura de células endoteliais humanas Primária
<ol>3. Divisão Geral e Expansão das células endoteliais
- Crescer as células a ~ 90-95 confluência. Isso pode demorar 2-5 dias. Para rachar,remova a mídia e enxaguar com PBS. Remover PBS e substituir com volume mínimo de tripsina 1x fresco (0,5 ml de T25 ou 1,5 ml para T75). Agite suavemente para cobrir toda a superfície com tripsina. Incubar a 37 ° C para ~ 5 min. Monitorar o desprendimento das células da placa utilizando uma luz baixa potência microscópio.
- Quando maioria das células parecem arredondado ou individual, adicionam-se 5 volumes (ou seja, em comparação com o volume adicionado tripsina) de meio completo pré-aquecido EGM-2 e pipeta suavemente sobre a superfície do balão para separar todas as células.
- Contar as células endoteliais com um hemocitómetro, como descrito em 1,6-1,7. Agregar as células por centrifugação (5 min, 1,200 xg). Remover o sobrenadante. Ajustar a concentração para 0,5 milhões de células por ml pela adição de completa EGM-MV meios 2 de pré-aquecido.
- Transferir alíquotas de células aos pratos ou frascos apropriados FN-revestidos para manutenção. Agite cuidadosamente e colocar na incubadora. Troque a mídia dentro de 6-12 horas de chapeamento. Sho mídiauld ser alterado aproximadamente a cada 48 horas depois disso.
4. Célula Endotelial Transfecção
NOTA: Primário células endoteliais são refratários à transfecção pela maioria dos métodos químicos e eletroporação comum. O método baseado na transfecção nuclear descrito abaixo permite a eficiência de transfecção relativamente elevada (~ 50-70%). Um método alternativo eficaz é o uso de infecção por vectores virais adequados (ver comentários em Materiais Tabela).
- Prepare T25 ou T75 frascos (conforme necessário) de HLMVECs ou HDMVECs para uma densidade final de 90-95% confluency.Coat com fibronectina (FN) 20 ug / ml em PBS, em condições estéreis, quer microscópio placas de cultura, tais como placas de delta-T (por Passo 5) ou lamelas de vidro de 12 mm circulares colocados no interior de um poço de uma placa de 24 poços de cultura de células (para o passo 6) como descrito acima com (2.1).
- Adicionar 1 ml de AGE-2 meios de cultura completos para cultura microscópio platesor 0,5 ml a cada um de 24 poços e equilibrar em placasnuma atmosfera humidificada a 37 ° C / 5% de CO2.
- Colheita e contagem de células endoteliais tal como nos passos 3.1-3.3.Centrifuge o volume necessário de células (0,5 milhões de células por amostra) a 1.200 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Ressuspender o sedimento celular em 100 ul com cuidado solução de transfecção nuclear RT por amostra.
- Combinar 100 ul de suspensão de células com 1-5 ug de ADN. Transferência de células em suspensão / ADN em cuvete certificado; amostra deve cobrir o fundo da cuvete sem bolhas de ar.
NOTA: As construções de direccionamento YFP ou DsRed à membrana celular (por meio da N-terminal de 20 aminoácidos de neuromodulina que contém um sinal de palmitoilação pós-tradução) foram utilizados sozinhos (membrana-YFP sozinho ou membrana-DsRed sozinho) ou co-transfectadas com um marcador volumétrica citoplasmático (por exemplo, YFP-membrana e DsRed solúvel). Muitos permutações de marcadores de proteína fluorescente pode ser utilizado. - Feche a cuvete com a tampa. Coloque a célula comsuspensão de células / DNA no suporte da cuvete da electroporador e aplicar programa eletroporação S-005. Tome a tina para fora do suporte quando o programa for concluído.
- Adicionar ~ 500 ul de meio de cultura pré-equilibrada para a cuvete e remover suavemente a suspensão de células a partir da cuvete usando as pipetas de transferência de plástico fornecidos com o kit de transfecção nuclear.
- Para experiências utilizando placas de cultura de microscópio partição da suspensão de células a partir de uma reacção entre dois pratos igualmente contendo meio pré-aquecido (Passos 4,2-4,3). Para experiências com 24 poços / placa, uma partição reação igualmente entre 3 poços.
- Incubam-se as células numa atmosfera humidificada com 37 ° C / 5% de CO2 e mudar de suporte 4-6 horas, e de novo em 12-16 horas após a transfecção.
5. imagens de células vivas e Análise
- Preparando endotélio
- Dia 0: Co-transfectar HLMVECs primárias com membrana-YFP e DsRed solúvel através de um nucleofetecnologia ction conforme descrito na etapa 4 e placa para em células vivas, placas de cultura de imagem.
- Dia 1: Substituir meio com meio fresco contendo IFN-γ (100 ng / ml) para induzir a expressão de MHC-II. No Dia 2. Estimular células transfectadas por adição de 20 ng ml TNF-α / para a mídia existente.
- No Dia 3, o endotélio incubar com 1 ug / ml de cada um dos superantigénios de enterotoxina B de estafilococos bacterianas (SEB) e toxina da síndroma do choque tóxico 1 (TSST) a 37 ° C durante 30-60 minutos imediatamente antes das experiências. Omitir esta etapa para as condições de controlo dos -AG '.
- Preparando Linfócitos
- Em paralelo com a etapa 5.1.3, preparar Tampão A (sem vermelho de fenol HBSS), suplementado com Hepes a 20 mM, pH 7,4 e 0,5% v / v de albumina de soro humano pré-aquecido a 37 ° C. Retirar uma amostra de linfócitos em cultura e determinar a densidade por contagem com um hemocitómetro (Passo 1,12-1,17).
- Centrífuga 2 milhões de células por amostra em 1,200 xg durante 5 min à temperatura ambiente num tubo cónico de 15 ml. Aspirar e meios sedimento de células suavemente ressuspender em 2 ml de tampão A de tal modo que não há grupos de células permanecem.
- Remover uma nova porção de Fura-2 corante de cálcio e ressuspender em DMSO para fazer uma concentração de estoque de 1 mM.
- Adicionar 2 mL de solução de estoque de Fura-2 para a suspensão de células T (2 uM de concentração final), a tampa do tubo e misturar imediatamente por inversão do tubo para assegurar a dispersão uniforme do corante. Incubar a 37 ° C durante 30 min.
- Centrifugar como no passo 5.2.2. Aspirar Tampão-A e linfócitos suave mas completamente ressuspender em 20-40 ul de tampão fresco-A.
- Live-célula Imaging and Acquisition Setup
NOTA: Uma grande variedade de sistemas pode ser utilizado para imagiologia de fluorescência de células ao ar em cima e para baixo microscópios de luz. Os requisitos básicos incluem uma fonte de fluorescência de luz e filtros, uma câmera CCD, comutação de filtro motorizado e estores, uma fase aquecida (ou microscope-montável câmara aquecida) e software para aquisição de imagem automatizado. Para este protocolo de alta abertura numérica, alta ampliação (ou seja, 40X, 63X) lentes de imersão em óleo são necessários para conseguir a resolução espacial necessária. Um cuidado especial deve ser tomado na escolha da fonte de fluorescência apropriado e lentes para geração de imagens de cálcio com base em Fura-2 como nem todos são compatíveis com as exigidas 340/380 comprimentos de onda de excitação nm. Uma abordagem alternativa (compatível com o padrão de conjuntos de filtros de fluorescência verde e vermelho) podem ser usados com corantes não-ratiomentic sensível ao cálcio (por exemplo, Fluo-4, Rhod-3), embora estes não pode quantificar com precisão o fluxo de cálcio e apenas fornecem um parente / leitura quantitativa.- Ligue sistema de microscópio (PC para a operação, microscópio, câmera CCD, roda de filtros e lâmpadas de xénon).
- Abra o software designado.
- Configure microscópio / software para multicanal automatizada de lapso de tempo de imagem. Incluem a aquisição sequencial de anúncioifferential contraste de interferência (DIC), fluorescência verde padrão, fluorescência vermelha padrão e padrão de excitação 340 e 380 nm Fura-2 imagens. Defina o intervalo para a aquisição de 10-30 seg e uma duração total de ~ 20-60 min.
- Definir tempos de exposição para Fura-2 imagem.
- Adicione o óleo fresco e objetivo montar um prato microscópio contendo apenas 0,5 ml de Tampão-A no adaptador fase de aquecimento e imediatamente ligar para equilibrar a 37 ° C (~ levará 2-3 min).
- Adicionar descansando linfócitos Fura2-carregados para a câmara de microscópio prato montado utilizando uma pipeta de 20 mL.
- Ligue brilhante imaging campo. Selecione o caminho de luz para as oculares. Use o botão de foco aproximado para trazer objetivo em contato com fundo do prato miscoscope. Use a ocular e o botão de foco fino para se concentrar nas células T se instalaram no fundo do prato.
- Use os controles de palco xy para selecionar um campo que contenha pelo menos 10 células. Evitarsuperlotado campos e aglomerados de células como estes irão criar artefatos de imagem.
- Mudar de campo claro a fluorescente fonte de luz. Mudar de imagem para a câmera CCD ocular. Definir parâmetros de aquisição (por exemplo, tempo de exposição, ganho de detector e binning). Utilizando o software de aquisição de imagens e de repouso Fura2-340 Fura2-380 (começando com o tempo de exposição idêntico para cada um, geralmente na gama de 200-1.000 ~ mseg).
- Utilizar os métodos descritos no Passo 5.4.1 para calcular o Fura2-340 / Fura2-380 para cada linfócitos. Execute repetidas iterações do ajuste da Fura2-340 e tempos de exposição Fura2-380, aquisição de imagens e cálculo dos rácios até que os valores médios estão próximos de 1.
- Definir tempos de exposição para mem-YFP e DsRed.
- Substitua o prato microscópio usado no passo 5.3.3.1 com um prato contendo miscroscope transfectadas, ativado e sag tratada (ou não tratada; controle) HLMVECs ou HDMVECs de cultura de células incubadora (Passos 4.5.1). Usar uma pipeta de transferência descartável para remover rapidamente meios, lavar uma vez por adição de ~ 1 ml de tampão de pré-aqueceu-A. Aspirar e, em seguida, adicionar 0,5 ml de tampão-A.
- Identificar áreas em que as células endoteliais transfectantes positivos brilhantemente fluorescentes estão presentes e parecem saudáveis com junções intercelulares bem formadas.
- Ajustar os parâmetros de aquisição (por exemplo, tempo de exposição, ganho de detector e binning) para mem-YFP e DsRed. Certifique-se de que a intensidade de sinal de fluorescência média em cada canal se situe entre 25% e 75% da gama dinâmica do detector.
- Definir tempos de exposição para Fura-2 imagem.
- Realizar experimento de imagem de células vivas.
- Use um software automatizado para começar a aquisição de imagem e capturar vários intervalos de imagens para estabelecer linha de base.
- Durante a aquisição de aplicar ~ 5 jil de linfócitos de Fura-2-carregados concentradas a partir do passo (5.2) para o centro do campo de imagem de microscópio prato, inserindo a ponta de um pequeno volume (P-5ou P-20) da pipeta na mídia, perto do centro do objetivo e ejetar lentamente.
- Como linfócitos resolver no campo de imagem, fazer ajustes finos no foco para assegurar que a interface celular de células-T (endotélios sinapses imunológicas) são mantidas no plano focal. Com 40 e objetiva 63X, ~ 10-20 células por campo são ideais. Se menos células são observados no campo de imagem repita o passo 5.3.4.2.
- Após o intervalo de observação desejada de experiência é competiu, continuar a imagiologia imediatamente ionomicina e pipeta directamente para o prato miscoscope (utilizando uma técnica tal como no 5.3.4.2) a uma concentração final de 2 ^ M para induzir o fluxo máximo de cálcio sinal de sinalização / Fura-2 (ou seja , um meio de calibragem, Ver análise 5.4.).
- Como uma alternativa para o intervalo de observação 5.3.4.4after desejado de experiência é competiu, aspirar imediatamente o tampão A e substituí-la com 0,5 ml de solução fixadora (formaldeído a 3,7% em PBS) durante 5 min aRT, seguido por lavagem três vezes com PBS. Em seguida, avance para a etapa 6.
- Análise de imagem Live-célula
NOTA: Depois de salvar os arquivos adquiridos, eles podem ser analisados diretamente ou exportados para análise por uma ampla variedade de aplicações de software de análise de imagem off-line. ImageJ é um particularmente valioso pacote, altamente versátil que é livremente disponível e compatível com quase todos os pacotes de software de aquisição. O desenho dos experimentos de imagem descritos nos passos 5,1-5,3 produzirá dinâmica de resolução espacial e temporal elevadas de interacções entre linfócitos e APC endotelial na ausência e na presença de cognato ceder. Quase análises ilimitadas são possíveis quando abordando dados de imagem da dinâmica morfométricas / sinalização celular. Os objectivos específicos descritos neste protocolo específico são quantificar coordenadamente migração de linfócitos e sinalização (ou seja, cinética e níveis de fluxo de cálcio intracelular), juntamente com dinâmicaal mudanças na arquitetura sinapse imunológica com foco em características específicas (ou seja, ILPS / PODO-prints). Os seguintes são exemplos de padrão separado e não-padrão (ou seja, desenvolvido especificamente para estas experiências / perguntas) analisa.- Medir Linfócitos fluxo de cálcio
- Seleccione a inicial Fura2-340 (340 nm-510 nm EX EM) imagens e Fura2-380 (380 nm EX-510 nm EM) que tenham sido adquiridos antes da adição de linfócitos. Use-os como imagens de fundo e subtrai-los digitalmente a partir do todas as imagens na série de tempo para cada respectivo canal.
- Para cada ponto de tempo, criar uma relação da imagem digital do subtraído-fundo Fura2-340 e as imagens Fura2-380 subtraído-fundo (ou seja, 340 nm EX-510 nm EM-fundo / 380 nm EX-510 nm EM-fundo).
- Selecione a ferramenta de desenho do software apropriado. Clique na tela para desenhar uma região circular de interest (ROI) em torno de cada linfócito. Estes irão gerar um valor de proporção média-pixel para cada linfócito e prazo.
- Traça-se a proporção calculada como uma função do tempo utilizando uma aplicação de software apropriado (por exemplo, programa de folha de cálculo). Calcule a média do fluxo de cálcio para o ensaio pela soma dos valores da relação de todos os linfócitos por campo e dividindo esse valor por o número total de linfócitos para cada ponto de tempo
- Realizar lympocyte análise de monitoramento de migração.
- Analisar a migração de células T de células utilizando uma aplicação adequada de rastreamento de pilha de software (por exemplo, ImageJ), utilizando o canal DIC de cada vídeo. Usando ImageJ celular Rastreamento Plugin, identificar em cada frame o centróide de cada célula manualmente, clicando sobre ela em cada quadro progressivo.
- Use as coordenadas xy de série resultantes (ou seja, traços de caminhos de migração) para calcular a velocidade média (distância total migraram intervalo total / of de imagem) e a tortuosidade (distância total migrado / a distância linear de ponta a ponta entre o local de célula na primeira e na última imagem).
- Cross-correlacionar estes parâmetros com o fluxo de cálcio (5.4.1) dinâmica numa base de célula-por-célula.
- Avaliar a densidade Podo-print / ILP dentro do IS
- Contagem total de ILP formada em cada célula T intervalos é definido (por exemplo, 5 min após a adição de células T). Estes podem ser identificados fluorescentes anéis discretos escala mícron membrana-YFP que co-localizam com círculos escuros em citoplasmática DsRed na APC endotelial num local de adesão de linfócitos.
- Cross-correlacionar os índices de PLI resultantes '' com o fluxo de cálcio (5.4.1) dinâmica numa base célula-a-célula.
- Medir o podo-print / vidas de PLI.
- Para cada podo-print / ILP em uma dada é calcular suas vidas como o último ponto de tempo quando um ILP era visível - o ponto de tempo quando que podo-print / ILP fiapareceu primeiro. Média ILP vidas tanto por IS.
- Cross-correlacionar estas vidas com o fluxo de cálcio (5.4.1) dinâmica numa base célula-a-célula.
- Avaliar a relação temporal entre a formação inicial e ILP fluxo de cálcio.
- Para cada linfócito identificar o ponto de tempo (frame) na qual o cálcio nasce primeiro acima da linha de base 19.
- Para cada linfócitos identificar o ponto temporal em que o primeiro Podo-print / ILP aparece.
- Para cada linfócitos calcular um "tempo de deslocamento 'subtraindo o ponto inicial de tempo o fluxo de cálcio a partir do inicial que Podo-impressão / PLI. Calcular a média dos valores para todos os linfócitos em um campo. Os valores positivos indicam a formação ILP precede o fluxo de cálcio enquanto que números negativos indicam o oposto.
NOTA: Estas experiências podem facilmente ser realizado sob fluxo laminar cisalhamento fisiologicamente relevante usando câmaras de imagem de fluxo de parede paralela comercialmente disponíveis como descrito 19.
- Medir Linfócitos fluxo de cálcio
Imagem e Análise 6. células fixo
- Endpoint fixo T célula endotelial é a formação e coloração
- Preparar células T tal como descrito em 1. Preparar células endoteliais (- / + SAG) como no Passo 5.1 (transfecção, Passo 5.1.1 é opcional). Tomar uma amostra de linfócitos em cultura e determinar a densidade, contando com um hemocitômetro (Seção 1).
- Transferir um volume de cultura de linfócitos equivalente a pelo menos 3 x 10 5 linfócitos / amostra para um tubo de 15 ml e centrifugar a 200 xg durante 3 min. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em tampão de linfócitos-A (Passo 5.2.1) concentração de 6 x 10 5 / ml de linfócitos.
- Remover as células endoteliais da incubadora de cultura de células e (Procedendo uma amostra de cada vez) meios sucessivamente aspirados e substituir com 0,5 ml de suspensão de linfócitos (3 x 10 5 linfócitos / amostra) e para substituir 37 ° C incubator.
- Após períodos de incubação adequados, observado acima, o meio aspirado dos poços e adicionar solução suficiente fixador (formaldeído a 3,7% em PBS) para cobrir completamente a amostra (por exemplo, na placa de 24 poços ~ 300-500 uL). Incubar à temperatura ambiente durante 5-10 min.
- Lavar a amostra 3 vezes com PBS. Manchas por adição de anticorpo primário durante 60 min à temperatura ambiente (ver a lista). Se o anticorpo primário é dirigido a uma proteína intracelular, um passo adicional de permeabilização precisa de ser realizada por adição de solução de permeabilização suficiente (0,01% Triton X-100 em PBS) para cobrir completamente a amostra durante 1 min à temperatura ambiente. Lavar a amostra 3 vezes com PBS. Adicionar anticorpos secundários adequados (em alguns casos faloidina fluorescente concomitantemente) durante 60 min à temperatura ambiente.
- Monte a lamela de vidro circular em um slide de imagem. Endpoint fixo T célula endotelial é a formação e coloração. Para começar lugar de imagem do slide de imagem contendo amostras no palco microscópio e selecione o óleo 63Xobjetivo. Aplicar óleo de imersão fresco.
- Use o modo de imagem de campo brilhante e lentes oculares para localizar o plano focal. Mudar para epifluorescência e inspecionar amostra através das lentes oculares. Selecione um campo de interesse. Alternar para o modo de varredura a laser.
- Usando o modo rápido-scan e trabalhando no maior campo possível ajustar individualmente a potência do laser e ganho de cada canal para optimização sinal de tal forma que, idealmente, a intensidade do sinal específico atinge pelo menos ~ 25% e não mais de 75% da gama dinâmica dos detectores.
- O uso de controles de foco manual, varredura rapidamente através do eixo Z e identificar os limites superior e inferior de corte (normalmente todas as informações devem ser contidos dentro de uma espessura de ~ 15 mm). Seleccionar a espessura de corte do eixo Z na gama de ~ 0,2-1,0 uM.
- Finalmente, zoom / recortar o campo de imagem para a região específica de interesse e conduta digitalização. Além de ter muito brilhante e específica si fluorescêncianal na amostra, a aquisição de alta resolução 3D-imaging requer iterações de digitalização e fazer ajustes para os parâmetros de aquisição. O objetivo é obter xy máxima e resolução do eixo z, sem apreciável foto-branqueamento.
- Qualitativamente analisar a topologia da topologia 3D da IS através da realização de reconstrução digital 3D das seções ópticas resultantes através de um aplicativo de software adequado (por exemplo, J Imagem). Através de aplicações semelhantes avaliar quantitativamente a distribuição do sinal de fluorescência (por exemplo, co-localização e intensidade de fluorescência correlativo linha-scan análise de Pearson e visualização ortogonal).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uma nova abordagem de imagem usando células endoteliais e que combina as vantagens de resolução do cartão planar bicamadas lipídicas modelo com a complexidade fisiológica e deformabilidade da APC profissional foi desenvolvido (Figura 1). A Figura 2 proporciona exemplos de migração típica, fluxo de cálcio e dinâmica topológica observada com este abordagem. Na ausência de retracção no endotélio, os linfócitos T CD4 + Th1 SAg específicos espalhar-se rapidamente, e polarizar a migrar lateralmente através da superfície endotelial (Figura 2A) sem fazendo fluir de cálcio (não mostrado). Dentro ~ 5-10 min estes linfócitos iniciar transmigração através do endotélio. Na presença de descaimento carregamento no endotélio, os linfócitos espalhar simetricamente com uma topologia "ovo frito", iniciado sustentada (isto é, durante 30-60 min) de fluxo de cálcio intracelular (Figura 2B; Filme 1) tempo durante o qual eles exibempouca ou nenhuma migração (Figura 2C).
Figura 2. Análise Vivo-celular da activação das células T e dos painéis de migração e imunológicos sinapse topologia da APC endotelial. (A) mostra um exemplo de imagem da série temporal da migração de células T no endotélio na ausência de descaimento. Painel superior mostra imagens DIC. A posição inicial da célula T a migração é indicada pela linha a tracejado vermelho. Painel inferior mostra invaginações formadas sobre o endotélio por migração da célula T. As setas indicam a formação de anéis de transientes (~ 0,5-1 | iM de diâmetro) da membrana-YFP fluorescência formadas como um resultado da geração de células T de 'saliências invadosome-like' (ILPS) contra a superfície da APC endotelial (ver D). (B) mostra um exemplo de uma série semelhante na presença de endotélio SAG-carregado (esquerda; Ver tambémFilme 1) e trace quantitativa das mudanças dinâmicas nos níveis de cálcio (direita) correspondente. As setas indicam a formação inicial procedimentos ILP que se correlaciona com o início do fluxo de cálcio (i) e estabilização subsequente de vários procedimentos ILP que se correlaciona com elevado fluxo de cálcio (II). (C) A experimentação como em A e B foram sujeitas a célula de análise de rastreio. Imagens DIC em representativas esquerda mostram caminhos de migração de células T ao longo da duração de 10 min (traços vermelhos). Gráfico na direita mostra as velocidades de migração calculados na ausência e presença da SAG. (D) Análise dinâmica de topologia sinapse imunológica (modificado a partir de 19). Schematic (i) ilustra uma célula endotelial / 'topologia do sistema repórter' sensível APC consiste em segmentada por membrana-YFP e RFP citosólica solúvel. ILP mediada por actina que se projetam na superfície das células endoteliais gerar invaginações em forma de cilindro (um tipo de celular pé-print, chamado de "podo-print ') gaumento iving a membrana vincados que aparecem como anéis de membrana-YFP fluorescência (isto é, as paredes do cilindro visto en face). Citosol deslocamento ea exclusão nestes loci aparecem como círculos escuros de RFP citosólica. De DIC e imagens de fluorescência em (ii) mostra um exemplo de tal análise na presença de descaimento (ver também a correspondente Filme 2). Um único podo-impressão inicial / ILP desenvolve em uma matriz de> 20 estabilizado procedimentos ILP mais de 15 min. Caixa azul em 15 min (iii) ilustra uma vista de alta resolução de uma única podo-print / ILP pelo qual um anel de membrana-YFP sobrepõe-se com uma região de RFP cytosolic excluídos. A linha a tracejado (iv) mostra uma linha de análise de verificação quantitativa de intensidades de fluorescência. Barras de escala = 5 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Como previamente estabelecido, os linfócitos activEly sonda na superfície do endotélio, estendendo actina e HS1 (um homólogo cortactina) enriquecido e WASp- e saliências-dependente src denominado 'saliências invadosome-like; (Procedimentos ILP; cada ~ 0,5-1 uM em profundidade de diâmetro) 27,28. A transfecção de proteína de fluorescência de membrana-alvo (FP) foi demonstrada para fornecer repórteres altamente sensíveis para a dinâmica topológicos subcelulares em superfícies de célula-célula. Deste modo, demonstrou-se que os anéis brilhantes de membrana fluorescente-FP são indicativos de membrana flexão durante a interacção célula endotelial-T como um resultado de células T saliências ILPS. Mostra-se aqui, e em estudos anteriores 19,20, que, embora pequenos aglomerados de forma procedimentos ILP e volume rapidamente (ou seja, tempos de vida de ~ 10-30 seg) durante a migração lateral das células T no endotélio na ausência da SAG (Figura 2A ), eles se tornam altamente estabilizado (ou seja, tempos de vida de ~ 30 min) e acumulam-se em matrizes densas na presençada SAG (Figura 2B). Além disso, a análise de ILPS e cinética de iniciação de cálcio ("tempo de compensação") que mostram procedimentos ILP preceder a sinalização de cálcio, sugerindo que auxiliam no processo de reconhecimento de MHC-II / Ag (Figura 2Bii). Além disso, estabilizado matrizes ILPS formar comensurável com fluxo máxima de cálcio (Figura 2Bii). A idéia de que os anéis de fluorescência de membrana correspondem a saliências de células T condução pontos invaginação discretos em APCs endoteliais, é confirmado pela demonstração de que estes anéis em todos os casos se correlacionam espacialmente e cineticamente com zonas de deslocados / citoplasma excluídos (como relatado por DsRed solúvel; Figura 2D e Filme 2).
A Figura 3 fornece exemplos de estudos de imagem confocal de ponto de extremidade fixo. Depois de 10 minutos de co-incubação na presença de descaimento, iss formada entre as células T e APCs endoteliais foram fotografadas por fixação, immuno coloração por fluorescência e microscopia confocal. Estes estudos fornecem análise da dinâmica de distribuição subcelulares de moléculas críticas e atividades de sinalização dentro de ISS em particular relativamente a procedimentos ILP. Especificamente, citoesqueleto / regulador do citoesqueleto (actina, HS1; Figura 3A), a apresentação de antigénio / reconhecimento (CD3 / MHC-II; Figura 3B) adesão (ICAM-1, LFA-1, talina; Figura 3C), e a sinalização antigénico (PKC Q; Figura 3D) são vistos para ser co-enriquecido em podo-impressões / ILP. Reconstrução Digital de confocal de seção de série z-stacks fornece provas complementares das mostrado na Figura 2D que a célula endotelial-endotelial T IS tem uma arquitetura de três-dimensão discreta pontuado por T ILP célula saliente na superfície da APC (Figura 3Aii, Ci, III, D). (Figura 3Civ).
Figura 3. Análise de amostra fixa-of Molecular Dynamics Distribuição em células T de células endoteliais Immunological sinapses. Os linfócitos foram incubadas no endotélio SAG-carregada durante 30 minutos e fixadas e coradas. Em painéis indicados de células endoteliais foram pré-transfectadas para expressar membrana-YFP ou -DsRed. (A) mostra imagens representativas de actina (i) e HS1 (um homólogo cortactina; ii) co-enriquecida na periferia da sinapse imunológica em micro-agregados que se correlacionam com o centro dos anéis fluorescentes endoteliais de membrana-YFP (isto é, ' PODO-prints "; Ver Figura 2D), confirmando que procedimentos ILP células T são responsáveis pelo aparecimento de PODO-prints. A vista lateral (ii. 90 ° Projeção) ilustra que representam procedimentos ILP protrusão 3-dimensional no plano z imaging (modificado de 19). (B) representativas de enriquecimento de células T TCR (i) e endothElial MHC-II (ii) dentro da sinapse imunológica, mostrar particionamento subcelular discreta para os PLI / podo-prints. (C) (i) Representante co-enriquecimento de ICAM-1 e LFA-1 em-imprime PODO e ILP, respectivamente, do IS. (i) Mostra uma reconstrução 3-D digital de seções confocal do é girado 60 ° (painéis superiores) e 90 ° (vista ortogonal; painéis inferiores). (ii) Mostra uma visão ampliada da IS en face. (III) mostra uma vista em corte transversal ortogonal da região em caixa em (ii) (modificado a partir de 19). (iv) co-Representante enriquecimento de talin (uma proteína ligante integtin / actina) e actina em É procedimentos ILP. (D) representativo de co-enriquecimento do TCR sinalização PKC-Q molécula com actina em procedimentos ILP IS. Cada painel mostra uma vista en face (parte inferior esquerda) e duas distintas visões ortogonais (90 ° Projeção). Os painéis de extrema esquerda e direito de uso são replicados de seus respectivos painéis, vizinhos, projetado usando um arco-íris fluorescencescala e intensidade (modificado a partir do 19). Barras de escala = 5 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1:. Vivo-Cell dinâmico Imagem de T sinalização de cálcio celular e imunológico Synapse Topologia Time-lapse imagem ao vivo de células de Fura2-carregado de linfócitos CD4 + Th1 interagindo com endotélio expressar membrana-YFP e carregado com SAg, correspondente à figura 2B. O painel esquerdo mostra níveis de cálcio intracelular (arco-íris: cores frescas, baixo cálcio; cores quentes elevados de cálcio) em células T. Painel da direita mostrada a fluorescência de membrana-YFP na superfície da APC endotelial. Os linfócitos são vistos para iniciar a formação e propagação de PLI (como pode ser visto através de anéis fluorescentes no canal MEM-YFP; isto é, 'PODO-imprime'; Ver Figura 2BI), seguido de indução de A (30-60 min), o fluxo de cálcio intracelular sustentada, que ocorre consentâneo com a formação de matrizes periféricas da ILPS / podo-impressões análogas às TCR / actina 'sinalização micro-cluster "que são vistos em modelos planares bicamada APC (veja a Figura 2Bii). O intervalo entre os quadros é de 20 seg. Por favor clique aqui para ver este vídeo.
Filme 2: Vivo-Cell dinâmico Imagem de imunológica Synapse Topologia vium Repórteres fluorescentes em endotelial APCs. imagens ao vivo de células Time-lapse de CD4 + Th1 linfócitos (DIC, à esquerda) que interagem com o endotélio co-expressando membrana-YFP (verde) e solúvel cytosolic DsRed (vermelho) e carregado com SAg, correspondendo a Figura 2D. O painel direito mostra mesclagem de DIC, membrana e sinalização citoplasma. Os sinais combinados de membrana e fluorescência citoplasmática sensibilidade relatar formação e remodelação de múltiplos ~ 0,2-1 invaginations superfície mm escala (PODO-prints) que resultam de células matrizes T sondagem com saliências de PLI. Por favor clique aqui para ver este vídeo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
No geral, este protocolo descreve métodos para a investigação de células endoteliais como i) APCs fisiológicos pouco estudado e ii) como um novo tipo de "modelo APC celular planar". Com relação ao primeiro, tornou-se cada vez mais apreciado que APCs não hematopoiéticas periférica (ou 'estromais') desempenham papéis, não redundantes críticos (ou seja, em comparação com hematopoiéticas APCs) na formulação de respostas imunes adaptativas 16-18. Entre tais "semi-profissional" APCs, vascular e células endoteliais linfáticos (que vastamente superam APCs profissional) estão entre os melhores apreciado 16-18. No entanto, os detalhes de eventos de sinalização e as suas sinapses imunológicas acoplados permanecem em grande parte não investigada. Os métodos aqui descritos proporcionam uma base para a compreensão avanço nesta área emergente. Por exemplo, a aplicação destas abordagens para o estudo do ISS formado a partir de tecido endotelial em diferentes que são conhecidos por exibirem ADAPTIV distintae função imunológica (por exemplo, fígado e endotélio linfático) pode ser particularmente instrutivo.
Significativamente, este método ajuda a preencher a lacuna entre APCs profissionais e modelos artificiais de substrato APC a fim de reforçar a capacidade de interrogar mecanismos básicos da resposta imune adaptativa. Considerando substratos planares APC (isto é, bicamadas lipídicas, vidro revestido de anticorpo) fornecer imagens ideal (que tem levado a muitos insights críticos 7,11-14), tais modelos são inerentemente limitado. Como alternativa, os detalhes da dinâmica de digitalização célula-célula fisiológicos até agora têm sido profundamente obscurecido por questões de imagem relacionados com orientação 8-10. Os recursos de imagens fornecidas na abordagem atual ultrapassar este obstáculo para revelar exclusivamente arquitetura subcelular tridimensional de outra forma indetectável e remodelação rápida de uma interface célula APC-T fisiológico. Estes oferecem potencial para nova compreensão da signalin antigênicag.
Por exemplo, o reconhecimento de que as células T formar procedimentos ILP enriquecidos com TCR, actina e moléculas de sinalização (por exemplo, a Figura 2D, Figura 3), sugerem que estas provavelmente representam o fisiológica peças contrárias 3-dimensional para o TCR planar sinalização micro-agregados observada em APC artificial substratos 6,7,12-14,29-31. Isto implica que, sob condições fisiológicas, os linfócitos podem empregar procedimentos ILP como discretas subcelulares 'volumes de reação 3D' com 'propriedades signalosome'-like que amplificam e sustentar sinalização, concentrando importantes moléculas / atividades 32,33. Além disso, a presença de entradas biomecânicas significativas (ou seja, aplicação de força célula-célula) na mira se ILP protrusão contra o APC pode ser inferida a partir da imagem. Este não é trivial, como forças mecânicas são cada vez mais vistos como mediadores críticos de sinalização antigénica, ao mesmo tempo como precisamente forças sãomanifesta ainda não está claro 14,34-37.
A importância global deste modelo como um substituto razoável para APC profissional é suportada pela nossa demonstração directa de que as matrizes de PLI semelhantes poderia ser visto nas sinapses formadas na ECS e DCS (e, em menor extensão células B) quando abordagens de imagiologia análogos foram empregados (por exemplo, , o uso dos mesmos fabricantes de fluorescência e controle da orientação do plano de avião é 19). No entanto, ele precisa ser considerado que as propriedades biomecânicas relativos das CE contra profissionais superfícies da membrana da APC são desconhecidas e que as diferenças de este parâmetro pode afetar detalhes da topologia IS e respostas antigênicas.
A chave para a abordagem aqui descrita está fortemente relacionado aos seus benefícios resolução. Este, por sua vez, é altamente relacionada com a intensidade do sinal de fluorescência. Assim, é fundamental prestar atenção especial na otimização de transfecção e coloração das FLUORESrepórteres cento e parâmetros de imagem / técnica (por exemplo, tempo de exposição, foco, etc ...). No que diz respeito ao anterior, o protocolo para os estudos em células vivas, que aqui descritos são limitados a transfecção de membrana genérico e marcadores citoplasmáticos que relatam mudanças topológicas na interface de células T-APC em tempo real (por exemplo, figura 2, Filmes 1, 2). Além disso, este protocolo pode ser facilmente modificado para uma análise mais sofisticada, concomitantemente introduzindo / imagem mais repórteres no endotélio (por exemplo, fluorescente MHCI / II e de adesão, moléculas co-estimuladoras e co-inibitórios e biossensores para sinalização e biomecânica marcado com proteína dinâmica). Infelizmente, no entanto, uma limitação geral é que os linfócitos são notoriamente difíceis de transfectar. Isto impede o uso conveniente de proteínas fluorescentes (por exemplo, com etiquetas para TCR, PKC-Q, etc) em células T de imagem de células vivas.
Enquantoo protocolo atual envolve a ativação de linfócitos do tipo efetor / memória humana CD4 + Th1 através SAg (um modelo amplamente utilizado), existem possibilidades muito mais amplas. Como demonstrado anteriormente 19,20 esta abordagem é facilmente adaptável a uma ampla gama de outras configurações, como respostas de outros subconjuntos + e ativação de respostas de linfócitos CD8 + matança CD4. Através de isolamento de linfócitos e células endoteliais a partir de estirpes de TCR-transgénica existentes este método também é facilmente adaptável para estudar as respostas a antigénios peptidicos específicos 19,20. Finalmente, a actual abordagem é limitada à análise de células T efectoras / memória. No entanto, a transfecção de células endoteliais com as moléculas co-estimuladoras essenciais (CD80 / 86, normalmente não expresso em endotélio) pode permitir o estudo da dinâmica de iniciação de células naive neste modelo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer stretch latex free tourniquet | BD Biosciences | 367203 | |
| BD alcohol swabs | BD Biosciences | 326895 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok | BD Biosciences | 367861 | K2 EDTA |
| BD Vacutainer Push Button Blood Collection Set | BD Biosciences | 367335 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-1L | |
| Ficoll-Paque | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Bring to RT before use |
| FCS-Optima | Atlanta Biologics | s12450 | Heat inactivated |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| staphylococcal enterotoxin B | Toxin Technology | BT202RED | Stock solution 1mg/ml in PBS |
| toxic shock syndrome toxin 1 | Toxin Technology | TT606RED | Stock solution 1mg/ml in PBS |
| human IL-15 | R&D Systems | 247-IL-025 | Stock solution 50ug/ml in PBS |
| PBS | Life Technologies | 10010-049 | |
| Fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells | Lonza | CC-2543 | Other Human Microvascular ECs can be used, i.e. HLMVECs |
| EGM-2 MV bullet kit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T-4174 | Stock solution 10x, dilute in PBS |
| amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit | Lonza | vpb1003 | Required Kit for step 4 |
| IFN-g | Sigma-Aldrich | I3265 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| TNF-alpha 10ug, human | Life Technologies | PHC3015 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| phenol Red-free HBSS | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP299-100 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-100G | Stock solution 1M in H20 |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | Stock solution 1M in H20 |
| Human Serum albumin | Sigma-Aldrich | A6909-10ml | |
| Immersol 518 F fluorescence free Immersion oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Fura-2 AM 20x50ug | Life Technologies | F1221 | Stock solution 1mM in DMSO |
| pEYFP-Mem (Mem-YFP) | Clontech | 6917-1 | |
| pDsRed-Monomer (Soluble Cytoplasmic DsRed) | Clontech | 632466 | |
| pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed) | Clontech | 632512 | |
| pEGFP-Actin | Clontech | 6116-1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Formaldehyde solution 37% | Fisher Scientific | BP531-500 | Toxic, use fumehood |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-5ML | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Falcon Tissue Culture Treated Flasks T25 | Fisher Scientific | 10-126-9 | |
| Falcon Tissue Culture Treated Flasks T75 | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Corning Cell Culture Treated T175 | Fisher Scientific | 10-126-61 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-85 | 12 mm diameter |
| Falcon Tissue Culture Plates 24-well | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| Delta-T plates | Bioptechs | 04200415B | |
| Wheaton Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8D | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| ICAM1 mouse anti-human | BD Biosciences | 555509 | |
| HS1 mouse anti-human | BD Biosciences | 610541 | |
| Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Purified | ebioscience | BMS102 | |
| Anti-Human CD3 Alexa Fluor® 488 | ebioscience | 53-0037-41 | |
| Anti-MHC Class II antibody | Abcam | ab55152 | |
| Anti-Talin 1 antibody | Abcam | ab71333 | |
| Anti-PKC theta antibody | Abcam | ab109481 | |
| phosphotyrosine (4G10 Platinum) | Millipore | 50-171-463 | |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems | Required electroporator for step 4 | |
| Zeiss Axiovert | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss LSM510 | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss Axiovison Software | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet | NuAIRE | Nu-425-600 | |
| Forma STRCYCLE 37 °C, 5% CO2 Cell culture Incubator | Fisher Scientific | 202370 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EW-02570-02 | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
| Isotemp Waterbath model 202 | Fisher Scientific | 15-462-2 |
References
- von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-cell function and migration. Two sides of the same coin. N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).
- Springer, T. A. Adhesion receptors of the immune system. Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).
- Shaw, A. S., Dustin, M. L. Making the T cell receptor go the distance: a topological view of T cell activation. Immunity. 6 (4), 361-369 (1997).
- Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
- Delon, J., Stoll, S., Germain, R. N. Imaging of T-cell interactions with antigen presenting cells in culture and in intact lymphoid tissue. Immunol Rev. 189, 51-63 (2002).
- Brossard, C., et al. Multifocal structure of the T cell - dendritic cell synapse. Eur J Immunol. 35 (6), 1741-1753 (2005).
- Dustin, M. L. The cellular context of T cell signaling. Immunity. 30 (4), 482-492 (2009).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
- Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J Cell Sci. 123, 309-320 (2010).
- Oddos, S., et al. High-speed high-resolution imaging of intercellular immune synapses using optical tweezers. Biophys J. 95 (10), L66-L68 (2008).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Bunnell, S. C., et al. T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies. J Cell Biol. 158 (7), 1263-1275 (2002).
- Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
- Seminario, M. C., Bunnell, S. C. Signal initiation in T-cell receptor microclusters. Immunol Rev. 221, 90-106 (2008).
- Dustin, M. L. Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies. J Struct Biol. 168 (1), 152-160 (2009).
- Martinelli, R., Carman, C. V. Lymphocyte Endothelilal Interactions. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. , Elsevier. London. (2015).
- Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T lymphocyte-endothelial cell interactions. Annu Rev Immunol. 22, 683-709 (2004).
- Marelli-Berg, F. M., Jarmin, S. J. Antigen presentation by the endothelium: a green light for antigen-specific T cell trafficking? Immunol Lett. 93 (2-3), 109-113 (2004).
- Sage, P. T., et al. Antigen recognition is facilitated by invadosome-like protrusions formed by memory/effector T cells. J Immunol. 188 (8), 3686-3699 (2012).
- Kumari, S., et al. Actin foci facilitate activation of the phospholipase C-gama in primary T lymphocytes via the WASP pathway . eLife. , (2015).
- Marelli-Berg, F. M., et al. Major histocompatibility complex class II-expressing endothelial cells induce allospecific nonresponsiveness in naive T cells. J Exp Med. 183 (4), 1603-1612 (1996).
- Ma, W., Pober, J. S. Human endothelial cells effectively costimulate cytokine production by, but not differentiation of, naive CD4+ T cells. J Immunol. 161 (5), 2158-2167 (1998).
- Perez, V. L., Henault, L., Lichtman, A. H. Endothelial antigen presentation: stimulation of previously activated but not naive TCR-transgenic mouse T cells. Cell Immunol. 189 (1), 31-40 (1998).
- Epperson, D. E., Pober, J. S. Antigen-presenting function of human endothelial cells. Direct activation of resting CD8 T cells. J Immunol. 153 (12), 5402-5412 (1994).
- Shiao, S. L., et al. Human effector memory CD4+ T cells directly recognize allogeneic endothelial cells in vitro and in vivo. J Immunol. 179 (7), 4397-4404 (2007).
- Marelli-Berg, F. M., Okkenhaug, K., Mirenda, V. A two-signal model for T cell trafficking. Trends Immunol. 28 (6), 267-273 (2007).
- Carman, C. V., et al. Transcellular diapedesis is initiated by invasive podosomes. Immunity. 26 (6), 784-797 (2007).
- Carman, C. V. Mechanisms for transcellular diapedesis: probing and pathfinding by 'invadosome-like protrusions'. J Cell Sci. 122 ((Pt 17)), 3025-3035 (2009).
- Dustin, M. L., Tseng, S. Y., Varma, R., Campi, G. T. T cell-dendritic cell immunological synapses. Curr Opin Immunol. 18 (4), 512-516 (2006).
- Saito, T., Yokosuka, T. Immunological synapse and microclusters: the site for recognition and activation of T cells. Curr Opin Immunol. 18 (3), 305-313 (2006).
- Gomez, T. S., et al. HS1 functions as an essential actin-regulatory adaptor protein at the immune synapse. Immunity. 24 (6), 741-752 (2006).
- Burbach, B. J., Medeiros, R. B., Mueller, K. L., Shimizu, Y. T-cell receptor signaling to integrins. Immunol Rev. 218, 65-81 (2007).
- Vicente-Manzanares, M., Sanchez-Madrid, F. Role of the cytoskeleton during leukocyte responses. Nat Rev Immunol. 4 (2), 110-122 (2004).
- Ma, Z., Janmey, P. A., Finkel, T. H. The receptor deformation model of TCR triggering. Faseb J. 22 (4), 1002-1008 (2008).
- Ma, Z., Sharp, K. A., Janmey, P. A., Finkel, T. H. Surface-anchored monomeric agonist pMHCs alone trigger TCR with high sensitivity. PLoS Biol. 6 (2), e43 (2008).
- Groves, J. T. Bending mechanics and molecular organization in biological membranes. Annu Rev Phys Chem. 58, 697-717 (2007).
- Xu, C., et al. Regulation of T cell receptor activation by dynamic membrane binding of the CD3epsilon cytoplasmic tyrosine-based motif. Cell. 135 (4), 702-713 (2008).
