Abstract
Данио рерио являются важным модель организма с присущими преимуществами, которые имеют потенциал, чтобы сделать данио широко применяется модель для исследования энергетического гомеостаза и ожирения. Небольшой размер рыбок данио позволяет анализы на эмбрионах, которые будут проводиться в формате 96- или 384-луночного планшета, технологии Морфолино и CRISPR основе содействия легкость генетических манипуляций, и медикаментозное лечение путем применения ванны является жизнеспособным. Кроме того, данио идеально подходят для передних генетических экранов, позволяющих открытие нового гена. Учитывая относительную новизну данио в качестве модели ожирения, необходимо развивать инструменты, которые в полной мере использовать эти преимущества. Здесь мы опишем метод для измерения расхода энергии в тысячи эмбрионального данио одновременно. Мы разработали целый животных микропланшетов платформу, в которой мы используем 96-луночных изолировать отдельные рыбу и мы оцениваем совокупный НАДН 2 производства с использованием коммерчески доступной культуры клеток жизнеспособность Reагент AlamarBlue. В холоднокровных отношения между НАДН 2 производства и расхода энергии тесно связано. Эти расходы энергии анализ создает потенциал для быстрого экранировать фармакологические или генетические манипуляции, которые непосредственно изменяют расход энергии или изменяют реакцию на прикладной препарата (например сенсибилизаторов инсулина).
Introduction
Мышь в настоящее время преобладает модель ожирения исследований. Короткий промежуток поколения и генетических инструментов, доступных в мышь были непревзойденной на сегодняшний день. Тем не менее, данио также имеет короткий промежуток поколения (3 - 4 месяца) и превосходит даже мышь в простоте генетической манипуляции 1,2. Данио поддерживает почти 90% генов млекопитающих, в то время как намного превышает мыши в количестве потомства и потенциалом для использования в генетических и наркотиков экранах 3.
Чтобы выявить потенциал данио модели для изучения в ожирения, анализы должны быть разработаны, чтобы исследовать факторы, влияющие на вес тела регулирования, в том числе расходов энергии. Как метаболиты проходят через бета-окисления и кислорода цикла трикарбоновых кислот потребляется и НАДН 2 производится. Таким образом, NADH 2 является прямым показателем потока метаболитов через метаболических путей (окисления метаболит). В poikilotherms, Н + утечка через внутреннюю митохондриальную мембрану, которая расцепле- НАДН 2 окисление от синтеза АТФ, составляет 4 - 5 раз ниже, чем в теплокровным 4. Соответственно, в данио NADH 2 очень тесно связан с АТФ через окислительного фосфорилирования. Здесь мы опишем анализа, который измеряет НАДН 2 производства в личиночной рыбок данио в качестве прокси для расхода энергии 5.
Потребление кислорода является золотым стандартом для измерения расхода энергии. Тем не менее, лучше всего воспользоваться высокой пропускной потенциал рыбок данио, анализы расходов энергии должен поддаваться высокой пропускной. Системы потреблением кислорода, которые зависят от закрытой камере система циркуляции ограничены в пропускной способности по количеству камер, доступных 6. На открытом воздухе O 2 потребление / СО 2 производственные анализы также применяются в данио 5,7. Они под открытым небом 96-а опорная плитаD Systems поддаются высокой пропускной способностью. К сожалению, газообмен с окружающей средой ограничивает чувствительность этих анализов. Мы недавно опубликовал заявление анализе, который контролирует NADH 2 с помощью индикатора окислительно-восстановительный AlamarBlue 5. Этот анализ позволяет преодолеть ограничения пропускной способности и чувствительности, общей для анализа потребления кислорода в данио.
Данио становится все более важным модель для изучения всей энергетической тело гомеостаза. В частности, потому, что у рыбок данио поддаются для использования в передних генетических экранов и экранов с наркотиками. Кроме того, целевые генетические манипуляции, в том числе и нокдаун нокаут в, может быть быстро применяется. Ранее мы показали, что этот анализ может быть объединен с применением ванны наркотиков и генной нокдаун или нокаут для идентификации соединений и генов, которые изменяют скорость метаболизма 5. Кроме того, этот анализ предназначен для использования высоких преимущества, присущие пропускной данио.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Этот протокол следует рекомендациям университета Аризоны Управления ответственного поведения исследований и был одобрен Комитетом по уходу и использованию животного Институциональная
1. Данио рерио эмбрионов Разведение и обслуживание
- Подготовка E3 эмбриона среду 8. Сделать 60x маточного раствора, растворить 34,8 г NaCl, 1,6 г KCl, 5,8 г CaCl 2 ● 2Н 2 О, а 9,78 г MgCl 2 6H 2 ● О в 1,95 л ddiH 2 O. Отрегулируйте рН до 7,2 с помощью NaOH и HCl Регулировка громкости до 2 л с использованием ddiH 2 O.
- Для подготовки 1x E3 эмбриона среду, развести 16,5 мл 60x запас в 1 л ddiH20. Добавить 100 мкл 1% метиленовый синий.
- Разведение
- Дом Мужчина и женщина маточного стада (7 - 18 месяцев возраста) отдельно, чтобы максимизировать плодовитость.
- Включите огни 1 - 2 ч раньше на день раньше яйца лучшего. Настройка спаривания (1 самец и 1 - 2 самки) в CRossing клетки, как описано выше 9. Пересечение клетки позволяют яйца, чтобы избежать хищников, как они проходят через перфорированную базе танка вставки, в которых взрослые рыбы проводятся.
- Дополнительно:. Для своевременной разведения (как было бы необходимо для исследований, связанных с морфолиновое инъекции), отделить мужского и женского рыбы с помощью прозрачной пластиковой перегородки, удаление это утром, приведет к своевременной кладки яиц и оплодотворения. Для морфолино исследований, выполнения расчетов мощности для оценки количества эмбриональной рыбы, необходимого на лечение. Без оценки величины эффекта или изменения, предварительный судебный можно запустить с N = 8.
- Вылейте яйца от пересечения клетке в чашке Петри (100 - 150 эмбрионов / 10 см чашки Петри). Разрешить яйца оседают на дно тарелки и вылейте воду. Удалите оставшуюся воду с помощью тоненького кончика одноразовые пипетки передачи. Добавить еще Е3 эмбриона среду, достигнутый в шаге 1.1.
- Сделать AFхромой полированная одноразовые пипетки для будущего яйца и передачи рыбы. Используя ножницы, вырезать окончил одноразовые пипетки передачи в 0,25 мл учебы. Для удаления заусенцев, пламя польский срез кончика над горелкой Бунзена.
- Поддержание эмбриональных рыбу до 4 дней после оплодотворения (DPF) в 10 см чашки Петри в данио эмбрионов E3 среды на 28,5 ○ С Два раза в день, использовать пламя полированный окончил одноразовый передачи пипетки, чтобы удалить любые неоплодотворенные яйца или мертвые эмбрионы (непрозрачный белый внешний вид). После каждого дня, заменить E3 эмбриона среды. Вылейте E3 эмбриона среду, удалить оставшуюся жидкость с помощью тоненького кончика пипетки одноразовые передачи, и добавить обратно подогретого (28,5 ○ C) E3 эмбриона среду.
2. Подготовка Пробирной Решение
- Приготовьте раствор для анализа соответствии с таблицей 1. Фильтр стерильный раствор для анализа, используя фильтр 0,22 мкм. Перед анализом посвящение, теплый стерильной анализа раствора в 28,5 ○ Сводяная баня.
| Ингредиент | % От общего | Объем (мкл / 10 мл) |
| 60x Е3 эмбрионов Средний | 1.667 | 166,7 |
| Дважды деионизированной (DDI) Н 2 0 | 96,233 | 9623,3 |
| Аламар Голубой | 1 | 100 |
| 400 мм NaOH | 1 | 100 |
| ДМСО | 0,1 | 10 |
Таблица 1. Анализ среднего
3. Выполните Пробирной
- Промыть эмбрионы рыбок данио 3 раза стерильной фильтрованной E3 эмбриона среды. Смешайте все жизнеспособные эмбрионы рыбок данио с муфтой в стакан. Стерильный фильтр 75 мл Е3 эмбрион среднего. Использование тонкой наконечником одноразовые пипетки передачи, вновьдвигаться столько эмбриона среды E3 от эмбрионов данио, как это возможно. Добавить еще 20 мл стерильного отфильтрованного E3 эмбриона среду. Снять и заменить E3 эмбриона среды в 3 раза.
- Пластина 1 рыбы в каждый из 93 лунки 96-луночного черного сторону очевидно нижнюю пластину. Передача эмбриональных рыбу на тарелку индивидуально захвата эмбриона в пламя полированный окончил пластиковые одноразовые пипетки передачи (шаг 1.5) и осторожно извлечения в колодец. Перевести E3 эмбриона среду, взятую из стакан, содержащий промытый рыбу в 3 пустых скважин. Это гарантирует, что контрольные лунки были подвержены точно такой же, как воды в лунки, которые содержат рыбу. Обе скважины, которые содержат рыбу и пустые колодцы должны быть по крайней мере половиной полном объеме (200 мкл) при заключении этого шага.
- Заменить E3 эмбриона среду с анализа решения во всех 96 скважин, в том числе пустых скважин. Этот шаг должен быть выполнен 1 колонка за один раз для каждого из 12 столбцов в 96-луночный планшет. Использование тонкой кончик одноразовые трансфер пипетки, удалить E3 эмбриона среды из каждой лунки в одном столбце пластины (8 скважин). Позаботьтесь, чтобы не коснуться данио эмбриона. Добавить 300 мкл аналитического раствора в каждую лунку, из которой воду удаляют. Повторите удаление E3 эмбриона среды и замены с анализа решения для всех 12 столбцов пластины.
- Необязательно: Чтобы проверить изменения скорости обмена веществ в ответ на соединения, чтобы решение, которое в 100 раз (100X) желаемая концентрация лечение. Следует отметить, что гарантировать, что решение 100x не превышает 10% ДМСО, чтобы ограничить конечную концентрацию DMSO не более чем 0,1%. Добавить 3 мкл раствора 100x для каждого из очистных скважин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнение вычислений мощности, чтобы оценить количество очистных скважин. Тем не менее, без оценки величины ответа или изменения, предварительный судебный могут работать в 8 соединения обработанной и 8 транспортных средств обработанных скважин контроля, которые содержат рыбу.- Добавить 3 мкл контроля транспортного средства контроля (нет Дрюг лечение) скважин, которые содержат рыбу. Чтобы убедиться, что флуоресцентный отклик на соединения является результатом действий внутри рыбы, применять наркотики и транспортных средств лечения до 3 пустых скважин в 96-луночного планшета.
- Читайте рыбы, заполненный пластину на флуоресцентной ридере с длиной волны возбуждения при 530 нМ и длины волны излучения при 590 нм.
- Место пластины в увлажненном инкубаторе установлен в 28,5 ○ C (сохранить пластину в темноте на протяжении анализа, чтобы избежать фотообесцвечивания анализа решения). Анализ может быть запущен для периодов времени, которые варьируются от 1 часа до 24 часов. Продолжительность анализа зависит от цели исследования. Для проверки ответа на короткого действия нестабильного соединения короткий срок может быть наиболее подходящим. Тем не менее, для стабильных испытаний или тестов составных генетических эффектов, максимизации продолжительности анализа предпочтительнее использовать преимущества, связанные с совокупной сигнала.
- В заранее определенный момент времени (см шаг 3,6, чтобы помочь определить сроки)прочитать флуоресценции рыбы заполненные пластины снова с теми же настройками, как на стадии 3.5.
4. Оценка относительного изменения флуоресценции, связанные с лечением
- Рассчитать изменение в флуоресценции каждой лунки вычитанием флуоресценции в момент времени 0 с флуоресценцией при заключении исследования. Уэллс без рыбы (заготовок), должны иметь значения около 0, что намного ниже значений из скважин, которые содержат рыбу.
Изменение флуоресценции = флуоресценции при заключении - флуоресценции в момент времени 0 - Чтобы установить относительное изменение флуоресценции, вычислить среднее изменение флуоресценции для контрольные лунки затем разделить на изменение флуоресценции каждой лунки с помощью среднего изменения флуоресценции контрольных лунках. Следует отметить, что элементы управления могут быть как элементы управления транспортных средств или генетические элементы управления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анализ решение не увеличивать флуоресценцию в отсутствие эмбрионального рыбы (рисунок 1). Тем не менее, анализ является очень чувствительным к малейшим изменениям в скорости обмена веществ в скважину. Один рыбы в лунку создает сигнал значительно отличается от пустых скважин в течение 1 ч (Р <0,0001). Рисунок 2 дает наглядное представление сигналов, генерируемых эмбрионального рыбы после 24 часов инкубации. Для этой картины были использованы прозрачные двусторонние скважин. Тем не менее, черные односторонние скважины являются предпочтительными для проведения анализа для предотвращения выщелачивание флуоресцентного сигнала от соседних скважинах.
Поскольку НАДН 2 индуцируется сокращение AlamarBlue не является обратимым, сигнал накапливается со временем. Это позволяет небольшие изменения должны быть усилены. Чтобы показать, что различия накапливаются и таким образом возрастать со временем, мы наблюдали за относительное изменение флуоресценции, индуцированного 1 до 5 рыб на 1, 2 и 4 ч (Рисунок 3). В каждом номере рыбы / а относительное изменение флуоресценции значительно увеличилось с течением времени (P <0,001). Что еще более важно, потому что сигнал накапливается со временем, величина разницы в изменении флюоресценции, что в результате манипулирования количество рыбы / лунку более устойчив при температуре 4 часа, чем в 1 ч инкубации. Таким образом, за счет увеличения продолжительности воздействия, мы можем повысить способность обнаруживать различия, связанные с данной лечения.
Рисунок 1. Сравнение шум в сигнал. Обнаруживаемое изменение флуоресценции генерируется 1 данио в 96-луночный планшет при 1 ч. Уэллс, которые не содержат рыбы (заготовок) генерируют сигнал. Мало Усы представляют SEM (п = 5 - 8). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версиюэта фигура.
Рисунок 2. Визуальное представление аналитического планшета на 24 часов. Представитель картина результатов, полученных с помощью этого теста. Розовые скважин свидетельствуют рыбы с высокой метаболической скоростью, фиолетовые скважин умеренной скорости обмена веществ, и синие скважин с низким скорость метаболизма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Различия Рисунок 3. Сигнал Amplify со временем. Разница в флуоресцентного сигнала, генерируемого изменением количества рыбы / лунку увеличивается со временем. Потому что сигнал накапливается со временем, величина изменения флуоресценции расходится с betweensamples время тшляпа отличаются скоростью генерации сигнала. Столбики ошибок обозначают SEM (N = 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Загрязнение бактерий или грибков значительно ограничивают применение этого анализа. Метиленовое синего эмбриона среды E3 ограничивает возможность грибкового заражения. На протяжении эмбриона воспитания важно, что осторожность, чтобы удалить мертвые эмбрионы два раза в день. Кроме того, важно, чтобы тщательно промыть эмбрионов в стерильной среде E3 эмбриона в день анализа инициации. Эти 2 шага ограничить потенциал для бактериального загрязнения эмбрионов. Включение контрольных лунок, описанных в пункте 3.2 позволяет обнаруживать любой бактериальной контаминации. Бактериальное загрязнение, что дает ощутимое сигнал редко. Тем не менее, если контрольные лунки действительно показывают надежную сигнал, анализ следует повторить с тщательность, чтобы поддерживать чистоту эмбриона. Если пользователь ожидает, что загрязнение, возникших до получения эмбрионов, эмбрионы могут быть беленой, как описано ранее (стр. 22) 10. Кроме того, если экспериментатор подозревает, чтоЗагрязнение происходит после сбора пользователь может использовать E2 с пенициллина и стрептомицина и задней эмбрионов до 4 денье (стр. 23) 10.
Хотя этот анализ является ценным для применения в эмбрионов, мы не проверку на валидность в взрослых данио. Мы подозреваем, что функциональность данного анализа будет ограничено во взрослой рыбы плохой проникновения в ткани из AlamarBlue. Кроме того, в кормлении рыб микрофлоры кишечника может привести глубокое сигнал, не свидетельствует о рыбной метаболизма. Таким образом, этот анализ ограничивается использованием в желтке, питающих эмбриональных рыбу. Относительное бездействие эмбрионального рыбы обеспечивает уникальное преимущество, так как это ограничивает изменчивость, что будет, связанный с индуцированной активности расхода энергии 11. Таким образом, этот анализ является уникальным инструментом для скрининга ответ скорость метаболизма в генетическом или фармакологической манипуляции в целой системе животного.
Данио быстро становится ведущей моделью для мetabolic возмущения, которые сопровождают ожирение. На самом деле, существуют опубликованные модели как трансгенных и диеты индуцированных данио ожирения 12,13. Подобно модели мыши, диета индуцированных ожирение у рыбок данио увеличивает триглицеридов и печеночных липидов накопления 12. Кроме того, перекормили рыбок данио имеют повышенные глюкозы натощак, предполагая, непереносимость глюкозы 14. Использование анализа, описанного здесь, мы показали, что 24 ч предварительной обработки с метформином, сенсибилизирующего к инсулину, увеличивает скорость метаболизма ответ на лечение инсулином 5. Таким образом, у рыбок данио может оказаться идеальным вся животная модель, чтобы обнаружить наркотики, которые повышают чувствительность к инсулину (эмбриона) и установить их эффективность в борьбе с ожирением, связанные резистентность к инсулину (для взрослых).
Развитие генетических и диетических индуцированной ожирением моделей рыбок данио, которые имитируют фенотипы, наблюдаемые у тучных млекопитающих создает импульс для инициирования данио Стюумирает сосредоточены на болезни обмена веществ. Высокой пропускной анализы имеют существенное значение для полного оценивая значение данио модели исследований энергетического гомеостаза. Инновационные инструменты, предназначенные для оценки phagic диск позволит экранов, ориентированных на потребление энергии, в то время как анализы хранения высокой пропускной липидов приведет к исследованиям на весь тела гомеостаза липидов 15-17. Анализ мы описываем здесь обеспечивает высокую пропускную способность инструмента для оценки роли генов, соединений или их взаимодействий на всей энергии тела расходов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlamarBlue | Fisher Scientific | 10-230-103 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fine Tip DisposableTransfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-26 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-771-9AM | Manufactured by Thermo Scientific |
| Black sided clear bottom 96-well plates | Fisher Scientific | 50-320-785 | Manufactured by E&K Scientific Products Inc. |
References
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. PNAS. 110, 13904-13909 (2013).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Sci. Rep. 4, 6545 (2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile. Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).
- Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish. Zebrafish. 10, 343-352 (2013).
- Livingston, R. J. A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals. J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).
- Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish. J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).
- E3 medium (for zebrafish embryos) Cold Spring Harb. Protoc. , http://cshprotocols.cshlp.org/citmgr?gca=protocols%3B2011%2F10%2Fpdb.rec66449 (2011).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53, 161-168 (2012).
- Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Zebrafish, A practical approach. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).
- Fry, F. E. J., Hart, J. S. Cruising speed of goldfish in relation to water temperature. J. Fish. Res. Board Can. 7, 169-175 (1948).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC physiol. 10 (21), (2010).
- Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).
- Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner. Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).
- Flynn, E. J. 3rd, Trent , C. M., Rawls, J. F. Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio). J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).
- Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PloS one. 7, e52549 (2012).
- Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity. J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).
