Abstract
Membranproteintransport auf dem einzelnen Proteinebene ausweicht noch detaillierte Analyse, wenn das transloziert Substrat nicht elektrogener ist. Erhebliche Anstrengungen wurden in diesem Bereich, sondern Techniken ermöglicht automatisierte Hochdurchsatz-Transport-Analyse in Kombination mit lösemittelfreien Techniken Lipid-Doppelschicht für die Analyse von Membrantransportern sind erforderlich selten. Diese Klasse von Transportern ist jedoch von entscheidender Bedeutung in der Zelle Homöostase und daher ein zentrales Ziel in der Medikamentenentwicklung und Methoden neue Erkenntnisse dringend benötigt zu gewinnen.
Die hier präsentierten Handschrift beschreibt den Aufbau und die Handhabung eines neuartigen Biochips für die Analyse von Membranprotein-vermittelte Transportprozesse auf Einzel transporter Auflösung. Der Biochip besteht aus Mikrokavitäten durch Nanoporen eingeschlossen, die stark parallel in seiner Gestaltung und kann in Industriequalität und Menge hergestellt werden. Protein-tragende Liposomen können direkt angewendet werdendie Chipoberfläche bilden selbstorganisierende poren Spanning Lipid-Doppelschichten SSM-Techniken (feste Lipidmembranen unterstützt). Pore-Spanning Teile der Membran sind freistehend, Bereitstellen der Schnittstelle für das Substrat Translokation in den oder aus dem Hohlraum, die durch multispektrale Fluoreszenzanzeige in Echtzeit verfolgt werden können. Die Einrichtung von Standard Operating Procedures (SOPs) ermöglicht die einfache Einrichtung von Protein-tragenden Lipid-Doppelschichten auf der Chipoberfläche praktisch jeder Membranprotein, das funktionell wiederhergestellt werden kann. Einzige Voraussetzung ist die Schaffung eines Fluoreszenzlesesystem für Nicht-elektrogener Transportgründen.
High-Content-Screening-Anwendungen sind erfüllbar durch den Einsatz von automatisierten inversen Fluoreszenzmikroskope mehrere Chips parallel aufzuzeichnen. Große Datenmengen können mit dem frei verfügbaren anwendungsspezifische Analyse-Software analysiert werden. Drei-Farben-Mehrspektrale FluoreszenzAuslesen erlaubt darüber hinaus für unvoreingenommene Daten Diskriminierung in verschiedenen Ereignisklassen, falsch positive Ergebnisse zu beseitigen.
Die Chip - Technologie basiert derzeit auf SiO 2 -Oberflächen, aber weitere Funktionalisierung goldbeschichteten Spanflächen ist ebenfalls möglich.
Introduction
Die Analyse von Membranproteinen ist von Interesse in den letzten 20 Jahren für die Grund- und pharmazeutischen Forschung erhöht werden. Die Entwicklung neuer Medikamente ist abhängig von der Identifizierung und detaillierte Charakterisierung neuer Ziele, die derzeit einer der limitierenden Faktoren zu sein. Die Tatsache , dass etwa 60% aller drug targets sind Membranproteine 1, macht die Entwicklung von Techniken , um ihre Funktion wichtigsten aufzuklären.
4 - In der Vergangenheit wurden in 2 Vielzahl entwickelten Techniken für die Untersuchung von elektrogenen Kanäle und Transporter. Nicht elektrogener Substrate im Gegensatz eine schwierige Aufgabe darstellen. Sie sind jedoch von besonderem Interesse als Hauptangriffspunkte für Medikamente, da sie den Fluss von gelösten Stoffen und Nährstoffen durch die Zellmembran und die Funktion als Schlüsselrezeptoren in Signalkaskaden 5 steuern.
Beträchtliche Anstrengungen wurden in die Entwicklung von t gesetztechniques die Funktion von Membrantransportproteinen 6, 7 zu untersuchen. 10, darunter auch feste unterstützten Lipid - Doppelschichten, tethered Bilayer 11, 12, microblack Lipidmembranen 13, 14 und nativen Vesikel - Arrays 15, 16 ein paar zu nennen - Systeme festen Träger unter Verwendung von Membranen wurden als vielversprechendsten Instrumente auf diesem Gebiet 8 entstanden. Einige von ihnen sind sogar als Handelsaufbauten 17, 18. Einige Beispiele wurden veröffentlicht Kombination die Fähigkeit einzelne Membranproteine in einer hochparallelen Weise 14 zu studieren, 19, Voraussetzung für Screening - Anwendungen. Allerdings überbrücken diese Methoden nur selten aus der Grundlagenforschung zur industriellen Umfeld. Die Schwierigkeiten liegen oft in der Fähigkeit des Systems, automatisierbar zu sein, die kostenintensive Herstellung und / oder aufwendige Vorbereitung. Ein Ansatz overcoming alle oben erwähnten Hindernisse ist das Endziel.
Die Technik , die hier vorgestellt wurde entwickelt Membrankanäle und Transporter in vitro in einer kontrollierten Umgebung auf dem einzelnen Protein - Ebene 20 zu studieren - 22. Die Rekonstitution von gereinigten Membranproteinen in LUVs ist viel mehr etabliert als vergleichbare Ansätze für GUVs 23-26 oder schwarzen Lipidmembranen 27. Sie können direkt auf die Chipoberfläche aufgebracht werden, in dem Doppelschichtbildung erfolgt über eine Selbstorganisationsprozess stattfindet. Der Glasboden Design des nanoporösen Chip (Fig. 1) ermöglicht eine Luft Mikroskopie, die die einfache Automatisierung des Systems ermöglicht. In Kombination mit einer motorisierten Stufe kann mehrere Chips gleichzeitig gemessen werden, wobei jedes Sichtfeld Tausende von abgedichteten Hohlräumen zur Analyse enthält.
Abbildung 1. Design von gemultiplexten Nanopore Biochips. A) A silicon-on-insulator (SOI) Wafers durch reaktives Ionenätzen strukturiert. Ungefähr 1.150 einzelne Chips werden von jedem Wafer hergestellt mit identischen Eigenschaften und Qualität. B) Jeder Chip umfasst 250.000 einzelne Mikrokavitäten mit Nano - Öffnungen. Maßstabsbalken:. 200 & mgr; m C) Jeder Hohlraum ist adressierbar über multispektrale Fluoreszenz ausgelesen. Eine undurchsichtige Deckschicht blockiert die Fluoreszenzsignale aus dem Pufferspeicher, so dass der Biochip kompatibel mit invertierten Fluoreszenzmikroskop. D) Rasterkraftmikroskopie (AFM) Bildgebung Porenöffnungen und Oberflächenrauhigkeit der Siliziumdioxid - Schicht von 3,6 nm gleichmäßig angeordnet enthüllt (n = 40) optimal für Vesikelfusion. Maßstabsbalken:. 5 um E) Rasterelektronen microscopy (SEM) Aufnahme zeigt einen Querschnitt durch die Nanopore die den Zugang zu den Femtoliter Hohlräume innerhalb des Siliziumchips. Diese Zahl wurde mit Erlaubnis wiederverwendet werden von 21. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Alle Datenanalyse wird mit Freeware durchgeführt uneingeschränkten Zugriff für Endanwender zu gewährleisten. Zeitreihen sind mit dem kostenlosen Bildverarbeitungssoftware analysiert und eine benutzerdefinierte Build-Kurvenanalyse-Software ermöglicht die Stapelverarbeitung und einfache Korrelation von großen Datensätzen mit mehreren Fluoreszenzkanälen und Tausende von Kurven.
Das Modellprotein in diesem Protokoll wird die mechanosensitive Kanal von großer Leitfähigkeit (MscL) Kanalproteins von E. abgeleitet coli. Es fungiert als ein Ventil in der Natur osmotischen Schock freizusetzen, wurde aber derart modifiziert, dass synt rational entworfenhetic Funktionalitäten können kovalent an die Kanäle Einschnürung Seite angebracht werden. Via Ladungs Abstoßung des kovalent gebundenen Aktivator (MTSET) der Kanal ausgelöst wird, zu öffnen, die Schaffung eines Nano-Ventil. Kleine Moleküle, wie Ionen, Wasser, kleine Proteine, aber auch kleine Fluorophore können durch den Kanal zu durchdringen. Hierbei wird das Protein als ein Modell verwendet, um die Fähigkeit des Systems zu demonstrieren Protein-vermittelte Translokation zu detektieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Herstellung von großen unilamellaren Vesikeln (LUVs)
- Reinigen Sie einen Rundkolben (10 ml Volumen) mit Stickstoffgas alle Staubpartikel zu entfernen. Spülen Sie den Rundkolben mit Ethanol.
Hinweis: Rest Ethanol toleriert werden kann und stört nicht den nachfolgenden Schritten. - Waschen Sie eine 1-ml-Glasspritze 4x mit Chloroform, um eine Kontamination zu entfernen. 4 ml SoyPC20 (25 mg / ml in Chloroform) , um den Rundkolben und DOPE die Lipidlösung mit einer zusätzlichen DOPE ATTO 390 bis zu einer Endkonzentration von 0,1 Mol-%.
Anmerkung: Anstelle von DOPE ATTO 390 anderen Fluorophor markierte Lipide oder lipophile Farbstoffe können auch verwendet werden, abhängig von der verfügbaren Anregungsquellen. - Schließen Sie den Rundkolben an einem Rotationsverdampfer. Trocknen des Lipidfilms für 40 min bei 300 mbar, 30 ° C Wasserbadtemperatur und die maximale Rotationsgeschwindigkeit, um eine homogene Lipidfilm an der Glaswand des Kolbens zu bilden.
- Transfer der Kolben auf einer Hochvakuumpumpe und trocken der Lipidfilm für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur.
- 5 ml Puffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterilfiltriert) und 8 Glasperlen (2,7 mm Durchmesser, Ethanol gewaschen und getrocknet) in den Kolben. Der Kolben wird an dem Rotationsverdampfer und drehen ohne Vakuum bei 50 ° C bei maximaler Geschwindigkeit.
Hinweis: Glasperlen, die Lipidfilm von der Glaswand mechanisch verdrängen, was zu (multilamellare) Vesikelbildung. Nach 45 min Rotation erscheint die Lösung milchig und kein Restlipidfilm sollte an den Kolbenwänden sichtbar sein. Anstelle von Glasperlen andere Methoden wie Beschallen der Kolben in einem Wasserbad sonifier, Verwirbelung der Kolben oder die sanfte Rehydrierung Verfahren sind ebenfalls anwendbar. - Übertragen, der Kolben wird unter Schutzgas (Argon) in ein Ultraschallbad und beschallen für 4 min bei Raumtemperatur.
Anmerkung: Die Ultraschall-Stoßwellen, die Liposomen stören, sie unilamellar machen. - Teilen Sie die LUV-Lösungin 1 ml Aliquots.
- Führen Sie 5 Frost / Tau-Zyklen durch die LUV Lösung Einfrieren in flüssigem Stickstoff, gefolgt von in einem Wasserbad bei 40 ° C aufgetaut.
Anmerkung: Dies führt miteinander und spontaner Umlagerung einzelner Liposomen zu bersten, was zu einer Größenzunahme. - Bei der letzten Gefrierschritt speichern alle Proben bei -80 ° C.
Anmerkung: Die LUVs für mindestens 6 Monate stabil sein.
2. Protein Rekonstitution
- Auftauen 1 ml LUV aliquoten auf Eis. Unmittelbar vor der Rekonstitution extrudieren Liposomen 17x durch ein 400 nm Polycarbonat-Filtermembran einen Mini-Extruder.
Hinweis: Lipid-Aggregate werden entfernt und die abschließende homogene Größenverteilung erreicht wird. - Destabilisieren LUVs durch Zugabe von 4% Triton X-100 (v / v) bis zu einer Endkonzentration von 0,25% (v / v) und bei 50 ° C für 5 min inkubiert.
Anmerkung: Die Menge der Liposomen in diesem Schritt verwendet wird, hängt von der Masse des gereinigten MscL G <sup> 22 C (siehe Schritt 2.3). Reinige MscL G 22 C (abgeleitet von E. coli) , wie im Detail in 28 beschrieben. - Mischungs gereinigt MscL G 22 C und waschmittel gesättigten Liposomen um 1:20 (w / w) -Verhältnis und Inkubation für weitere 30 min bei 50 ° C.
- Zur Entfernung des Detergens bio-beads in Tris-Puffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterilfiltriert) an das Protein / Liposom-Lösung, mit 16 mg (Naßgewicht) bio-Kügelchen pro & mgr; l Detergens verwendet Liposomen zu destabilisieren in Schritt 2.2.
- Führen Sie Waschmittel Entfernung über Nacht (16 h) bei 4 ° C auf einer rotierenden Platte.
Hinweis: Die ständige Durchmischung der Lösung optimal Detergensentfernung gewährleistet. - Nach Entfernung des Detergens store Proteo bei 4 ° C und für die Experimente am gleichen Tag.
3. Aktivitätstest
- Während Protein Rekonstitution nehmen eine 100-ul-Aliquot von Detergens-destabilisiert Proteoliposoms Lösung nach 2,3 Schritt beenden.
- 1 Volumen von Calcein (30 mM) an das Protein-Liposom-Lösung und Inkubation weitere 5 min bei 50 ° C.
- Entfernen Detergens aus der Lösung, wie in Schritt von 2,4 bis 2,6.
- Nach Entfernung des Detergens eine Größenausschluss-Säule (20 ml Bettvolumen oder mehr) mit Tris-Puffer (3x das Bettvolumen) ins Gleichgewicht.
Hinweis: Proteoliposom Trennung kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden, jedoch ist die Probe zu halten konstant bei 4 ° C empfohlen wird am besten Proteinaktivität nach der Fraktionierung zu gewährleisten. - Separate Proteo von freiem Calcein durch das gesamte Aliquot Anwendung (200 ul) zu der Grßenausschlußsäule. Lassen Sie die Mischung in die Kolonne zu tränken, gefolgt von der Elution der Proteo aus der Kolonne über eine kontinuierliche Puffer Anwendung auf mit Schwerkraftfluss. Beachten Sie die Calcein Proteo als diskrete orange Bande in der Elution Vorderseite enthält. Sammeln Fraktionen von 500 & #181; l auf.
Hinweis: Free Calceinfarbstoff nach dem Proteoliposoms Fraktion mit vollständigen Trennung eluieren. - Pipette 80 ul jeder Fraktion auf einem Mikrowell-Platte für fluoreszierende Auslesen und die Fraktion identifiziert die höchste Menge an Calcein enthaltenden Proteo über Fluoreszenzemission enthält. Erkennen Fluoreszenz bei 520 nm mit einer Anregung bei 490 nm. Verwenden Sie die Proteoliposoms Fraktion mit dem höchsten Signal für den folgenden Aktivitätstest.
- Mix 20 ul der Proteoliposom enthaltenden Fraktion mit 980 & mgr; l Tris-Puffer in einer 1 ml Küvette Fluoreszenz.
- Messung der Fluoreszenzemission bei 520 nm (Anregung 490 nm) unter Verwendung eines Spektrofluorometers. Nehmen Sie für 1 min und fügen Sie dann 25 ul MTSET ([2- (Trimethylammonium) ethyl] Methanthiosulfonat) aus einer Stammlösung (160 mM) und gut mischen. Halten Sie bei der Aufnahme während des Mischens. Immer bereiten die Stammlösung frisch direkt vor dem Gebrauch.
Hinweis: Wenn in Puffer MTSET Hydrolyze gelösts innerhalb von 30 min und nicht reaktiv sein. MTSET kann bei -20 ° C bis zur Verwendung und gehalten als trockenes Pulver aliquoten abgewogen werden.
Hinweis: Wenn der aktiviert MscL G 22 C - Kanal öffnet und das eingeschlossene Calcein, zu einer lokalen Konzentrationsabnahme des Calcein führt , wenn die Proteo und anschließende Dequenching des Farbstoffes ablauf, was zu einer Erhöhung der Fluoreszenzemission. - Nachdem die Fluoreszenzemission ein stabiles Plateau wieder, solubilisieren die Liposome durch Zugabe von 50 & mgr; l Triton X-100 (4% v / v) erreicht hat.
Hinweis: Im Idealfall kann keine Erhöhung weiteren Fluoreszenz beobachtet werden, was bedeutet, aktives Protein in jedem Liposom.
4. Größenverteilung Messung von LUVs mit Nano-Partikel-Tracking
- Beachten Sie, dass nur minimale Proben der Liposomen oder Proteoliposoms Lösung für Größenverteilung Analyse notwendig sind, mit Hilfe der Nanopartikel-Tracker. Verdünnen, um eine Liposom-Lösung von 5 mg / ml Lipidkonzentration 1: 5000 (v / v) in Puffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterilfiltriert) zur Analyse auf ein Endvolumen von 1 ml. Filter alle Puffer für die Verdünnung verwendet und vor LUV Herstellung und Rekonstitution unter Verwendung eines 0,2 um Membran schwebeteilchenfrei wie Staub zu entfernen, die Größenverteilung Messungen stören würden.
- Waschen Sie die Flusskammer mit ultrareinem Wasser.
- Verwenden Sie die Oberflächenmarker auf dem Lichtstrahl zu fokussieren. Injizieren etwa 300 & mgr; l der verdünnten Liposomenprobe und sofort schließen Sie das Austrittsventil die Strömung innerhalb der Strömungskammer zu stoppen, ohne die Einführung alle Luftblasen.
- Stellen Sie den Fokus und Kamera-Auslöser / Gain-Einstellungen, um eine angemessene Streuung Signal der Probe für den Nachweis gewährleisten.
Hinweis: 20 - 80 Signale sollten in dem Sichtfeld deutlich sichtbar sein. Verhindern Überfüllung (> 80 Signale), da die Software nicht in der Lage sein, einzelne Signale zu verfolgen, wenn überlappen. - Gehen Sie auf die "Aufnahme" screen. Stellen Sie den Temperaturregler auf 25 ° C und die Aufnahmedauer auf 90 Sekunden die Software-Steuerung verwendet wird. Drücken Sie auf "Record" zu starten Aufnahme einer Zeitserie.
Hinweis: Nach Abschluss der Zeitreihe ein neues Fenster öffnet sich . - Speichern Sie die Zeitreihen im vorgegebenen Format (* .avi). Aus praktischen Gründen bei der Chargenanalyse alle Dateien in einem einzigen Ordner speichern.
- Öffnen Sie das Austrittsventil und injizieren weitere 300 & mgr; l in die Strömungskammer. Schließen Sie das Ventil und wiederholen Sie die Schritte 4,3-4,6 zweimal.
- alle Probenläufe waschen Sie die Flusskammer mit 5 ml Reinstwasser Nach Abschluss. Gehen Sie auf die "Pre-Process" Bildschirm. Stellen Sie die Kalibrierungsparameter Temperatur = 25 ° C und Viskosität = 0,91 für den Tris-Puffer in diesem Protokoll verwendet.
- Öffnen Sie die Batch-Prozessfenster und laden Sie die aufgezeichneten Zeitreihen (Advanced / Batch-Prozess / Set File 1-3). Drücken Sie auf "GO", um die Größenverteilung Analyse starten.
Hinweis: Um die analytische Software automamatisch verfolgt die einzelnen Partikel und deren Durchmesser auf ihrem Bewegungsverhalten basierend berechnet 4.8 unter Verwendung der in Schritt eingestellten Parameter.
Hinweis: Die resultierende Größenverteilung Analyse speichert automatisch in den gleichen Ordner wie die Zeitreihen - Dateien. - Zusätzlich wird eine Report-Datei erstellen, um die Ergebnisse zusammenzufassen (Export / Bericht erstellen PDF).
5. Chiphalter Vorbereitung
- Wiegen 1,0 g MDX4 medizinischer Qualität Elastomerbasis und 0,1 g MDX4 Härtungsmittels in ein 50 ml Reaktionsröhrchen. Mischen Sie beide gründlich mit einem Glasstab.
- Setzen Sie den Schlauch in einem Exsikkator für 1 h zum Entgasen der Klebstoff. verwenden Sie es anschließend innerhalb von 30 Minuten für die Chip-Verklebung, da der Klebstoff härtet und zu hart zu arbeiten.
- Während Elastomer Entgasung (Schritt 5.1) reinigen Sie eine objektive Glasobjektträger gründlich mit Chloroform keine Kontaminationen vor Chip-Bonden zu entfernen. Spülen Sie die Folie mit 5 ml Chloroform mit einer Glasspritze. Sammeln Sie dieChloroform in einem darunter liegenden Becher. Nach dem Waschen die Folie trocknen lassen.
Hinweis: Führen Sie diesen Schritt unter einer Abzugshaube. Alternativ zu Chloroform, andere organische Lösungsmittel wie Aceton, können ebenfalls verwendet werden. - Abzuscheiden, eine kleine Menge des Klebematerials auf das Deckglas eine Pipettenspitze (Kristallspitzen 10 ul Pipetten) verwendet wird. Denken Sie daran, dass die Chips in die 8-Kammer Diahalter passen müssen später auf und müssen entsprechend auf der Folie platziert werden.
- zu einer Zeit, einen Chip von der Waferplatte mit feiner Spitze Pinzette und legen den Chip auf der Klebstofftropfen auf dem Deckglas vorsichtig entfernen. Sicherzustellen, dass die beschichtete Seite des Chip nach oben zeigt.
- Schieben Sie den Chip auf dem Deckglas mit der Rückseite einer stumpfen Pinzette PE. Um sicherzustellen, dass der Leim gleichmäßig unter dem Chip ausgegeben wird, schieben Sie vorsichtig den Chip hin und her. Kritischste Schritt: Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen unter dem Chip eingefangen werden, wie es optische Bildgebung störender Chip später Hohlräume. Achten Sie auch darauf, dass kein Klebematerial der Chipoberfläche verunreinigen.
- Desiccate die fertige Deckglas für 2 Stunden bei 65 ° C in einem Trockenschrank.
Note: Chips werden immer noch mit einer Schutzschicht ausgehend von ihrer Herstellung überzogen , die entfernt werden muss. - Um die Schutzschicht zu entfernen, führen eine sequentielle Lösungsmittel Waschschritt. Bei der Härtung von Chips vorzuwärmen, einem Wasserbad auf 54 ° C.
- Platz 3 Glasbecher in das Wasserbad, zwei von ihnen gefüllt mit Isopropanol und einem mit Aceton gefüllt.
- Stecken Sie die Chipdeckglas in einen Diahalter und versenken sie in die erste Isopropanol gefüllt Gericht für 10 min. übertragen sie anschließend an das Aceton gefüllt Gericht, brüten wieder für 10 Minuten, bevor es für den letzten Waschschritt in die zweite Isopropanol Schale und Inkubation weitere 10 min zu übertragen.
- Entfernen Sie den Diahalter aus der Schale und vorsichtig waschen ausgiebig mit Ultrapure Wasser, gefolgt von der Chips mit einem sanften Stickstoffgasstrom zu trocknen.
- Take-off der Lamellenblechart aus dem 8-gut klebrig-Rutsche und legte sie zurück auf die Bank. Vorsichtig die Abdeckschlitten abholen und vorsichtig auf die klebrige Schlitten mit den Chips drücken Sie die Vertiefungen gegenüber. Lassen Sie den Chiphalter Rest fertig für ein paar Minuten vor dem Gebrauch.
6. Assay Vorbereitung
Hinweis: Nanopore Chips auf einem Deckglas geklebt und getrennt durch eine 8-Well-sticky-Slide besitzen den Vorteil, dass mehrere Chips in einem einzigen Versuchslauf angegangen werden, mit Chips vollständig voneinander getrennt sind.
- Nach dem Chiphalter Vorbereitung gründlich jeden Chip mit reinem Ethanol und Föhnen mit Stickstoffgas, alle Verunreinigungen wie Staub zu entfernen.
- Reinigen Sie die Chipoberfläche mit Luft, Sauerstoff oder Stickstoff-Plasma. Je nach Art der Plasmareinigungszeitperioden variieren: Sauerstoff-Plasmabehandlung für 1 min, Luft und nit auszuführenRogen Plasma für 5 min bei 0,3 mbar bei 80% Leistungseinstellung (HF-Leistungs mittel oder hoch).
- Nach der Plasmareinigung bebrüten Chips in reinem Ethanol für 10-15 min Hohlraum Benetzung zu gewährleisten.
- Stepwise Austausch Ethanol Puffer 400 ul Tris-Puffer Zugabe von (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterilfiltriert), gefolgt von der Einführung ohne Luftblasen und die anschließende Entfernung von 400 & mgr; l der Lösung gemischt wird. Wiederholen Sie diesen Vorgang 12 Mal, um Ethanol Entfernung zu gewährleisten.
Hinweis: Ethanol würde für Liposomen und suspendierte Lipid-Doppelschichten schädlich sein. - Dope Tris - Puffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterilfiltriert) mit 5 mM CaCl 2 und 1 uM Oy647 Farbstoff. Entfernen Sie vollständig aus dem Chip des Waschpuffers und sofort den dotierten Puffer zu dem Chip hinzuzufügen. Hinweis: Die Chips werden mit einer dünnen Pufferschicht nach dem Waschpuffer Entfernung abgedeckt werden, so dass der Chip nicht in direkten Kontakt mit der Luft ist, eine konstante Benetzung der Hohlräume und der Chipoberfläche zu gewährleisten.
- 1 mg / ml oder LUVs proteo-LUVs in Tris-Puffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterilfiltriert) in jede Vertiefung.
Hinweis: Das Endvolumen in jedem Napf 300 & mgr; l ist. Betrachten wir nachfolgende Ergänzungen des Steuer Farbstoff und dem chemischen Modifikator MTSET während dotierten Tris-Puffer hinaus. - Für poren Spanning Lipiddoppelschichtbildung auf der Chipoberfläche des Chips für 1 h bei Raumtemperatur mit der Liposom-Lösung inkubieren. Danach waschen jeden Chip mit 4x 400 ul Ca 2 + -freien Tris - Puffer.
- Fügen Sie den Steuer Farbstoff zu jeder Vertiefung mit einer Endkonzentration von 5 uM. Die Chips sind nun bereit für die Translokation Assay.
7. Assay-Setup
- Montieren Sie den Chiphalter zum Epifluoreszenzmikroskope (20X Luft Ziel, lange Arbeitsabstand). Konzentrieren Sie sich auf den Rand des Nanopore Chip leichter die Brennebene der Mikrohohlräume finden. Sobald die Hohlräume im Fokus scannen die Nanopore Array für eine Region thbei Displays Dichtungsverhältnis am höchsten.
Hinweis: Jeder invertierte Epifluoreszenzmikroskop verwendet werden kann, um Chip-Assays durchzuführen. Je nach Zielsetzung Vergrößerung (20X - 60X) die Anzahl der Kavitäten untersucht wird variieren, mit bis zu 9,000 Hohlräume in einem einzigen Sichtfeld 20-facher Vergrößerung verwendet wird. Air Ziele mit einem langen Arbeitsabstand bevorzugt. Die Verwendung von invertierten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskope (CLSM) ist ebenfalls möglich, aber die Bildaufnahme kann der begrenzende Faktor aufgrund der begrenzten Tiefe des Fokus sein. - Optimieren Sie die Chip-Beleuchtung.
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass beide Farbstoffkanäle nicht die maximale Grauwert überschreiten, da Änderungen nicht beobachtet werden können. Für den Export Experimente anpassen Beleuchtung des transloziert Farbstoff auf 90% der maximalen Signalkapazität. Passen Sie die Vergleichs-Farbstoff in offenen Hohlräumen auf 80-90% der maximalen Signalkapazität eindeutig jede undichte Membran Abdichtung erkennen. - Sobald alle Kanäle eingestellt, um die Zeitreihe starten. Nehmen Sie Bilder alle 10-20 sec für 90 min.
Hinweis: Dies ist ausreichend, um ebenfalls spezifische und unspezifische Ausströmen Ereignisse folgen. - Initialisieren Efflux des fluoreszierenden Substrats durch die Zugabe von Cystein-specific, positiv geladene Verbindung MTSET bis zu einer Endkonzentration von 3 mM. Lassen Sie mindestens 5 min Versuchslaufzeit vor MTSET zusätzlich in der Lage zu sein, später auf eine stabile Fluoreszenzsignal Basis etablieren vor Öffnung zu kanalisieren. Immer MTSET Lösung frisch direkt vor dem Gebrauch vorzubereiten.
8. Datenanalyse
- Öffnen Sie die Zeitreihen-Bildstapel mit einer Standard-Version von ImageJ (Datei / Import / Bildsequenz).
- Wenn Fluoreszenzkanäle gestapelt sind, teilen Sie die Kanäle in einzelnen Stapel für jeden Kanal (Bild / Stacks / Stack Bilder).
- Duplizieren Sie das erste Bild des Translokation Substratkanals für ROI (Regions of Interest) Identifikation (Bild / Duplizieren).
- Wandeln Sie das Bild in ein binäres Bild (Bild / Anpassen / Threshold). Dafür sorgendass der verwendete Algorithmus Signale für alle versiegelten Hohlräumen zeigt ohne pixilation überlappen.
- Automatisch Regionen mit dem Partikelanalysetool Interesse definieren (Analyse / Analysieren Teilchen). Definieren Sie eine minimale Partikelgröße definiert, um Partikelrauschen zu vermeiden. Überprüfen Sie die Optionen "ausschließen auf Kanten" und "umfassen Löcher". Stellen Sie sicher, dass resultierende ROIs die Mikroresonator-Feldmuster zu reflektieren. Interjacent ROIs sind Artefakte, sie deshalb zu entfernen. Speichern Sie die ROI-Liste.
Hinweis: Messparameter auf "Bereich" vor Partikelanalyse eingestellt werden muss (Analyse / Set Messungen / Area) - Öffnen Sie die Time Series Analyzer-Plug-in (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/time-series.html), die alle ROIs automatisch auf die gleiche Größe skaliert. Re-size alle vorhandenen ROIs auf eine Breite / Höhe von 6x6 Pixeln und ovale Form (Timer Series Analyzer / AutoROIProperties). Aktivieren Sie die Option "Größe ändern bestehende ROIS". Speichern Sie die Größe verändert ROI-Liste.
- Öffnen Sie den ROI-Manager(Analyse / Tools / ROI-Manager) und laden Sie die Größe verändert ROI-Liste für jeden Kanal der Zeitreihe (ROI Manger / Mehr / Open). ROIs wird überlagert werden. Zur Analyse der Signaländerung für jeden ROI starten Sie das Multi Werkzeug messen (ROI Manager / Mehr / Multi Measure), wählen Sie "Messen Sie alle Scheiben" und "Eine Zeile pro Scheibe" und starten Sie das Multi Maßnahme.
Hinweis: Messparameter eingestellt werden muss, um "bedeuten Grauwert" für diesen Schritt (Analyse / Set Messungen / Mittlerer Grauwert) - Speichern Sie die Tabelle, die mittlere Grauwert für jeden ROI in * .txt oder * .xls Format zu geben.
- Importieren Sie die ROI-Analyse jeder Bildgebungs Kanal in NanoCalcFX über den "Datei importieren" Option. Stellen Sie "Verwenden Sie erste Zeile Serie für die Benennung". Stellen Sie die Schrittweite zwischen den Bildern nach den Serie Bildaufnahmeperioden Zeit und wählen Sie die entsprechende Spalte und Dezimaltrennzeichen.
- Verwenden Sie die "Mehrfachblatt" Option, um automatisch die Graphen der einzelnen Fluo korrelierenrescent Kanäle.
Hinweis: Die Ereignisse können nun analysiert und klassifiziert die durch die 3-Farben-spektrale Information enthaltenen Informationen verwenden. - Fit ausgewählte Kurven, die die Build-in-Fit-Funktion (Fit-Option) verwenden.
Hinweis: Die implementierte Ausströmen und Einströmen Gleichung eignet sich für alle monoexpotentielles diffusionsgetriebene Ereignisse und fit Grenzen gesetzt werden können. Daraus resultierende Geschwindigkeitskonstanten können mit dem Histogramm-Tool oder exportiert für die weitere Datenveredelung aufgetragen werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pore-Spanning Membranen können leicht auf der Oberfläche nanostrukturierten Chip in einer selbstorganisierenden Weise erstellt werden. Doch der zugrunde liegende Prozess ist noch zart und von vielen Parametern wie Liposomgröße, Monodispersität der Liposomen-Population, Lamellarität, Lipid- und Salz-Konzentration und chemischen Oberflächeneigenschaften beeinflusst. Die meisten dieser Parameter sind in dem obigen Protokoll sorgfältig charakterisiert und standardisiert. Andere Parameter sollten jedoch bei jeder neuen Zubereitung geprüft werden, ein erfolgreiches Experiment zu gewährleisten. Dies sind die Liposomengrößenverteilung und Dispersität Population (Fig. 2 A). Für eine optimale Poren Spanning Membranbildung und Liposom Eindringen in den Hohlraum Liposomengrößen deutlich über dem Porendurchmesser sind eine Notwendigkeit, zu vermeiden. Darüber hinaus haben monodisperse Liposompräparate verbreitet und fusi gezeigt, die besten Ergebnisse in der Membran ergebenauf. Ein weiterer entscheidender Schritt, der für jede Zubereitung geprüft werden muss, ist die Proteinaktivität nach der Rekonstitution. Mit Hilfe eines Fluoreszenz-Dequenching Assay für Liposomen rekonstituiert mit MscL G 22 C, können die Kanalöffnung über Fluoreszenzspektroskopie überwacht werden, um ein Verhältnis von Liposomen beherbergen aktive MscL G 22 C - Protein zu geben (Abb. 2 B).
Sobald verteilt auf die Chipoberfläche, solute Translokation eines fluoreszierenden Ziel durch MscL G 22 C bei der Ligandenaktivierung kann verfolgt werden (Fig. 3 B). Ausgeführt MscL G 22 C - Kanäle werden in ihren Standardzustand geschlossen, kleine fluoreszierende Moleküle in den Hohlraum einschließenden. Durch Zugabe des chemischen Modulators MTSET positive Ladungen werden dem Einschränkungsbereich eingeführt vondie MscL G 22 C Pore, drückt es durch elektrostatische Abstoßung offen. Der Stand der eingeschlossenen Fluorophor ausweicht den Hohlraum Diffusionsgleichgewicht zu erreichen. Die anschließende Abnahme der Fluoreszenz innerhalb des Hohlraums Raum überwacht werden. Dieses Verfahren ist sehr gut reproduzierbar, was zu einer homogenen Population von Efflux Ereignisse (Fig. 3 C). Die sich ergebenden Ausfluß Kurven Cluster in zwei unterschiedlichen Populationen, die Fähigkeit des Assays demonstrieren zwischen Ein- und Mehrkanal Translokationsereignisse (Abb. 3 D) zu unterscheiden. Des Weiteren ist das System in der Lage zu folgen, bis zu drei spektral gut getrennt Farbstoffe parallel und in Echtzeit, so dass es möglich High-Content-Screening und diskriminieren genau und objektiv zwischen positiven, falsch-positive und negative Ergebnisse aufzuzeichnen. In dieser Studie wurden versiegelt 9,046 Hohlräume analysiert, davon 8% angezeigt EFFLux Verhalten. Bereitstellen der unterschiedlichen Fluoreszenzauslesekanäle können Ereignisse in monoexpotentielles Ausströmen Ereignisse unterschieden werden, komplexe Kinetik, Lipid - Intrusionen und Membran platzt (Abb. 3 E). Nur Ereignisse, die stetige Signale für die Steuer gelösten Stoff und dem Membranfarbstoff angezeigt werden für die endgültige Analyse berücksichtigt. Komplexe Kinetik repräsentieren Ausströmen Ereignisse mit instationären Steuersignale und daher verzichtet werden. Lipid Intrusionen und Membran Brüche sind Artefakt Ereignisse eigenporen Spanning Lipid-Doppelschicht-Systemen auftreten, verwendet wird. Sie können die Vergleichs -Farbstoff - Signale verworfen werden , wie oben (Fig. 4) genannt.
Abbildung 2. Die Größenverteilung von Proteo und MscL Funktion. A) Vesikeln waren analyz ed durch Nano-Partikel-Tracking-Analyse. LUV Proben wurden vor (schwarze Kurve) untersucht und nach dem Auflösen von MscL G 22 C (rote Linie). Nach LUV Herstellung wird eine mittlere Teilchengröße von 214 ± 70 nm erreicht. Die Größe wird während der Aufbereitung verringert, was zu einer Proteo von 158 ± 60 nm groß. B) MscL Aktivität wurde nach dem Auflösen von einem Ausströmen Assay validiert. 28 Selbst abgeschreckte Calcein von Proteo durch MTSET vermittelte Öffnung des MscL Kanal freigegeben wird, was zu Dequenching des Fluorophors (rot) und einem raschen Anstieg der Fluoreszenzintensität. Liposome ohne Protein zeigen keine solche Ausströmen selbst nach wiederholten MTSET zusätzlich (schwarz). Anschließende waschmittel eingeführt Solubilisierung (TX-100) der Liposomen Mitteilungen alle zuvor Farbstoff eingekapselt. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von 21 wiederverwendet werden.et = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Liganden-gesteuerte solute Translokation von MscL auf Einzelmolekülebene. A) Engineered MscL G 22 C - Kanäle werden in ihren Standardzustand geschlossen. Kleine gelöste Stoffe wie beispielsweise ein Fluorophor sind nicht in der Lage weder durch den Kanal noch die Lipid-Doppelschicht zu übergeben. Nach der Zugabe von MTSET, einer konstruierten einzigen Cystein jedes MscL G 22 C Protomers wird modifiziert, mehrere positive Ladungen in der Engstelle Seite des pentamerem - Kanal - Komplex einzuführen. Die MscL G 22 C - Kanal wird aufgedrückt durch Ladungsabstoßung und die eingeschlossene Farbstoff kann der Hohlraum diffundieren, was zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität. B) Timir Spuren von MscL G 22 C Öffnung bei der Zugabe von MTSET. Proteo funktionell rekonstituierten MscL G 22 C enthielten , wurden auf der Chipoberfläche verteilt. Oy647 (rot) wurde in den Hohlräumen als Translokation Substrat eingeschlossen ist. OregonGreen Dextran (70 kD, grün) wurde zugegeben, als Kanal impermeable Steuer Substrat die Substratspezifität des Transportereignis sowie die Membranintegrität während des Versuchs zu überwachen. LUVs wurden mit DOPE ATTO 390 (0,1 Mol%; lila) , ergänzt für die Lipid - Kontamination innerhalb von Hohlräumen zu überprüfen. Die Zugabe von MTSET (3 mM final) bei t = 0 sec öffnet den Kanal, was zu Oy647 Ausströmen aus den Hohlräumen, aufgezeichnet über Fluoreszenz ausgelesen. C) Zufall ausgewählt MscL G 22 C Ausströmen Kurven zeigen typische Ausströmen Ereignisse. D) Bewerten Konstanten für die Translokation Ereignisse (n = 242) Cluster in zwei Gauß-Populations, was zeigt , dass Ein- und Mehrkanal - Transportereignisse unterschieden werden kann. E) High-Content - Screening und die statistische Analyse von 9046 versiegelten Chip Hohlräume durch Triple-Farbe Echtzeit - Anzeige. 8% aller analysierten Chip Hohlräume zeigen exponentielles Ausströmen Ereignisse. Durch spektrale Decodierung (rot: transloziert gelösten Stoff, grün: Steuer gelösten Stoff, violett: Lipid), Ausströmen Ereignisse könnten komplexe Kinetik, Lipid-Intrusionen und Membranbrüchen unterschieden werden, so Fehlalarme zu eliminieren. Diese Zahl wurde mit Erlaubnis wiederverwendet werden von 21. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 4. Ereignisklassen zeichnen sich durch eine Drei-Farben - Erkennung. Transloziert gelösten Stoff (rot), control gelösten Stoffen (grün) und ein Lipid - Farbstoff (violett) können spektral so dass für unvoreingenommene Datenauswahl unterschieden werden. A) Sealed Hohlräume beherbergen keine Membranprotein zeigen keine Fluss Ereignisse unter den experimentellen Bedingungen für den MscL Kanal beschrieben Aufzeichnung (siehe Fig. 3A) . Die Leuchtstoffauslese ist stabil für alle Kanäle. B) suspendiert Ill definierten Lipid - Doppelschichten sind in der Lage den Hohlraum eindringen. C) Membranruptur Ergebnisse in diskontinuierlichen Lipiddoppelschicht die Nanopore Fissuren überspannen. Dadurch wird der Hohlraum nicht mehr vom Pufferraum getrennt. Eingeschlossene Farbstoffe (rot) entziehen den Hohlraum nach unten den Konzentrationsgradienten. Die Steuer gelösten Stoffes (grün), die zuvor nicht in der Lage über die Membran passieren, tritt in den Hohlraum. D) Beispiel für eine Lipid - Einbruchsereignis. Während das Fluoreszenzsignal für die Lipid-Farbstoff (violett) auf Grund der Membran den Hohlraum eindringenden zunimmt, wird die Translokation solute pushed aus dem Hohlraum (rot), zu einer Abnahme der Fluoreszenzsignal führt. Die Nanopore durch die Lipid - Doppelschicht blockiert wird, um den Durchgang des Steuersubstrats verhindert (grün). E) während der Membranbruch, der eingeschlossene Transport solute ausweicht schnell aus dem Hohlraum (rot), während die Kontroll solute in (grün diffundiert). Diese Zahl wurde mit Erlaubnis wiederverwendet werden von 21. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die hier vorgestellte Technik ermöglicht eine hochparallele Analyse von Membranproteintransport. Rekonstituierten Membranprotein-Systeme können direkt auf dem Biochip aufgebracht werden, so dass die Anpassung der theoretisch jeder Membrantransporter oder möglichen Kanal. Transport-Analyse wird durch die Einrichtung eines fluoreszierenden Auslesesystem, entweder durch direkte Fluoreszenzänderung (Translokation von Fluorophore oder fluoreszenzmarkierte Substrate) oder indirekte Fluoreszenzänderung (pH-sensitiven Farbstoffen, sekundäre enzymatische Reaktionen) begrenzt. Letzteres ist jedoch noch zu aufgebaut werden.
Funktionelle Charakterisierung von Membrankanälen oder Transporter auf dem einzelnen Protein-Ebene liegt der Schwerpunkt dieser Technik. In Kombination mit einem automatisierten Mikroskop, ist die Einrichtung von Screening-Anwendungen zur Protein Effektoren möglich. Der Test-Setup ermöglicht die parallele Aufzeichnung von bis zu 8 Chips mit mehreren Testpunkten auf jedem Chip. Aufgrund der vollständigen Trennung der Chips, ist es wirklich parallel, so dass für mehrere Versuchswiederholungen Kontrollen in einem einzigen Versuchslauf einschließlich, sobald die Bedingungen festgelegt.
Kritische Schritte während eines Experiments Einrichtung sind die Herstellung von wirklich unilamellaren Vesikeln, die aktive Rekonstitution des Proteins der Wahl von Proteo auf der Chipoberfläche und der Rückhaltevermögen der aufgehängten Lipiddoppelschicht zu den Substraten in dem Assay Ausbreitungseffizienz.
Während die Herstellung von unilamellaren Vesikeln von grundlegender Bedeutung für diesen Test ist die Einrichtung multilamellare Membranblätter auf der Chipoberfläche während suspendiert Lipiddoppelschichtbildung zu vermeiden, ist es ziemlich einfach unilamellarity der Vesikel durch Beschallen der Liposomen während der Herstellung zu gewährleisten.
Die direkte Anwendung von Proteo ist der große Fortschritt des Verfahrens presented. Im Gegensatz zu bisherigen Ansätzen komplexer und medizinisch relevante Proteine nun ausgerichtet werden können, erfordern natürlich die vorherige Einrichtung eines Rekonstitutionsprotokoll funktionellen Proteins der Wahl in LUVs ergibt. Zusätzlich Membranproteine große extraMembranDomänen besitzen, verringern die Bildung von richtigen SSM. Dies muss für jedes neue Protein optimiert werden, beispielsweise durch die Konzentration CaCl 2 variiert.
Die Rekonstitution Verhältnis des Proteins von Interesse muss sorgfältig ausgewählt werden. Die Analyse der einzelnen Protein Ereignisse gewünscht und accomplishable die hier vorgestellten Technik. Die Menge des rekonstituierten Protein sollte daher nicht mehr als 1-2 funktionelle Proteineinheiten pro poren Spanning Membranfleck eine ideale Rekonstitution unter der Annahme, und dass das Membranprotein stochastisch durch die Doppelschicht verteilt. Zusätzlich wird die Direktionalität des Proteins nach der Rekonstitution auch im Auge behalten werden sollte, da es not zwischen beiden Ausrichtungen gleich sein.
Schließlich, wenn alle diese Fragen sorgfältig geprüft und optimiert werden, keine der verwendeten Substrate können jede unspezifische Membrandurchlässigkeit der Poren Spanning Membran anzuzeigen. Positiv geladene Fluorophore, wie die meisten Rhodamin-Farbstoffe im roten Spektralbereich Regime dazu neigen, schnell die Membranbarriere überwinden. Starke hydrophobe Wechselwirkungen kann auch auf eine unspezifische Bindung an die Lipiddoppelschicht führen. Beide Eigenschaften sind nicht erwünscht.
Die Untersuchung von Ionenkanälen in einer qualitativen Art und Weise ist auch denkbar. Screening für Kanal Effektoren ein binäres Ja / Nein Auslesen mit gedacht werden könnte ionensensitive Farbstoffe zu verwenden. Das größte Hindernis hier wäre die Einrichtung eines zumindest teilweise ionenHalte Lipid-Doppelschicht. Dies kann nur durch Oberflächenmodifikation der Nanopore Chip erreichbar sein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| [2-(Trimethylammonium)ethyl] methanethiosulfonate |
Toronto Research Chemicals Inc. | T792900 | MTSET; hydrolized by water. Keep as dry pouder aliquot at -80 °C. Use immediately (30 minutes) after solubilization in buffer. |
| 1 ml gas-tight syringe | Hamilton | #1001 | |
| 10 ml round flask | Schott Duran | ||
| 2.7 mm glas beads | Roth | N032.1 | |
| 2-Propanole | Roth | 9866.5 | |
| 30 cm Luer-Lock Extension Tube | Sarstedt | 744304 | |
| Acetone | Roth | 5025.5 | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent | Bio-Rad | 152-3920 | need to be activated before first use |
| CaCl2 Dihydrat | Roth | HN04.3 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | store dark at -20 °C |
| Chloroform reagent grade | VWR Chemicals | 22711324 | |
| DOPEATTO390 | ATTO-TEC | AD 390-165 | store dark at -20 °C |
| Ethanol absolute | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Injekt Single-use syringe | Braun | 460 60 51V | |
| Injekt-F single-use syringe | Braun | 91 66 017V | |
| Keck clips | Schott | KC29 | |
| L-α-Phosphatidylcholine, 20% (Soy) | Avanti Polar Lipids | 5416016 | store under inert gas at -20 °C |
| NaCl 99.5% p.a. | Roth | 3957.2 | |
| Nanopore E100 wafer/chips | Micromotive (Mainz/Germany) | available on request | |
| Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 µm | Whatman | 800282 | |
| Oregon Green Dextran 488 (70 kDa) | life Technologies | D-7173 | store dark at -20 °C |
| Oy647 | Luminartis (Münster/Germany) | OY-647-T-1mg | store dark at -20 °C |
| Rotilabo-syringe filtration, unsterile, pore-size 0.22 µm | Roth | P 818.1 | |
| Sephadex G-50 | Sigma-Aldrich | G5080 | column material for size exclusion chromatography |
| Silastic MDX4-4210 | Dow Corning | curing agent for chip fixation onto cover glass support | |
| sticky-Slide 8-well | ibidi | 80828 | multi-well chamber for the mounting onto glass slides (chip holder) |
| Three-way stopcock blue | Sarstedt | 744410001 | |
| Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality | Roth | 5429.2 | |
| Triton-X 100 | Roth | 6683.1 | |
| Whatman 0.2 µm cellulose nitrate membrane filter | Roth | NH69.1 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Büchi 461 water bath | Büchi | ||
| Büchi Rotavapor RE 111 | Büchi | ||
| Cary Eclipse Fluorescence Spectrophtometer | Varian | ||
| LiposoFast Mini Extruder | Avestin | ||
| Membrane pump | Vaccubrand | 15430 | |
| Nanosight Nanoparticle Tracking Microscope | Malvern / Nanosight | LM 14C | |
| NyONE microscope | Synentec | available on request | |
| Pump control | Vaccubrand | CVC 2II | |
| Sonicator bath Sonorex RK100H | Brandelin electronic | 31200001107477 | |
| Vaccum pump RC5 | Vaccubrand | 1805400204 | |
| Water bath W13 | Haake | 002-9910 | |
| Plasma Cleaner PDC-37G | Harrick Plasma | PDC-37G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| ImageJ | Open Source | http://imagej.nih.gov/ij/ | scientific image processing software |
| NanoCalcFX | Freeware | http://sourceforge.net/projects/nanocalc/ | data analysis/evaluation software for massive transport kinetic datasets |
| NTA 2.3 Analytical Software | Nanosight | data acquisition and analysis software for nanoparticle tracking microscope | |
| NTA 2.3 Temperature Comms | Nanosight | temperature controle software for nanoparticle tracking microscope |
References
- Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. Drug-target network. Nat Biotechnol. 25, 1119 (2007).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Osaki, T., Suzuki, H., Le Pioufle, B., Takeuchi, S. Multichannel simultaneous measurements of single-molecule translocation in α-hemolysin nanopore array. Anal. Chem. 81, 9866-9870 (2009).
- Carrillo, L., et al. High-resolution membrane capacitance measurements for studying endocytosis and exocytosis in yeast. Traffic. , (2015).
- Giacomini, K. M., et al. Membrane transporters in drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 9, 215-236 (2010).
- Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 3134-3138 (2012).
- Zollmann, T., et al. Single liposome analysis of peptide translocation by the ABC transporter TAPL. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 2046-2051 (2015).
- Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophys. J. 47, 105-113 (1985).
- Sackmann, E. Supported membranes: scientific and practical applications. Science. 271, 43-48 (1996).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).
- Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys. J. 79, 1400-1414 (2000).
- Naumann, C. A., et al. The polymer-supported phospholipid bilayer: tethering as a new approach to substrate-membrane stabilization. Biomacromolecules. 3, 27-35 (2002).
- Weiskopf, D., Schmitt, E. K., Klühr, M. H., Dertinger, S. K., Steinem, C. Micro-BLMs on highly ordered porous silicon substrates: Rupture process and lateral mobility. Langmuir. 23, 9134-9139 (2007).
- Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nat. Commun. 5, (2014).
- Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels. Angew. Chem. Int. Ed. 115, 5738-5741 (2003).
- Lohr, C., et al. Single Liposomes Used to Study the Activity of Individual Transporters. Biophysical Journal. 106, 229a (2014).
- Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and physiology. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 358-368 (2008).
- Milligan, C. J., et al. Robotic multiwell planar patch-clamp for native and primary mammalian cells. Nat. Protoc. 4, 244-255 (2009).
- Soga, N., Watanabe, R., Noji, H. Attolitre-sized lipid bilayer chamber array for rapid detection of single transporters. Sci. Rep. 5, (2015).
- Kleefen, A., et al. Multiplexed parallel single transport recordings on nanopore arrays. Nano Lett. 10, 5080-5087 (2010).
- Wei, R., Gatterdam, V., Wieneke, R., Tampé, R., Rant, U. Stochastic sensing of proteins with receptor-modified solid-state nanopores. Nat. Nanotechnol. 7, 257-263 (2012).
- Urban, M., et al. Highly parallel transport recordings on a membrane-on-nanopore chip at single molecule resolution. Nano Lett. 14, 1674-1680 (2014).
- Kusters, I., Van Oijen, A. M., Driessen, A. J. Membrane-on-a-Chip: Microstructured Silicon/Silicon-Dioxide Chips for High-Throughput Screening of Membrane Transport and Viral Membrane Fusion. ACS Nano. 8, 3380-3392 (2014).
- Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. Lipid directed intrinsic membrane protein segregation. J. Am. Chem. Soc. 135, 17294-17297 (2013).
- Heinemann, F., Schwille, P. Preparation of Micrometer-Sized Free-Standing Membranes. ChemPhysChem. 12, 2568-2571 (2011).
- Lazzara, T. D., Carnarius, C., Kocun, M., Janshoff, A., Steinem, C. Separating attoliter-sized compartments using fluid pore-spanning lipid bilayers. ACS nano. 5, 6935-6944 (2011).
- Winterhalter, M. Black lipid membranes. Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 5, 250-255 (2000).
- Koçer, A., Walko, M., Feringa, B. L. Synthesis and utilization of reversible and irreversible light-activated nanovalves derived from the channel protein MscL. Nat. Protoc. 2, 1426-1437 (2007).
