يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
خلية الفحص مجاني لدراسة لونين Decondensation في نهاية الانقسام
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
خلال دورة الخلية الفقارية ، يخضع الكروماتين لتغييرات هيكلية ووظيفية واسعة النطاق. عند الدخول الانقسامي ، يتكثف بشكل كبير في كروموسومات على شكل قضيب يتم تحريكها بشكل فردي بواسطة جهاز المغزل الانقسامي. ينتج عن تكثيف الكروماتين الانقسامي كروموسومات مضغوطة أكثر كثافة بمقدار خمسين ضعفا كما هو الحال في الطور البيني. أثناء الخروج من الانقسام ، يتعين على الكروموسومات إعادة تأسيس حالة الطور البيني الوظيفية ، والتي يتم إحاطتها بغلاف نووي ومختصة بالنسخ المتماثل والنسخ. تم وصف عملية إزالة التكثيف بشكل جيد من الناحية الشكلية ، ولكن من الناحية الجزيئية غير مفهومة جيدا: نحن نفتقر إلى المعرفة حول الأحداث الجزيئية الأساسية وإلى حد كبير العوامل المعنية بالإضافة إلى تنظيمها. نصف هنا نظاما خاليا من الخلايا يلخص بأمانة إزالة تكثيف الكروماتين في المختبر ، بناء على مجموعات الكروماتين الانقسامية المنقاة من خلايا HeLa المتزامنة و X. مستخلص البيض X. laevis. يوفر نظامنا الخالي من الخلايا أداة مهمة لمزيد من التوصيف الجزيئي لإزالة تكثيف الكروماتين وتنسيقه مع العمليات التي تحدث في وقت واحد أثناء الخروج الانقسامي مثل الغلاف النووي وإعادة تجميع المسام المجمعة.
المقدمة
القيطم المورق استخراج البيض هو أداة قوية والتطبيقية على نطاق واسع لدراسة الأحداث الخلوية المعقدة في بساطة مقايسة خالية من الخلايا. منذ أول وصف من قبل Lohka وMasui 1 كانت قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة العمليات الإنقسامية مثل لونين التكثيف 2، والتجمع المغزل 3، المغلف انهيار النووي 4، ولكن أيضا وسائل النقل نووي هيولي 5 أو 6 تكرار الحمض النووي. الأحداث الجارية في نهاية الانقسام، اللازمة لإعادة تشكيل نواة interphasic مثل إصلاح الغلاف النووي والمسام النووي إعادة التجميع المعقدة هي أقل بكثير يفهم مقارنة أحداث الإنقسامية في وقت مبكر ولكن يمكن دراستها على نحو م....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
الإنقسامية لونين عزل الكتلة من الخلايا هيلا
1. الاستعدادات
- حلول الثقافة الخلية
- إعداد المتوسطة المعدلة النسر كاملة Dulbecco ولل(DMEM) وذلك بإضافة 10٪ مصل الجنين العجل، 100 وحدة / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل و 2 ملي الجلوتامين إلى DMEM. إعداد المالحة العازلة ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الاعتماد وقت رد الفعل decondensation
ويبين الشكل 1 دورة الوقت النموذجي للمقايسة decondensation. الكتلة من الكروموزومات واضحة في بداية رد فعل decondenses ويدمج في عملية واحدة، وجولة ونواة سلسة. عندما يتم استبدال استخراج البيض من قبل السكروز العازلة تبقى الكتلة كروموسوم المختصرة، التي تشير إلى أن النشاط decondensation موجود في استخراج البيض.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
القيطم المورق مقتطفات البيض هي أداة مفيدة جدا لإنتاج بأمانة العمليات الخلوية في المختبر، وكان يستخدم هذا النظام بنجاح في توصيف دورة الخلية وانقسام الخلية أحداث 2، 3،5،6،17. ونظرا إلى مخازن كبيرة من المكونات النووية المحجوزة في البيض خلال oogenesis وعصائر البيض هي مصدر ممتاز لمكونات الخلية. بالمقارنة مع المناهج الأخرى مثل رني على خطوط الخلايا أنسجة الثدييات أو التلاعب الجيني، ويقدم العديد من المزايا: نظام خالية من الخلايا يسمح دراسة العمليات .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل المؤسسة الألمانية للبحوث وERC (AN377 / 3-2 وCHROMDECON 309528 لWA) وعلى زمالة الدكتوراه من بورنغير إنغلهايم فون إلى AKS الشكل 1 و 2 وأعيد طبعه من التطور الخلوي 31 (3)، Magalska وآخرون، وظيفة ATPases RuvB تشبه في لونين decondensation في نهاية الانقسام، 305-318، 2014 بعد الحصول على اذن من السيفير.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| رباعي هيدروكلوريد السمبير | فلوكا التحليلي | 85610-25G | |
| سبيرميدين ثلاثي هيدروكلوريد | سيجما ؛ | S2501-5G | |
| ديجيتونين عالي النقاء | Millipore | 300410-1GM | سام |
| PMSF | Applichem | A0999،0100 | |
| ثيميدين | كالبيوكيم | السام 6060 | |
| نوكودازول | كالبيوكيم | 487928 | محلول |
| فورمالديهايد سام 37٪ محلول فورمالديهايد | روث | 7398-1 | |
| تريبان أزرق سام (0.4٪ ) | سيجما | T8154 | سام |
| 1،4-ديثيوثريتول (DTT) روث | 6908.2 | ||
| AEBSF هيدروكلوريد | Applichem | A1421،0001 | |
| بيبستاتين | روث | 2936.1 / 2/3 | |
| ليوببتين | روث | CN334 | |
| أبروتينين | روث | A162.3 | |
| بيركول (جزيئات السيليكا الغروية الحل) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| الجلوتامين | جيبكو | 25030-024 | |
| البنسلين الستربتومايسين | جيبكو | 15140-122 | |
| 75 سم & sup2 قوارير زراعة الأنسجة | Greiner Bio-one | 658175 | |
| مصل الأبقار الجنينية المعطل بالحرارة (FBS) | Gibco | 10500-064 | |
| الخالط (40 مل مطحنة الأنسجة) | Wheaton | 357546 | |
| Neubauer chamber | Assistent | 441/1 | |
| أنابيب الطرد المركزي أوك ريدج ، بولي كربونات (50 مل) | Nalgene | 3118-0050 | |
| 100 & micro ؛ مصفاة الخلايا m ، النايلون | BD Falcon | 352360 | |
| cytochalasin B | Applichem | A7657،0010 | |
| cycloheximide | Roth | 8682.3 | |
| L-cystein | Merck | 1،028،381،000 | |
| hCG متوفر في Ovogest | MSD | 1431593 | |
| PMSG متاح مثل Intergonan | MSD | 1431015 | |
| A23187 (ملح الكالسيوم والمغنيسيوم المختلط) Enzo | ALX-450-002-M010 | ||
| إبر حقنة سامة (1.20 × 40 مم ، 18 جم × 1 1/2 بوصة) | Braun | 4665120 | |
| ATP | Serva | 10920.03 | |
| GTP ، 2 Na × 3 H2< / sub>0 | Roth | K056.1 / 2/3/4 | |
| الكرياتين فوسفات ملح ثنائي الصوديوم | Calbiochem | 2380 | |
| الكرياتين فوسفوكيناز | سيجما | C3755-35KU | |
| DMAP | Sigma | D2629-1G | |
| DAPI ؛ | Roche | 10236276001 | |
| السامة | PFA | Sigma | P-6148 |
| ل TLA 100 (7 × 10 مم ، 5/16 × 13/16 بوصة) | بيكمان كولتر | 343775 | |
| "Cell-Saver" (نصائح ذات فتحة واسعة ، 1,000 & micro ؛ ل) | Biozym | 729065 | |
| محلول جلوتارالديهايد 50٪ ، الصف الأول | Sigma alderich | G7651-10 مل | محلول |
| بولي L-lysine سام 0.1٪ (وزن / حجم) | Sigma | P8920-100 مل | |
| (6 مل ، 16.0 / 55 مم) | Greiner Bio-one | 145211 | |
| Vectashield تركيب متوسط | مختبرات ناقلات | H1000 | |
| أنابيب TLA120 (11 × 34 مم ، 7/16 × 1 3/8 بوصة) | بيكمان كولتر | 343778 | |
| "Cell-Saver" (نصائح ذات فتحة واسعة ، 200 & micro ؛ ل) | Biozym | 729055 | |
| أغطية 12 مم | Thermo Scientific | 0784 # 1 |
المراجع
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
- de la Barre, A. E., Robert-Nicoud, M., Dimitrov, S. Assembly of mitotic chromosomes in Xenopus egg ext....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
