Summary
O objetivo deste protocolo é para demonstrar como controlar a dinâmica da proteína fluorescente marcadas nas superfícies das células da planta com microscopia de epifluorescência de ângulo variável, mostrando pontos de PATROL1 marcadas com GFP, uma proteína tráfico membrana piscando, no córtex celular do complexo estomático em Arabidopsis thaliana.
Protocol
1. Preparação de Mudas
- Esterilizar as sementes.
- Preparar a solução de esterilização por adição de 500 ul de NaClO (cloro disponível: 5,0%) e 1 ul de 10% de Triton X-100 a 500 ul de água estéril.
- Local ca. 10 transgénica A. thaliana sementes que transportam GFP-PATROL1 8 para um tubo de 1,5 ml.
- Adicionar 1 ml de solução de etanol a 70% e misturar bem por inversão cinco vezes. Deixe por 1 min.
- Observar as sementes afundam para o fundo do tubo. Em um gabinete de fluxo laminar limpo, remova cuidadosamente a 70% de etanol utilizando uma micropipeta, e adicionar 1 ml de solução de esterilização. Misturar bem invertendo cinco vezes e deixar durante 5 min.
- Lavam-se as sementes. Ainda trabalhando sob condições assépticas em uma bancada limpa, retire suavemente a solução utilizando uma micropipeta, e adicionar 1 ml de água estéril. Repita isso cinco vezes. As sementes esterilizadas podem ser armazenados em água estéril a 4 ° C durante 2 dias.
- assimw as sementes esterilizadas em um 0,5% gellan solidificou-gum 1/2 Murashige e Skoog placa de meio (pH 5,8) 9. Tape o tampa sobre a placa utilizando duas camadas de fita cirúrgica.
- Incubar a placa no escuro a 4 ° C, com uma câmara de armazenamento frio, S / N.
- Transferir a placa em uma câmara de crescimento fixada em 23,5 ° C com uma 12-h / 12 horas de luz-escuridão ciclo utilizando 100 umol m -2 s -1 luzes brancas, e incubar durante 7 dias. As plântulas com cotilédones de cerca de 1 mm de comprimento pode então ser colhida.
2. Céu Gota de montagem de Cotilédone Amostras
NOTA: Um fator importante na preparação de amostras para observação VAEM é evitar a inclusão de bolhas de ar entre a amostra ea tampa de vidro. Bolhas reduzir significativamente a qualidade da imagem de VAEM por causar diferenças no índice de refracção. Um método simples, a que chamamos «céu gota 'de montagem, pode ser usado para evitar bolhasentre a A. cotilédones thaliana e a tampa de vidro. Isto deve ser feito imediatamente antes da observação.
- Colocar 30 mL de tampão basal [5 mM de 2- (N-morfolino) etanossulfónico ácido-Tris (MES-Tris) a pH 6,5, KCl 50 mM, 100 uM de CaCl 2] no centro de uma lâmina de vidro (tamanho: 76 × 26 mm, espessura: 1,0-1,2 mm).
- Remover um cotilédones de uma muda de 7 dias de idade usando tesouras de dissecção. Flutuador o cotilédone com a observação lateral virado para cima sobre a gota de tampão basal (Figura 1, passo 1).
- Colocar 30 mL de tampão basal no centro de uma tampa de vidro (tamanho: 18 × 18 mm, espessura: 0,12-0,17 mm) (Figura 1, passo 2). Vire a tampa de vidro de cabeça para baixo suavemente. Tensão superficial impedirá a queda tampão de cair. Segure a tampa de vidro com uma pinça em uma extremidade. Coloque a borda oposta sobre a lâmina de vidro, de modo que a queda de tampão é de cerca de cima do cotilédone.
- Com a extremidade de tampa de vidro ainda no slide, e ainda com a extremidade oposta, com uma pinça, ajustar a posição do tampão de gota sob o vidro de cobertura de modo a que seja directamente por cima da amostra de cotilédones (Figura 1, passo 3). Deixe de lado a tampa de vidro. Montar uma gota sobre a amostra resultante em uma preparação sem bolhas de ar.
- Limpe o excesso de buffer usando tecidos que não soltem fiapos. Observe a preparação de imediato (ver passo 3).
NOTA: Não há nenhuma necessidade para selar as amostras.
3. VAEM Observação e Aquisição de filme
NOTA: O sistema de microscópio TIRF 9 utilizada no presente estudo é descrito como se segue: Um microscópio invertido está equipado com uma unidade de TIRF e uma lente objectiva TIRF com uma abertura numérica de 1,49. Para o controle informatizado do ângulo de entrada de laser, uma caixa de controle é usado. A proteína fluorescente verde (GFP) está animado com a 488 nm laser semicondutor de bombeamento óptico, e tele fluorescência é detectada através de um filtro passa-banda para impedir a 510-550 nm a partir de cloroplastos autofluorescência. O valor máximo medido de potência de saída de fibra é 13,0-13,5 mW. Para a detecção, um elétron multiplicando dispositivo de carga acoplada (EM-CCD) Sistema de cabeça de câmera e uma unidade de mudança de ampliação da câmera C-mount são usados.
- Calibra-se o laser de centragem e de focagem de acordo com as instruções do fabricante.
NOTA: Este passo é crucial para observações VAEM precisos. É altamente recomendável que as verificações periódicas dos procedimentos de ajuste de caminho laser, apropriado para o seu microscópio, são realizadas.- Determinar a posição central iluminado com um caminho objetivo luz livre de lente no teto da sala de microscopia. Para marcar a posição central, colocar um selo colorido círculo no teto (Figura 2, passo 1, 2).
- Iluminar o tecto com uma lente objectiva (Figura 2, Passo 3, 4). Mova o illuminated região para a posição central (Figura 2, passo 5). Foque a laser (Figura 2, Passo 6). Afinar a posição do laser focado para o centro (figura 2, o passo 7).
- Defina uma amostra na platina do microscópio e selecione as células para a observação com uma iluminação de campo claro.
- Verificar que a proteína fluorescente pode ser observada nas células, e definir a posição z -axis na superfície da célula utilizando iluminação epi fluorescência (Figura 3A).
- Execute observações VAEM.
- Inclinar o ângulo de entrada do feixe de laser, gradualmente, com a caixa do controlador. Ao mesmo tempo, monitorar a imagem ao vivo com cuidado. Inicialmente, a imagem ficará borrada (Figura 3B).
- Como o ângulo de laser aumenta, a imagem VAEM irá tornar-se menos turva, eventualmente, produzir uma imagem nítida (Figura 3C e D). Neste ponto, parar de aumencante o ângulo de laser. Se o sinal de fluorescência é perdido, para diminuir um ângulo mais aberto.
- Afinar o ângulo de entrada de laser para obter uma imagem melhor. Ajuste fino da posição do z -axis também pode melhorar a imagem. Se necessário, ajustar os parâmetros ópticos (potência do laser, comprimento de onda e conjuntos de filtros) e parâmetros do sensor de imagem [tamanho da imagem, tempo de exposição, ganho, digitalizadoras e (EM) de ganho de elétron-multiplicando].
NOTA: Para o caso de o equipamento TIRF microscópio descrito acima, os parâmetros representativos são como se segue. Ampliação da lente apenas na frente da câmera: 2X; Saída de laser: 1,0 mW; Tamanho da Imagem: 512 × 512 pixels; Tempo de exposição: 100 ms; Ganhar: 5 ×; Digitador: 11 MHz; e EM ganho: 100.
- Adquirir um filme como um arquivo de imagem TIFF de várias páginas usando o microscópio software comercial. Aqui, o filme é de GFP marcadas com pontos a piscar na superfície de células estomatais.
NOTA: As condições de aquisição de imagem representativos são como folbaixos. Modo de Aquisição: Fluxo para a RAM; Número de imagens: 600; e tamanho de arquivo TIFF de várias páginas: ~ 302 MB.
4. Análise quimógrafo para Quantificação de marcado com GFP Dot Residence tempo usando Software Fiji
- Instale Fiji ('Fiji é apenas ImageJ ") usando software de 10 instruções dos autores (http://fiji.sc/Fiji).
- Execute Fiji e abra o arquivo TIFF multi-página adquiridos utilizando o menu de Fiji "File-Open".
- Coloque uma linha no local de interesse, usando a ferramenta de barra de menu Fiji "Selection Tool linha reta". Opcionalmente, use a "Selection Tool linha segmentada" ou "Ferramenta de Seleção de Linha Freehand". Nos resultados aqui apresentados, uma linha recta de 100 pixels (correspondendo a 8,0 uM) foi colocada sobre uma célula controlada (Figura 4A).
- Faça uma imagem quimógrafo usando o menu de Fiji "Imagem-Pilhas-Dynamic corte virtual (Figura 4B). Opcionalmente, "Inverter verticalmente" e "girar 90 graus" em uma janela de caixa de seleção também estão disponíveis (não utilizado nos resultados aqui apresentados). O x e eixo y na imagem quimógrafo indicam a posição da linha (100 pixels correspondente a 8,0 mm) e tempo de observação (600 pixels correspondente a 60 seg), respectivamente. Se a imagem quimógrafo não é satisfatória, a posição e tipo (linear, segmentada e à mão livre) da linha a imagem multi-página no podem ser alteradas. Como as mudanças de linha, a imagem quimógrafo muda dinamicamente. Salve uma imagem de quimógrafo como um arquivo TIFF usando o menu de Fiji "File-Save As-Tiff".
- Medir o comprimento da mancha na orientação do eixo do tempo.
- Para executar redução de ruído, aplicar um filtro Gaussian às imagens quimógrafo usando o menu Fiji "Processo de Filtros-Gaussian Blur". O "Sigma (RadIUS) "parâmetro é sintonizável (1 pixel de raio é utilizado para os resultados apresentados).
- Segmento as regiões sinal de limiar, utilizando o menu de Fiji "Imagem-Ajustar-Threshold".
NOTA: Existem vários algoritmos de limiarização para escolher. Em resultados apresentados, o algoritmo "Yen" foi escolhido (Figura 4C). - Prepare-se para medir o tempo (y) -axis comprimento do blob usando o menu "Medições Analisar-Set". Verifique o "rectângulo envolvente" na janela "Definir Medidas". Idealmente, o conjunto área deve ser tão pequena quanto possível, para excluir o ruído. Aqui, a área mínima foi fixada em 50 pixels. Medir o tempo (y) -axis comprimento do blob usando o menu "Analyze-Analise Particles". Para obter os valores de resultados e provar a credibilidade das regiões de medição, verifique as "Mostrar resultados" e "Adicionar ao Gerente </ em> "caixas.
- Valores na coluna "altura" são o tempo (y) -axis comprimentos para o blob medido (Figura 4D). Salve os valores usando o menu tabela Resultados "Arquivo-Salvar como" e calcular e processar o conjunto de dados de durações imagem blob usando um pacote estatístico e / ou software de planilha (Figura 4E).
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Representative Results
Neste artigo de vídeo, os protocolos de observação VAEM de GFP-PATROL1 em A. células complexas thaliana cotilédones estômatos são fornecidos. Montagem gota Sky é um método de preparação simples que podem ajudar a reduzir a ocorrência de bolhas de ar em preparações VAEM de A. cotilédones thaliana (Figura 1). Overtilting do laser de entrada e / ou z-posicionamento dos espécimes para VAEM proporcionará uma imagem pouco clara. Se isso acontecer, recomenda-se iniciar de novo a partir de uma posição imediatamente por cima da amostra, tal como avaliado pela iluminação de epifluorescência. Após a experiência de observação VAEM de alguns dias, deve ser possível para adquirir filmes VAEM sucesso e frequncia, tal como o mostrado aqui de GFP-PATROL1 ponto piscando. Usando a análise quimógrafo apresentado na Figura 4, os tempos de residência de 185 GFP-PATROL1 pontos a partir de 12 células subsidiários independentes em A. cotilédones thaliana foram medidos. A densidade equipadafunção revelou que a maioria GFP-PATROL1 pontos eram residentes em uma célula controlada entre 2 e 10 segundos, com um pico de cerca de 3,5 seg (Figura 4E), sugerindo exocitose fast / endocitose de protões bombas na superfície da célula controlada.
Figura 1. Representação esquemática do método de montagem céu cair. Passo 1: Amostra de Arabidopsis thaliana cotilédones são flutuados em uma gota de tampão basal numa lâmina de vidro. Passo 2: Uma gota de gota tampão basal é colocado sobre uma tampa de vidro. Passo 3: A tampa de vidro com a queda é virada de cabeça para baixo ea gota é colocada acima do espécime na lâmina de vidro. Passo 4: A tampa de vidro é liberado ea queda cai para o espécime. (Top) visão panorâmica. (Inferior) lateral e visão alargada. Please clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A calibração do laser para centragem e focando. Passo 1: A posição vazia do revólver microscópio é selecionado para enviar luz laser no teto acima do microscópio. Passo 2: A posição central é marcada usando um círculo de vedação colorida no tecto. Passo 3: Um objetivo é selecionado. Etapa 4: Verifique a posição iluminada pela luz de laser através da lente objetiva. Passo 5: A iluminação é ajustado para a posição central marcada. Passo 6: A luz laser é focalizada. Passo 7:. A luz de laser focalizado é movido para a posição central marcada por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Comparação de microscopia de epifluorescência e microscopia de epifluorescência ângulo variável (VAEM). (A) esquemática do caminho da luz do laser em microscopia de epifluorescência. Imagem epifluorescência representativas de GFP-PATROL1 em superfícies de cotilédones em plântulas de 7 dias de idade de Arabidopsis thaliana (B). A barra de escala indica 5 um. (C) esquemática do caminho da luz do laser em VAEM. Note-se que a entrada do laser é inclinada, e ilumina a superfície da amostra com profundidade variável. Imagens (D) VAEM da mesma região como mostrado em (B). A barra de escala indica 5 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Análise quimógrafo para quantificar o tempo de permanência de um GFP-PATROL1 ponto. Image (A) VAEM com uma linha reta, colocada para fazer uma quimógrafo. A barra de escala indica 5 um. Uma imagem quimógrafo ao longo da linha mostrado em (A) (B). (C) Uma imagem binária (B), com base no algoritmo de Yen, gerado no software Fiji. As linhas amarelas mostram a região automaticamente detectado sinal de GFP-PATROL1. (D) Capturas de tela dos resultados da mesa do Fiji "Analisar Particles" função. (E) Um histograma de tempo de residência da GFP-PATROL1 ponto em células subsidiárias. A linha vermelha mostra a função de densidade. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste artigo de vídeo, os protocolos são dadas para a monitorização e a medição do comportamento dinâmico de GFP-PATROL1 pontos sobre o complexo estomatal da Arabidopsis thaliana. Como mostrado aqui, observação VAEM é uma poderosa ferramenta para geração de imagens ao vivo de superfícies de células vegetais. Sob as condições experimentais utilizadas aqui para monitorização GFP-PATROL1, houve muito pouca fotobranqueamento fluorescência na amostra utilizada durante 1 min de captura de vídeo, porque o EM-CCD altamente sensível permite a utilização de um laser de excitação relativamente fraca em VAEM óptica. Laser de centragem e concentrando-se, antes do início de cada experiência, são importantes para a observação VAEM bem sucedida. Os usuários devem ser treinados por uma equipe profissional da empresa de microscópio escolhido antes de usar VAEM.
VAEM revela que a GFP-PATROL1 tem uma localização dinâmica com um compartimento de ponto-a piscar como imóvel na membrana plasmática. Os mis-l de bomba de prótons da membrana plasmática AHA1 fluorescente-etiquetadosocalizes em patrol1 mutante células de guarda e células subsidiárias, conforme relatado anteriormente 8,9. Assim, a dinâmica do ponto de GFP-PATROL1 VAEM-visualizadas podem representar a entrega da bomba de protões para a membrana plasmática. Este comportamento dinâmico de GFP-PATROL1 é difícil visualizar através da microscopia de varredura a laser confocal galvanometer-tipo espelho convencional, indicando a utilidade de VAEM na descoberta dinâmica de proteínas em tempo real em superfícies de células vegetais. Observação GFP-PATROL1 é apenas um exemplo de aplicação VAEM em biologia celular das plantas. VAEM seria aplicável ao controlo de inúmeros eventos na camada cortical fina de citoplasma em células vegetais (por exemplo, a secreção de enzimas na síntese da parede celular ou modificação 11,12, membrana plasmática dinâmica de proteínas 7,13,14, corticais dinâmica dos microtúbulos 4, rearranjo dos microfilamentos de actina 4,15 e organela movimento 6). Uma vasta gama de cientistas de células vegetais devem beneficiarcaber a partir de técnicas VAEM.
A avaliação quantitativa dos dados de imagem biológicos recentemente se tornou importante, impulsionado por avanços em equipamentos microscópio e computação. Dados de filme VAEM contendo 512 (x) × 512 (Y) x 600 pixels (t) pode ser facilmente obtido em apenas alguns minutos. A análise das imagens ajuda não só para medir o tempo de vida ou movimento de uma proteína marcada com fluorescência, mas também na mineração informação biológica a partir de grandes conjuntos de dados, imagem multidimensionais. Um quimógrafo é uma base, mas valiosa, para determinar o movimento abordagem proteína alvo a partir de dados de filmes VAEM, como mostrado pelo recrutamento sequencial de proteínas em membranas de plasma 2. O quimógrafo permitiu a visualização de tempos de residência dos GFP-PATROL1 'Dots, e a sua baixa motilidade em membranas do plasma, tal como mostrado na Figura 4. Por outro lado, um quimógrafo tem eficácia limitada para avaliar movimentos mais complexos, tais como a fluência citoplasmática. Para mais complimovimento cado, outra análise de imagem abordagens como fluxo óptico 16 seria útil.
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Disclosures
O autor não tem nada a divulgar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| TIRF unit | Olympus | IX3-RFAEVAW | |
| TIRF objective lens | Olympus | UAPON 100 × OTIRF | NA = 1.49 |
| Laser angle control box | Chuo Seiki | QT-AK | |
| Optically pumped semiconductor laser | Coherent | SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser | |
| 510–550 nm band-pass filter | Olympus | U-FBNA | |
| EM CCD camera | Hamamatsu Photonics | ImagEM C9100-13 | |
| C-mount camera magnification change unit | Olympus | U-TVCAC | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.11.0 | |
| TIRF microscopy manual | Olympus | AX7385 | Instructions: Total Internal Reflection Illumination System (Printed in Japan on August 24, 2012) |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Typr-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
References
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