Imagerie en temps réel des plantes Dynamics de surface cellulaire avec angle variable épifluorescence Microscopie

Résumé

L'objectif de ce protocole est de démontrer comment surveiller la dynamique des protéines étiquetées par fluorescence sur des surfaces de cellules végétales avec angle variable épifluorescence microscopie, montrant clignoter points de GFP-tagged PATR1, une protéine de trafic membranaire, dans le cortex cellulaire du complexe stomatique dans Arabidopsis thaliana.

Résumé

La surface cellulaire d’une plante est son interface pour percevoir les signaux environnementaux ; elle répond par des changements biologiques cellulaires tels que le trafic membranaire et le réarrangement cytosquelettique. L’analyse d’images en temps réel et à haute résolution de ces événements intracellulaires augmentera la compréhension de la biologie des cellules végétales au niveau moléculaire. La microscopie à épifluorescence à angle variable (VAEM) est une technique émergente qui fournit des images en accéléré de haute qualité de protéines marquées par fluorescence à la surface des cellules végétales. Dans cet article, les procédures pratiques sont décrites pour la préparation des échantillons VAEM, le réglage du système optique VAEM, la capture vidéo et l’analyse d’images. A titre d’exemple d’observation VAEM, des résultats représentatifs sont présentés sur la dynamique des PATROL1. Il s’agit d’une protéine essentielle au mouvement des stomates, dont on pense qu’elle est impliquée dans l’administration de la pompe à protons aux membranes plasmiques dans le complexe stomatique d’Arabidopsis thaliana. L’observation en temps réel des cellules de garde et des cellules subsidiaires dans les cotylédons d’A. thaliana a montré que les PATROL1 marquées par fluorescence apparaissaient sous forme de structures en forme de points sur les membranes plasmiques pendant plusieurs secondes, puis disparaissaient. L’analyse kymographe des données de films VAEM a déterminé la distribution temporelle de la présence (appelée « temps de séjour ») des structures en forme de points. L’utilisation de VAEM est abordée dans le contexte de cet exemple.

Introduction

La surface de la cellule végétale, y compris la membrane plasmique et son cytoplasme immédiatement adjacent, est la principale région de la perception d’une cellule végétale et l’intégration des signaux biotiques et abiotiques de l’environnement extracellulaire. En réponse à ces signaux, les composants de surface cellulaire, y compris les protéines de la membrane plasmique et le cytosquelette cortical, subissent des changements dynamiques, sur une échelle de temps allant de quelques secondes à^{1 à 4} minutes. Ainsi, l’imagerie en temps réel et à haute résolution des protéines fluorescentes à la surface des cellules peut éclairer les réponses d’une plante aux ....

Protocole

1. Préparation de semis

1. Stériliser les graines.
   1. Préparer la solution de stérilisation en ajoutant 500 ul de NaClO (chlore disponible: 5,0%) et 1 ul de 10% de Triton X-100 à 500 pi d'eau stérile.
   2. Lieu ca. 10 transgénique A. thaliana graines transportant GFP-PATR1 ⁸ dans un tube de 1,5 ml.
   3. Ajouter une solution d'éthanol 1 ml de 70%, et bien mélanger en inversant cinq fois. Laissez pendant 1 min.
   4. Observer les graines tombent au fond du tube. Dans une hotte à flux laminaire propre, retirez délicatement l'éthanol à 70% à l'aide d'une micropipette, et ajouter 1 ml de solution....

Résultats

Dans cet article, de la vidéo, les protocoles d'observation VAEM de GFP-PATR1 dans A. cellules complexes thaliana cotylédons stomates sont fournis. Montage de chute de Sky est une méthode de préparation simple qui peut aider à réduire l'apparition de bulles d'air dans les préparations VAEM de A. cotylédons thaliana (Figure 1). Une inclinaison trop importante du laser d'entrée et / ou z-positionnement des spécimens pour VAEM fournira une image claire. S.......

Discussion

Dans cet article, de vidéo, les protocoles sont donnés pour surveiller et mesurer le comportement dynamique des points GFP-PATR1 sur le complexe stomatique de Arabidopsis thaliana. Comme indiqué ici, l'observation VAEM est un outil puissant pour l'imagerie en direct de la surface des cellules de la plante. Dans les conditions expérimentales utilisées ici pour la surveillance GFP-PATR1, il y avait très peu de photoblanchiment de fluorescence dans l'échantillon utilisé pendant 1 min de capture vidéo, .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microscope inversé	Olympus	IX-73
Unité TIRF	Objectif Olympus	IX3-RFAEVAW
TIRF  ;	Olympus	UAPON 100 & fois ; OTIRF  ;	NA = 1,49
Boîtier de contrôle d’angle laser	Chuo Seiki	QT-AK
Laser semi-conducteur à pompage optique	Saphir	TM LP USB 488-20 CDRH Laser
510&ndash ; Filtre passe-bande 550 nm	Olympus	U-FBNA
EM Caméra CCD	Hamamatsu Photonics	ImagEM C9100-13
Unité de changement de grossissement de la caméra à monture C  ;	Logiciel Olympus	U-TVCAC
MetaMorph	Dispositifs moléculaires	MetaMorph version 7.7.11.0
Manuel de microscopie TIRF	Olympus	AX7385	Instructions : Système d’éclairage par réflexion interne totale (imprimé au Japon le 24 août 2012)
Huile d’immersion Huile d’immersion	Olympus	Typr-F	ne = 1,518 (23 degrés)