הדמיית ההתנהגות הדינמית של אברונים ומבנים תת-תאיים אחרים in vivo יכולה לשפוך אור על תפקודם במצבים פיזיולוגיים ומחלות. כאן, אנו מציגים שיטות לתיוג גנטי של שני אברונים, צנטרוזומים ומיטוכונדריה, והדמיית הדינמיקה שלהם בעוברי דג זברה חיים באמצעות מיקרוסקופיה רחבת שדה וקונפוקלית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
הדמיה in vivo מספקת גישה חסרת תקדים להתנהגות הדינמית של מבנים תאיים ותת-תאיים בהקשר הטבעי שלהם. ביצוע ניסויי הדמיה כאלה בבעלי חוליות גבוהים יותר כמו יונקים דורש בדרך כלל גישה כירורגית למערכת הנחקרת. הנגישות האופטית של דג הזברה העוברי והזחל מאפשרת לעקוף הליכים פולשניים כאלה ומאפשרת הדמיה באורגניזם השלם. ואכן, דג הזברה הוא כיום מודל מבוסס היטב להמחשת התנהגויות תאיות דינמיות באמצעות מיקרוסקופיה in vivo במגוון רחב של הקשרים התפתחותיים, החל מהתפשטות ועד נדידה והתמיינות. התפתחות עדכנית יותר היא השימוש הגובר בדג הזברה לחקר אירועים תת-תאיים, כולל סחר במיטוכונדריה ודינמיקה של צנטרוזומים. הקלות היחסית שבה ניתן לתייג גנטית את המבנים התת-תאיים הללו על ידי חלבונים פלואורסצנטיים והשימוש בטכניקות מיקרוסקופ אור כדי לדמות אותם הופכת את דג הזברה למודל in vivo של ביולוגיה של התא. כאן אנו מתארים שיטות ליצירת מבנים גנטיים המסמנים אברונים באופן פלואורסצנטי, תוך הדגשת מיטוכונדריה וצנטרוזומים כדוגמאות ספציפיות. אנו משתמשים במערכת Gal4-UAS הדו-חלקית במספר תצורות כדי להגביל את הביטוי לסוגי תאים ספציפיים ולספק פרוטוקולים ליצירת דגים טרנסגניים בעלי ביטוי חולף ויציבים. לבסוף, אנו מספקים הנחיות לבחירת שיטות מיקרוסקופ אור המתאימות ביותר להדמיית דינמיקה תת-תאית.
מבוא
בשנת vivo הדמיה מספק ראיה ישירה של התנהגויות הסלולר בהקשר הפיזיולוגי ביותר. השקיפות של עוברי דג זברה, ההתפתחות המהירה והחיצונית שלהם מגוון עשיר של כלים גנטיים המאפשרים תיוג פלורסנט תרמה כולם בשימוש הגובר של מיקרוסקופיה in vivo על מנת להבהיר את הדינמיקה של אירועים התפתחותי חשובים. בדיקות הדמיה של התפתחות מערכת עצבים של דג זברה יש למשל הרחיבו את הידע שלנו מאוד של ההתנהגות של ובתאים עצביים ועל גורל הצאצאים שלהם כוללים שילוב ההגירה, בידול המעגל הבא שלהם 1-8.
השלב מוגדר כעת לחקור את הדינמיקה subcellular שבבסיס התנהגויות הסלולר אלה. ואכן....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לתקנות מקומיות של הממשלה בוואריה העליונה (מינכן, גרמניה).
אברונים תיוג 1. מבנים subcellular אחרים
הערה: כתב גנטי כאן בונה כי centrosomes תג פלורסנטי, מיטוכונדריה קרום תא מתואר.
- השתמשו בשיטות שיבוט קונבנציונאלי 29 כדי לייצר חלבונים היתוך כי fluorescently לתייג centrosomes ואת המיטוכונדריה. לשכפל את רצף הקידוד של centrin4 דג הזברה (cetn4) בתו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כאן השימוש רחב בתחום מיקרוסקופיה confocal למיטוכונדריה תמונה centrosomes לחיות עוברי דג הזברה מושווה באופן ישיר בניגוד. בהתאם למיקום של התאים בהם הדינמיקה אברון ייבחנו ואת תדירות הטבועה של אירועים subcellular ספציפיים, בדרך כלל גם רחב בתחום או confocal הוא בחירה טובה יותר. אנחנו צלמנו אברונים בנוירונים RB ממוקמים על פני השטח של העובר בתאי רשתית הממוקם עמוק. המיקום שטחית של נוירונים RB יחד עם גיאומטריה דו-ממדי שלהם להפוך אותם מועמדים טובים להיות הדמ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הנה, אנחנו מדגימים את הרבגוניות של מערכת ביטוי Gal4-כטב"מ למיטוכונדריה תג פלורסנטי, centrosomes ואת קרום התא של תא-סוגים ספציפיים in vivo עוברי דג הזברה. חלבונים היתוך ניאון רבים כי תווית אברונים אחרים או מבנים subcellular ניתן למצוא בספרות שפורסמו ניתן להשיג מהמעבדה בהתאמה, ממקורות מסחריים או משמורת פלסמיד לא מסחרי (למשל, Addgene). כדי לעצב חלבון היתוך ניאון חדש, מספר פרמטרים צריכים להילקח בחשבון, כולל אשר FP להשתמש והאם למזג את FP בתחנה הסופית אמינו או car.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
PE נתמך על ידי קבוצת ההכשרה למחקר 1373 של Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) ובית הספר לתארים מתקדמים של האוניברסיטה הטכנית של מינכן (TUM-GS). G.P. נתמך על ידי TUM-GS. L.T. נתמך על ידי מלגת EMBO (EMBO ALTF 108-2013). עבודתו של ד.פ. על דג הזברה נתמכה על ידי ה-DFG באמצעות Sonderforschungsbereich "מנגנונים מולקולריים של ניוון עצבי" (SFB 596); המרכז למדעי החלבון המשולבים (מינכן) ותוכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית (FP7/2007-2013) תחת הסכם מענק מס' 200611 (MEMOSAD). כיום הוא עמית דרוקנמילר של קרן תאי הגזע של ניו יורק ונתמך על ידי מלגה מהאקדמיה הגרמנית למדעים לאופולדינה. LG נתמך על ידי מימון מ-DFG באמצעות SFB 870 "הרכבה ותפקוד של מעגלים עצביים", פרויקט A11.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אגרוז (2-הידרוקסיאתילאגרוז) | Sigma-Aldrich | A4018-10G | טמפרטורת ג'ל נמוכה סוג VII |
| מחמם בלוק | Eppendorf | Thermomixer קומפקטי | |
| Ca(NO3)2 סידן חנקתי הידרט, 99.996% | אולדריץ' | 202967-50 גרם | להכנת מצלמת CCD 30x של דניאו |
| Qimaging Retiga Exi Fast 1394 | |||
| דומונט מצופה קרמיקה #5 מלקחיים | דומונט - כלי מדע עדינים | 11252-50 | #5 מלקחיים |
| מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי | אולימפוס | FV1000 Fluoview | |
| מחמם כלים | וורנר אינסטרומנט קורפוריישן | DH-35 | טבעת חימום |
| אתיל 3-אמינובנזואט מלח מתאן סולפט | PharmaQ | טריקאין PharmaQ-25g | טריקאין (הרדמה) |
| מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי | Leica | M205 FA | |
| ערכת GeneClean MP | ביו-רפואי | 111001200 | |
| כלי תרבות תחתון זכוכית | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | צלחת פטרי 35 מ"מ, מיקרווול 14 מ"מ, זכוכית כיסוי מס' 0 |
| מחטי זכוכית | World Precision Instruments Inc. | TW100F-4 | למיקרו-הזרקות |
| HEPES | Sigma | H3375-250g | גבוה 30x של Danieau |
| Dow Corning | DCC000001242 150 גרם | גריז סיליקון דו חמצני | |
| KCl 99% | סיגמא-אולדריץ' | S7643-5 ק"ג | להכנת 30x |
| MgSO4.7H2O מגנזיום גופרתי הפטהידראט 98+% מגיב ACS | סיגמא-אולדריץ' | 230291-500 גרם | להכנת 30x |
| Microinjector | טיפים | ||
| Eppendorf | 930001007 | 0.5-20 ul | |
| Micromanipulator | Maerzhaeuser Wetzlar | MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R | |
| מחזיק מיקרופיפטה | Intracel | P/N 50-00XX-130-1 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 ערכת תמלול | Ambion | AM1340 | לתמלול PCS-Transposase |
| NaCl BioXtra >99.5% | Sigma-Aldrich | P9541-1kg | |
| למדידת ריכוז DNA/RNA | |||
| מושך מחט | Sutter Instrument | P-1000 | Flaming/Brown |
| NIR Apo 40x/0.80W | ניקון | טבילה במים-חרוט אובייקטיבי | |
| N-Phenylthiourea דרגה I, כ. 98% | Sigma | P7629-10G | PTU (מונע פיגמנטציה) |
| צלחות פטרי | Sarstedt AG | 821472 | 92 x 16 מ"מ |
| תבניות פלסטיק | כלי מדע אדפטיביים | TU-1 | למיקרו-הזרקות |
| כיסוי פרספקס עם חור | בהתאמה | החור בכיסוי הפרספקס צריך להיות גדול ב-3 מ"מ מקוטר מטרת חרוט הטבילה במים | |
| מסננת תה (פלסטיק) | לאיסוף ביצי דג זברה | ||
| בקר טמפרטורה | Warner Instrument Corporation | TC-344B | טמפרטורה אוטומטית כפולה |
| בקר העברת פיפטות | Sarstedt AG | 86.1171 | פיפטות העברת פלסטיק 3.5 מ"ל |
| UMPlanFI 100x/1.00W | אולימפוס | מטרת חרוט טבילה במים | |
| UMPlanFLN 20x/0.50W | מטרת חרוט טבילה במים | אולימפוס | |
| מיקרוסקופ שדה רחב | אולימפוס | BX51WI | |
| PTU (מלאי 50x) | ממיסים 76 מ"ג PTU ב-50 מ"ל מים מזוקקים מערבבים במרץ בטמפרטורת החדר יש לאחסן בטמפרטורה של -20 oC ב-1 מ"ל מינקוטים יש להשתמש בתמיסת עבודה אחת | ||
| טריקאין (20x ציר)יש | להמיס 200 מ"ג טריקאין ב-48 מ"ל מים מזוקקים להוסיף 2 מ"ל 1M Tris base (pH9) להתאים ל-pH 7 יש לאחסן ב-20 oC ב-1 מ"ל השתמש ב-1x פתרון עבודה | ||
| הפתרון של דניאו (30x מלאי) | 1,740 mM NaCl 21 mM KCl 12 mM MgSO4.7H2O 18 mM Ca (NO3)2 150 mM מאגר HEPES מים מזוקקים עד 1 ליטר חנות ב-4 oC שימוש בפתרון עבודה של 0.3x |
מקורות
- Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat Neurosci. 13 (6), 673-679 (2010).
- Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Koster, R. W.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
