Long-Term Kateterisering av Intestinal Lymph Trunk og innkreving av lymfe i Neonatal Pigs

Introduction

Lymfesystemet er en studerte område av fysiologi. Prekliniske modeller av lymfatisk kateterisering oppstå i forskjellige dyrearter ^1-8 og brukes av farmasøytisk industri og forskningsmiljøer for å undersøke mekanismene som er involvert i lipid ^8-12 og legemiddelmetabolisme ^13-15, kreft metastaser ¹⁶ med eksperimentell behandling ^17, og immunfunksjon ^{18 -26.} Denne studien undersøker bruk av intestinal lymfe trunk kateterisering i en gris modell for å måle komponenter av lipoprotein metabolismen. Lipoprotein metabolisme er involvert i produksjon og sekresjon av kylomikroner, samt endringer i tilknyttede lipider og total protein. Dette er viktige hensyn som det er store forskjeller i fettmetabolismen mellom brukte gnagermodeller og mennesker og som sådan, sysselssvine modeller for å samle intestinal lymfe kunne gi mer sammenlignbar informasjon for å studere lipid megstoffskiftet i mennesker ^27-31.

Flere kirurgiske teknikker brukes til å samle intestinal lymfe i store dyrearter: en kranie skulder tilnærming (dvs. thorax kanal kateterisering) ^5, en lateral øvre flanke tilnærming ^32-34, og en ventral midtlinjen eller paramedian tilnærming ^22,35. Denne videoen beskriver i detalj den kirurgiske prosedyren i svine bruker en ventral midtlinje kirurgisk tilnærming for kateterisering av intestinal lymfe stammen. Forsiktig kirurgisk teknikk tillater denne metoden for lymfatisk kateterisering for å samle store mengder av lymfe og dens bestanddeler over lange tidsperioder.

Denne teknikken åpner en myriade av søknader til mange disipliner som undersøker ulike fysiologiske funksjoner. Programmer kan inkludere, men er ikke begrenset til, hele kroppen lipoprotein og lipidmetabolisme, immunosurveillance, tumormetastase og genese, tarmfunksjonen, og den development og progresjon av tarminfeksjon.

Protocol

Alle prosedyrer på forsøksdyr er beskrevet i både video og manuskriptet ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité og fulgt retningslinjene fastsatt av den kanadiske Council of Animal Care.

1. Kirurgisk anestesi og kirurgisk Utarbeidelse av Neonatal Pigs

1. I en atskilt forværelse, premedicate 25 kg griser nær bunnen av nakken med en intramuskulær beroligende-bedøvelse narkotika cocktail som inneholder: azaperon (0,3 mg / kg), ketamin hydroklorid (10 mg / kg), dexmedetomidin (15 mikrogram / kg).
   Merk: Legg buprenorfin (0,005 til 0,02 mg / kg) i pre-bedøvelse narkotika cocktail for økt intraoperativ smerte kontroll.
2. Anesthetize grisene med inhalert isofluran innånding gass (4-5% isofluran i 500 ml-1000 ml / min O ₂₎ med en ansiktsmaske. Visualstemmebåndene ved hjelp av en veterinær laryngeal omfang (17-25 cm lang rett blad), og anvende aktuell 10% lidokain spay til vokalledninger. La lidokain spray å kontakte stemmebåndene 30-60 sek før intubasjon for å redusere muligheten for stemmebånd krampe og luftveisobstruksjon.
3. Intubere grisene ved å føre et håndjern endotrakealt rør (5,0-7,0 mm intern diameter (ID)) mellom stemmebåndene og opprettholde anestesi med isofluran gass (0,5-2,0% isofluran ved 1000-2000 ml / min O ₂₎ ved hjelp av en lukket kretsen rebreathing bedøvelse system i hele operasjonen. Vurdere nivået av anestesi ved kjeven tone, og både pedal og palpebral refleks svar. Utløpt bedøvende gass er ryddet vekk og ventilert utenfor operasjons suite.
4. Rens den ytre overflate av øret med 2,0% klorheksidin kirurgisk kratt, etterfulgt av en 70% isopropylalkohol skylling. Med en 20 G venekateter, kateterisere øre vene for å gi intravenøs væske (Ringer-laktat oppløsning, 5-10 ml / kg / time) under operasjonen. Sikre et pulsoksymeter til slimhinnen av tungen med Medical tape til å overvåke puls og metning av perifert blod oksygenering _(SpO2).
5. Plasser bedøvet gris i ryggtilbakelent stilling og barbere ventral magen fra midten av thorax caudally til ventral aspekt av pubis. Rengjør området med to alternerende 2,0% klorheksidin kirurgiske skrubber og sterile vannet vasker.
6. Overfør bedøvet grisen til kirurgisk suite og anvende den endelige kirurgisk skrubb på 70% isopropylalkohol skyll, la det tørke, og deretter drapere dyret.
7. Sette inn en rektal temperaturprobe ca. 2-4 cm inn i rektum for å overvåke kroppstemperatur. Plasser griser på en vannresirkuleringsvarmepute for å opprettholde normal kroppstemperatur (38-40 ° C) under kirurgiske prosedyren.
8. Drapere gris med fire håndklær gardiner plassert i en overliggende kvadrant mønster rundt magen. Plasser den første drapere tvers xiphisternum, den andre drapere langs lateral del av buken omtrent 5 cm lateralt for abdominal midtlinjen. Plasser den tredje trekket på tvers av ileal toppen av bekkenet og den fjerde drapere, som den andre draperingen (selv om på den motsatte siden), er plassert langs den laterale del av buken omtrent 5 cm lateralt for abdominal midtlinjen.
9. Plasser et stort bord drapere, med en spalteåpning som gir tilgang til det kirurgiske området, over de underliggende håndkle gardiner og dekker gris og hele operasjonsbordet. Den endelige drapere er en engangs klor-drapere plassert over det store bordet drapere.

2. Abdominal kirurgi og Kateterisering av Intestinal Lymphatic Trunk

1. Lag en 20 cm hud snitt med en skalpell blad for å avsløre de underliggende magemusklene. Incise magemuskellagene med mono-polar elektrokauterisering (20 watt innstilling) for å eksponere parietal peritoneum. Åpne en 20 cm lineær segment av parietal peritoneum med Metzenbaum saks for å få tilgang til abdominal viscera og lymfekar.
2. Fukte alle vev med varm (37 ° C) sterilt saltvann for hele kirurgiske prosedyren. Løft forsiktig en stor del av tarmen inkludert kolon, cecum, ileum og jejunum fra bukhulen og exteriorize den til venstre flanken av gris for å få tilgang til øvre del av magen, leveren og lymfekar. Fest exteriorized tarmen på plass med ekstra håndkle gardiner for å danne en slynge for å støtte forsiktig tarmen.
3. Finn lymfatiske fartøyet, legger det ca 4 cm kranie-mediale av retten nedsatt venen, 6 cm hale-medial- ventral av CAVAL formenn og under visceral aspektet av retten leverlapp i nærheten av bukspyttkjertelen ^22,36,37. Identifiser lymfatiske fartøyet som et gjennomskinnelig struktur sammenstilt til høyre ventral segment av portvenen ^36,37.
4. Skill lymfatiske Vessel fra de omkringliggende fascia ved forsiktig teasing bort festet vev med Q-tip applikatorer. Når de laterale sider av fartøyet er adskilt fra det omgivende vev, skape en "tunnel" åpning på undersiden av fartøyet med fin stump tippet tang.
5. Pass tre 2-0 silke sting under lymfatiske fartøyet med fine tang. Ligate mest hale sutur første til å tilstoppe, strekke og fylle karet med lymfe. Målrettet la endene av denne sutur forholdsvis lang (4 cm) for å feste kateteret til den lymfatiske kar. Plasser to andre sting skilt 1,0 cm fra hverandre og er ca 1,0-1,5 cm hjerne til sikret hale sutur. La disse to sting med en "single løs ligatur slips" for å muliggjøre raskere festing av kateteret inn i beholderen.
   Merk: Den delen av lymfatiske fartøyet ligger mellom de mest haleligering sutur og midt sutur (av de to kraniale suturer) er stedet for kateterisering. angå~~POS=TRUNC suture materiale, kan 2-0 polyglaktin sutur erstatte 2-0 silke suturer hvis nødvendig.
6. Skjær et lite hull i beholderen med iris saks og utvide karet med fine butte pinsett. Sett ca 1,0-1,5 cm spesialisert kateter rør (4,06 Ytre diameter (OD) X 2,31 mm ID) med en skrå ende i beholderen og knytte de to kraniale suturer å feste kateteret på plass. Bruk lange sutur endene av hale sutur for å feste kateteret til fartøyet.
7. Vask exteriorized tarmen med store mengder varmt saltvann og forsiktig returnere det til bukhulen sikre korrekt anatomisk plassering av tarmen.
8. Exteriorize kateteret til venstre midt flanke (5-10 cm ventralt fra Hulrommet). Foreta en hud innsnitt med en skalpell og passerer en trokar fra bukhulen til hudoverflaten for å skape en åpning for exteriorization av kateteret. Bruk en stor Kelly tang til exteriorize kateteret fra mage cavligheten gjennom troakarnål åpningen.
9. Lukk parietal peritoneum med en enkel kontinuerlig sutur mønster av 2-0 polyglaktin sutur med en runde (konisk) nål. Lukk magemuskellagene med en enkel avbrutt sutur mønster med 2-0 polyglaktin sutur på en runde nål.
10. Lukk huden i en subkutikulær mønster med 2-0 polyglaktin sutur på et skjære nål. Fest exteriorized kateteret til huden med en håndveske-streng sutur mønster og en 2-0 nylon sutur på et skjære nål.
11. Plasser en spesialisert jakke på grisen mens du fortsatt bedøvet for å lette sin plassering og redusere stress av grisen under gjenoppretting.

3. Post-kirurgisk utvinning og lymfe Collection

1. Omtrent 10 min før seponering av innånding anestesi, administrere bupenorphine (0,1 mg / kg) intramuskulært å gi umiddelbar etter operasjonen analgesi. Fortsett bupenorphine (0,1 mg / kg) hver 12. time i 24-48 timer for å opprettholdeetter operasjonen analgesi.
2. Overvåk grisene for postoperative komplikasjoner hver 8-12 timer for en 7 dagers periode.
3. Samle lymfe i 500 ml polypropylen vaskeflasker, belagt med etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), og supplert med antibiotika; penicillin (6000 IU), streptomycin (6 mg) og amfotericin B (3 mg) hver 12. time for en 7 dagers periode.

4. Kvantifisering av Lipoprotein ApoB48, Triglyceride, kolesterol og Total protein innsamlet fra Lymfe

1. Sentrifuger lymfe prøven ved 1800 xg i 5 min ved 4 ° C. Samle supernatanten og bruke den for kvantifisering av triglyserider, kolesterol og total protein.
2. Fordel supernatanten i tre prøver: en ufortynnet prøve, en prøve fortynnet 1:20 destillert vann og en sluttprøve fortynnet 1: 100 med destillert vann.
3. Bruk ufortynnet supernatant for å måle kolesterol nivåer, med et kommersielt tilgjengelig kit.
4. Bruk 01:20 og 01:100 fortynnede prøver å måle triglyserider og total proteinnivåer med en kommersielt tilgjengelig kit og bicinchoninic syre totale proteinanalyse hhv.

5. Kvantifisering av Lipoprotein ApoB48, Collected fra Lymph ³⁸

1. Bestemme konsentrasjonen av lipoprotein ApoB48 med en tilpasset immun Western blotting metode ^38. Separat total lymfe med 3-8% tris-vinylacetat- natriumdodecylsulfat polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE).
2. Overfør de separerte proteinene til en polyvinylidenfluorid membran (0,45 pm) og inkuber dem med et geit polyklonalt antistoff til ApoB (1: 4000), og deretter binde den med et anti-geit sekundært antistoff.
3. Kvantifisere lipoprotein ApoB48 med chemiluminescence etter lineær densitometrisk sammenligning med renset gnager ApoB48 protein standard.

Representative Results

Lymfatisk kateterisering av tarm lymfatiske stammen av neonatale griser tillater samling av omtrent 1 l / 24 timer av det sentrale lymfe over en 7 dagers periode. Den samlet i denne eksperimenter lymfe inneholdt komponenter i lipidmetabolismen, nemlig total lymfe protein, ApoB48 lipoprotein, triglyserider, total protein og kolesterol. Tabell 1 høydepunkter representative mengder av disse lipid komponenter fra samle lymfe prøver av tre griser. Spesielt, lymfe flyt og lipid bestanddeler er i tråd med verdier av sentrale lymfe rapportert av andre forskere følgende kateterisering av intestinal lymfekar (lymfe flyt 570 ± 158-979 ± 284 ml / 24 hr ^25, 360 ± 120 MLL / 24 hr til 1080 ± 720 ml / 24 hr ^26; triglyserid 687 ± 110 mg / dL ^9; kolesterol 63,1 ± 5,6 mg / dL ^9); indikerer riktig plassering av kateteret inne i lymfatiske kar.

ontent "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 2. En Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) profil som viser renheten av kylomikron preparat i neonatal grise intestinal lymfe. Lymfe samlet inn fra tre griser er skilt ved hjelp av en 1,006 g / ml tetthet ultrasentrifugering protokollen. Profilen viser en enkel topp for (A) kolesterol og (B) triglyserid i lymfen prøven. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 1. En representant Western blot analyse viser bidraget fra ApoB48 og ApoB100 lipoproteiner i neonatal gris intestinal lymfe. Lymph samlet inn fra tregriser separeres ved anvendelse av en 1,006 g / ml densitetsgradient-ultrasentrifugering protokollen. Figuren viser en liten mengde forurensning med ca 15% av plasma avledet ApoB100. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

	lymfe Kjennetegn
ApoB48 (mg / ml)	3022,4 ± 440,4
Triglyserid (mg / dl)	607 ± 203,6
Kolesterol (mg / dl)	58,5 ± 9,6
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD (n = 3)

Tabell 1. Komponenter av intestinal lymfe samlet inn fra nyfødte griser 7 dager etter operasjonen. Resultatene er gjentatt measures av lymfe og uttrykt som gjennomsnitt ± SD (n = 3)

Discussion

Samle intestinal lymfe er en utmerket metode for å undersøke mekanismene som er involvert i lipid ^8-12 og narkotika ^13-15 metabolisme, kreft metastase ^16,17, celle trafficking og immunfunksjon ^18-26, i ulike eksperimentelle dyremodeller. Faktisk har muligheten til å høste store mengder enten perifer (afferent) og sentralt (efferent og store bagasjerommet fartøy) lymfe over en lengre periode vært særlig viktig for å forstå tidsmessige endringene som skjer i cellepopulasjoner følgende utfordringer med immunstimulerende midler ^{18-22 , 25,26.} Tilsvarende har samling av sentrale lymfe vært nyttig for å kartlegge prosesser involvert i lipoprotein metabolismen ^8-12. Nytten av lymfe samlingen er avhengig av suksess for kateterisering prosedyre og åpenheten av kateteret i lymfekar.

Kateterisering av de store lymfekar involvert iintestinal lymfedrenasje i store dyr generelt bruker en av tre kirurgiske tilnærminger. Den første teknikken bruker et kranie skulder tilnærming å gå inn i thorax kanalliggende den vanlige halsvenen (ku thorax kanal) ^5. Den andre benytter en øvre flanke tilnærming over midten av laterale aspekt ved den høyre nyre ^32,33. Den tredje teknikk som er beskrevet i denne video benytter enten en ventral midtlinjen eller paramedian ^22,35 laparotomi for å eksponere den intestinale lymfatiske stammen nær bukspyttkjertelen og sidestilt til høyre ventrale del av portvenen ^22,36,37. Selv om både den øvre flanke og ventrale midtlinje kirurgiske teknikker muliggjøre kateterisering av tarm lymfatisk stammen, mener vi den ventrale midtlinje tilnærmingen muliggjør bedre eksponering av fartøyet med tilstrekkelig plass inne i den øvre del av magen for å håndtere og manipulere beholderen.

Viktigere, som i alle eksperimentell kirurgi er det trinn som er partisielt viktig for det vellykkede resultatet av den eksperimentelle prosedyren. Det er fire viktige områder som krever spesiell oppmerksomhet ved hjelp av ventrale midtlinjen tilnærming for å få tilgang tarm lymfatiske fartøyet. Først blir utmerket blodtilførsel til exteriorized tarmen nødvendig, som forlenget kompromitterte sirkulasjon til tarmen induserer iskemisk tarmslimhinne nekrose og kirurgisk svikt. I denne fremgangsmåten en "håndkle slynge 'reduserer strekket på mesenteriske blodårer ved å støtte vekten av tarmene sikrer utmerket vevsperfusjon. For det andre, forsiktig manipulasjoner av fartøyet inkludert: utgivelsen av fartøyet fra omkringliggende fascia og fettvev, innsetting og godt feste kateteret i karet for langsiktig lymfe samlingen er avgjørende for vellykket kateterisering. Faktisk er det foreslått at den strukturelle integritet av karene i neonatale griser ikke er så robust som i modne dyr, og som sådan lett kan rive ^39,40 41, er det meget vanskelig å fjerne koagulere fra kateteret som clot utvikler seg inne i kateteret og er dypt sittende i det lymfatiske kar. Følgelig vil dette sterkt redusere (ca. 40%) antall dyr hell kateter- iseres for langsiktig eksperimentering (upubliserte data). Derfor, hvis lymfe flyt er redusert eller har avviklet under prosedyren, lymfesystemet kateter settes inn igjen kranialt 0,5-1 cm fra den første kateterisering området.

Alle modeller som brukes til å undersøke vitenskapelige spørsmål har inherant begrensninger og kateterisering av tarm lymfatisk stammen er intet unntak. Den mest uttalt begrensning for fremgangsmåten er den manglende evne til effektivt å isolere, kateterisere den lymfatiske kar, og stabilisere kateteret inne i beholderen. Som sådan, krever denne prosedyren mennesker med gode tekniske og kirurgiske ferdigheters. En annen viktig begrensning er at langvarig kirurgiske ganger i løpet av stor abdominal kirurgi øker risikoen og postoperativ morbiditet og mortalitet. Spesielt, men grisene i eksperimentet vårt kom seg raskt fra kirurgi og det var ingen komplikasjoner som infeksjoner, intestinal ileus, overdreven vevsskade, eller manglende appetitt etter inngrepet. Sannelig, griser ble observert å være lyse, responsive, ambulerer og spise normalt 24 timer etter operasjonen og dette fortsatte over 7 dagers lymfe samling periode. Spesielt, selv om serumkjemi eller blodtelling ikke ble vurdert i disse grisene følgende 7 dagers eksperiment, tidligere arbeid av etterforskere i langsiktig lymfe samling hos sau ⁴¹ viste at kateter- iseres sauer var aldri leukopenic, lymphopenic, hypoproteinemic med elektrolyttforstyrrelser eller klinisk portretterer dårlig helse (upublisert data). Viktigere og som nevnt ovenfor, korrelerer denne observasjonen til catheteriZed griser også viser kliniske kjennetegn ved god helse.

Interessant, søkere bemerket variasjoner i volumet av lymfe flyt. Flyten var størst i løpet av dagen når griser ble fôring og aktiv med ca 70% av det daglige innsamlet lymfe skjer på denne tiden. De resterende 30% av lymfe flyt skjer i kveld under hvile og søvn.

Ytterligere karakterisering av lymfe prøvene er gitt i figurene 1, 2 og tabell 1. Figur 1 viser en liten mengde forurensning med ca. 15% av plasma avledet ApoB100. Tilstedeværelsen av plasma lipoprotein innenfor intestinal lymfe er en observasjon som ofte forekommer hos gris ^42. I pattegriser, blir mesteparten av lipoprotein produsert av leveren og utgitt i plasma. Fra plasma, ApoB100 siver sannsynlig til å samle lacteals ⁴² og deretter gjennom lymfesystemet vaskulære nettverketrenner inn i tarm lymfatisk bagasjerommet. Forskjellige metoder for kromatografi blir anvendt for å vurdere kolesterol, triglyserider og andre fosfolipid-innholdet i de innsamlede lymfe prøvene ^42-45. Den eneste topp i figur 2 viser klart cholesterol og triglycerider er tilstede i kylomikron fraksjon. Denne metoden er en enkel og nøyaktig metode for profilering lymfe lipoproteiner og bør vurderes ved vurdering av renhet kylomikron prøver fra tarm lymfe ^45. Endelig Tabell 1 inneholder de biokjemiske komponentene i intestinal lymfe samlet inn fra nyfødte griser 7 dager etter kirurgi.

I konklusjonen, langsiktig kateterisering av intestinal lymfe stammen er vellykket i små griser. Med denne teknikken, kan lymfatisk kateterisering brukes til å samle inn og undersøke komponenter av lipidmetabolismen. Renheten av lymfe, mengden av lymfe produsert og mengdene av bestanddelene i lipid metabolismeer lik mengden som er tilstede i gris sentral lymfe i andre forsøk ^9,25,26,42. Resultatene tyder på at bruk av en ventral midtlinje kirurgisk tilnærming med forsiktig vev disseksjon og fartøy håndtering for å kateterisere tarm lymfatiske stammen hos unge griser er en utmerket metode for å samle inn store mengder sentral lymfe.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Miller laryngoscope blade	Welch Allyn	68044	182 mm length
Surgivet advisor: Vital signs monitor	Surgivet	V9203
Rectal temperature probe	Surgivet	V3417
Mono-polar electrosurgery generator	Valley Lab
Metzenbaum scissors	Fine Science	14518-18
Tuffier retractor	Stevens	162-11-676
Mosquito forceps	Stevens	162-7-10
Kelly forceps-curved (14cm)	Stevens	162-7-38
Allis tissue forceps	Stevens	162-7-38
Forceps dressing-eye (10.2cm)	Stevens	162-18-780
Forceps dressing-Adison (12.1cm)	Stevens	162-17-2510
Needle Drivers	Stevens	162-V98-42
Iris scissors	Fine science	14058-11
Circulating water pump	Jorvet	J-783X
Maxitherm-Vinyl blanket	Jorvet	J-784C
Q tip applicators	Fisher Scientific	22-037-960
Catheterization  tubing (4.06 OD X 2.31 ID)	Braintree Scientific Inc.	MRE-160	Micro-Renethane implantation tubing
2-0 silk suture	Ethicon	LA556
2-0 polyglactin suture	Ethicon	J443H	2-0 vicryl
Large animal jacket	Lomir Biomedical Inc.	SSJ2YC
Polypropylene wash bottles	Fisher Scientific	03-409-22C	500 ml
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	D4333
EDTA	Sigma Aldrich	60-00-4
Amphotericin B	Sigma Aldrich	A2411
Azaperone	Elanco Animal Health		Stresnil
Dexmedetomidine hydrochloride	Zoetis	6295	Dexdomitor
Isoflurane	Abbott Animal  Health	05260-5	IsoFlo
Ketamine hydrochloride	Zoetis	2626	Ketaset
Bupenorphine hydrochloride	Champion Alstoe Animal Health		DIN:02347510
6 mm Endotracheal tube	Jorvet	J-165d
10% Lidocaine spray	AstraZeneca		DIN:02003767
4 % Chlorhexidine surgical scrub	Partnar Animal Health	PCH-011	Diluted: 2.0% solution
3M Surgical steri- drape	3M Health Care	1040
SDS page gel	Invitrogen	EA0375BOX	3-8 % tris acetate
Polyvinylidene fluoride membrane	Millipore	IPVH00010	0.45 μm pore size
ApoB antibody	EMD Millipore	AB742	1:4000 dilution
Donkey anti-goat IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnology	Sc-2304
ECL Prime Western Blotting Reagent	GE Healthcare LifeSciences	RPN2232
Triglyceride Kit	Wako Pure Chemicals	998-40391/994-40491
Total Cholesterol Kit	Wako Pure Chemicals	439-17501
Total Protein	Pierce	23225	Bicinchoninic Acid Assay