Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מיפוי הגנום של תרופות-DNA בתאי אינטראקציות עם COSMIC (Crosslinking של מולקולות קטנות לבודד הכרומטין)

Published: January 20, 2016 doi: 10.3791/53510
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1, 1,4
1Department of Biochemistry, University of Wisconsin–Madison, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of Wisconsin–Madison, 3Graduate Program in Cellular and Molecular Biology, University of Wisconsin–Madison, 4The Genome Center, University of Wisconsin–Madison

Summary

זיהוי המטרות הישירות של מולקולות מיקוד הגנום עדיין מהווה אתגר גדול. כדי להבין כיצד מולקולות ה- DNA מחייבת לעסוק הגנום, פיתחנו שיטה המסתמכת על crosslinking של מולקולות קטנות לבודד את הכרומטין (קוסמי).

Abstract

הגנום הוא היעד של חלק מchemotherapeutics היעיל ביותר, אבל רוב התרופות האלה חסרות ייחוד רצף ה- DNA, מה שמוביל לרעילות ורבות תופעות לוואי שליליות הגבלת מינון. מיקוד הגנום עם מולקולות קטנות רצף ספציפי עשויה לאפשר מולקולות עם מדד טיפולי מוגבר ופחות השפעות חוץ-היעד. -methylpyrrole N / מפוליאמידים -methylimidazole N הם מולקולות שיכולים להיות מתוכנן בצורה רציונלית למקד רצפי DNA ספציפיים בדייקנות מופלאה. ושלא כמו גורמי שעתוק הטבעיים ביותר, מפוליאמידים יכולים להיקשר ל- DNA מפוגל וchromatinized ללא הפסד בזיקה. הסגוליות הרצף של מפוליאמידים נחקר בהרחבה במבחנה עם זיהוי אתרו מקור (CSI) ועם גישות ביוכימיות וbiophysical מסורתיות, אבל המחקר של פוליאמיד מחייב מטרות הגנומי בתאים נותר חמקמק. כאן אנו מדווחים על שיטה, crosslinking של מולקולות קטנות לאיזולההכרומטין te (קוסמי), המזהה אתרי פוליאמיד מחייב על פני הגנום. COSMIC דומה לimmunoprecipitation הכרומטין (שבב), אך שונה בשתי דרכים חשובות: (1) photocrosslinker מועסק כדי לאפשר לכידה סלקטיבית, באופן זמני בשליטה של ​​אירועים מחייבים פוליאמיד, ו- (2) ידית זיקת ביוטין משמשת כדי לטהר פוליאמיד conjugates -DNA בתנאי denaturing-למחצה כדי להקטין את ה- DNA שהוא אינן מחויב קוולנטית. קוסמי הוא אסטרטגיה כללית שניתן להשתמש בי כדי לחשוף את האירועים מחייבים הגנום של מפוליאמידים ותרופות כימותרפיות מיקוד הגנום אחרים.

Introduction

המידע להפוך כל תא בגוף האדם מקודד בדנ"א. השימוש סלקטיבי במידע שמסדיר את גורלו של תא. גורמי שעתוק (TFS) הם חלבונים שנקשרים לרצפי DNA ספציפיים להביע משנה מסוים של גנים בגנום, והתקלה של TFS צמודה לתחילתה של מגוון רחב של מחלות, כולל פגמים התפתחותיים, סרטן, סוכרת ו . 1,2 אנחנו כבר מתעניינים בפיתוח מולקולות שיכולות באופן סלקטיבי להיקשר לגנום ולווסת רשתות רגולציה גן.

Polyamides מורכבת מ-methylpyrrole N ו- N -methylimidazole הם מעוצבים באופן רציונלי מולקולות שיכולים למקד את ה- DNA עם ספציפיות וזיקות שגורמים יריבים טבעיים שעתוק. 3-6 מולקולות אלה נקשרים לרצפים ספציפיים בחריץ הקטן של ה- DNA. 4,5,7 -11 Polyamides להיות מועסק לשני להדחיק ולהפעיל את הביטוי של ז הספציפיEnes. 4,12-19 יש להם גם תכונות אנטי 12,13,25-30 20-24 ואנטי סרטניות מעניינות. תכונה מושכת אחד מפוליאמידים היא היכולת שלהם כדי לגשת לרצפי DNA המפוגלים 31,32 ועוטפים את חלבוני היסטון 9,10,33.

כדי למדוד את ספציפיות מחייבות המקיפה של מולקולות ה- DNA מחייבת, המעבדה שלנו יצרה מזהה אתרו מקור השיטה (CSI). 34-39 ההתרחשות הצפויה של אתרי קישור המבוסס על במבחנה ספציפיות (genomescapes) יכול להיות מוצג בגנום, כי במבחנה עוצמות מחייבות הן ביחס ישר לקבועי עמותה (K). 34,35,37 genomescapes אלה מספק תובנה תפוסת פוליאמיד פני הגנום, אבל פוליאמיד מדידה מחייב בתאים חיים כבר אתגר. ה- DNA ארוז היטב בגרעין, שעלול להשפיע על הנגישות של אתרי קישור.ccessibility של רצפי DNA chromatinized אלה למפוליאמידים נשאר בגדר תעלומה.

לאחרונה, שיטות רבות ללמוד אינטראקציות בין מולקולות קטנות וחומצות גרעין צמחו. 40-48 הלכידה הכימית הזיקה ורצפי DNA מקבילים מסיבי (Chem-seq) הוא טכניקה אחת כזו. Chem-seq משתמש פורמלדהיד לcrosslink מולקולות קטנות ליעד הגנומי של ריבית ונגזרת biotinylated של מולקולה קטנה של עניין כדי ללכוד את האינטראקציה יגנד-היעד. 48,49

crosslinking פורמלדהיד מוביל לאינטראקציות עקיפות שיכול לייצר תוצאות חיוביות שגויות. 50 פיתחנו שיטה חדשה, crosslinking של מולקולות קטנות לבודד את הכרומטין (קוסמי), 51 עם photocrosslinker לחסל פסגות אלה מה שנקרא "פנטום". 50 כדי להתחיל, עיצבנו ומסונתז נגזרי trifunctional של מפוליאמידים. מולקולות אלה הכילו Pol ה- DNA מחייבתyamide, photocrosslinker (psoralen), וידית זיקה (ביוטין, איור 1). עם מפוליאמידים trifunctional, אנחנו יכולים קוולנטית ללכוד אינטראקציות פוליאמיד-DNA עם קרינת UV 365 ננומטר, אורך גל שאינו לגרום נזק לדנ"א או לגרום crosslinking-לא-psoralen מבוססת. 51 הבא, אנו מפצלים את הגנום ולטהר את ה- DNA שנתפס תחת מחמיר, חצי תנאי -denaturing להקטין DNA שהוא אינן מחויב קוולנטית. לפיכך, אנו רואים COSMIC כשיטה הקשורים לכימיה-seq, אבל עם קריאת נתונים ישירים יותר של ה- DNA מיקוד. חשוב לציין, החלש (K 10 3 -10 4 M -1) זיקה של psoralen לDNA לא במובחן, פוליאמיד השפעה סגוליות. 51,52 ניתן לנתח קטעי DNA המועשר או על ידי תגובת השרשרת של פולימראז כמותיים 51 (קוסמי qPCR) או על ידי רצף 53 (COSMIC-seq) של הדור הבא. נתונים אלה מאפשרים עיצוב של ligands משוחד, מודרך הגנום שביןלפעול עם הלוקוסים הגנומי הרצויים שלהם ולמזער את ההשפעות חוץ-היעד.

איור 1
איור 1. מפוליאמידים ביו ותכנית קוסמית. () מפוליאמידים מכבנה 1 - 2 יעד רצף ה- DNA 5'-WACGTW-3 ". מפוליאמידים יניארי 3 - 4 יעד 5'-AAGAAGAAG-3 ". טבעות של N-methylimidazole מודגשות לבהירות. חוגים פתוחים ומילאו לייצג -methylpyrrole N ו-methylimidazole N, בהתאמה. הכיכר מייצגת 3-chlorothiophene, ויהלומים מייצגים β-אלאנין. Psoralen וביוטין מסומנים על ידי P ו- B, בהתאמה. תכנית קוסמית (B). תאי מטופלים עם נגזרי trifunctional של מפוליאמידים. לאחר crosslinking עם קרינת UV 365 ננומטר, תאים LDNA ysed והגנומי הוא טעון. חרוזים מגנטיים streptavidin המצופה מתווספים ללכוד adducts פוליאמיד-DNA. ה- DNA משתחרר ויכול להיות מנותחת על ידי PCR כמותית (QPCR) או על ידי רצף של הדור הבא (NGS). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Crosslinking בתאים חיים

  1. תתחיל עם 2.5x10 ~ 7 תאי H1, או תאים בתרבית אחרים.
    הערה: מספר זה של תאי H1 מתאים לחמש מנות של 10 סנטימטר (confluency כ -40%).
  2. לגדל תאים בתקשורת E8 על מנות מצופים על משטח שתומך בתאי גזע pluripotent (ראה חומרי רשימה), ודגירתם על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified של 5% CO 2. קציר תאי אנזימים (ראו חומרי רשימה). הערה: אל תאפשר תאי H1 יעלו על 90% confluency; confluency גורם התמיינות ספונטנית של תאי H1. לספור תאים, לגדול צלחת 10 סנטימטרים נוספת של תאים, להרים את תאי אנזימים כמפורט בסעיפים 1.8-1.10, ולספור אותם עם hemocytometer.
    1. הכן תקשורת תרבות E8 כפי שתואר באל חן ואח. 54
  3. לפני הוספת פוליאמיד, להסיר את המדיה התרבות בילתה עם פיפטה פסטר המצורפת למלכודת ואקום. הוסף מדיה טרי עם כפיפטה erological ומנפק פיפטה (8 מ"ל לכל צלחת 10 סנטימטרים).
    הערה: הוסף מדיה לצד השני של הצלחת כדי למנוע שיבוש התאים. מנקודה זו ואילך להגן על התאים מפני אור, כדי למנוע צילום crosslinking המוקדם.
  4. להוסיף פוליאמיד עם טפטפת (8 μl של 400 מיקרומטר פוליאמיד בDMSO, 400 ריכוז סופי ננומטר) ישירות לתקשורת והתרבות של כל מנה. מערבולת הצלחת לפזר באופן שווה לפוליאמיד התקשורת.
    הערה: ריכוז יכול להיות מגוון, אך להבטיח כי לא רעיל סלולארי הוא ציין לטיפול שנבחר.
  5. דגירה התאים 24 שעות 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified של 5% CO 2, ולהבטיח שהם מוגנים מפני אור.
    הערה: זמן הדגירה יכול להיות מגוון למדוד פוליאמיד מחייב על פני זמן.
  6. לשטוף כל צלחת 10 סנטימטרים עם 4 מיליליטר PBS (monobasic 1.05 מ"מ פוספט אשלגן, נתרן כלורי 155.17 מ"מ, 2.97 dibasic פוספט נתרן מ"מ) באמצעות דיס פיפטה וטפטף סרולוגיותpenser. לשאוב PBS ולהוסיף 3 מיליליטר תרבות תקשורת E8.
  7. עם האורות מעומעמים, להסיר את המכסה של 5 מנות תרבות ולמקם את התאים על משטח שטוח מחוץ למכסת המנוע. מניחים מסנן זכוכית מעל 5 מנות התרבות לסנן אור עם λ <300 ננומטר. הנח את מקור UV על גבי מסנן. דגימות Crosslink 30 דקות עם 365 ננומטר קרינת UV (2.4 mW / 2 סנטימטר).
    הערה: crosslinking זמן צריכה להיקבע באופן אמפירי.
  8. העבר את תרבות מנות בחזרה למכסת המנוע. לשאוב את התקשורת עם פיפטה פסטר המצורפת למלכודת ואקום. לשטוף כל צלחת 10 סנטימטרים עם 4 מיליליטר PBS. לשאוב את PBS. להוסיף 3 מיליליטר אנזים לתא דיסוציאציה (ראה חומרי רשימה) לכל צלחת 10 סנטימטרים לנתק את התאים. דגירה 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: אל טרום חם האנזים.
  9. להרוות את האנזים עם 3 מיליליטר תקשורת E8 לכל צלחת. העברה ניתקה תאים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר-אחד.
    הערה: תאי מקום על קרח מנקודה והלאה זה.
  10. Centrifuge ניתק תאים 5 דקות, XG 500 ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוב supernatant להסיר אנזים ותקשורת.
    הערה: השהה נקודה. תאים יכולים פלאש-קפוא בחנקן נוזלי להיות, מאוחסנים ב -80 ° C לעיבוד לאחר מכן במועד מאוחר יותר.

2. בידוד של הכרומטין

  1. הוסף חוצץ COSMIC 1.2 מיליליטר (20 מ"מ טריס-HCl [pH 8.1], 2 מ"מ EDTA, 150 מ"מ NaCl, 1% Triton-X100, 0.1% SDS) ופיפטה מעלה ומטה מספר פעמים לresuspend תא גלולה עבור כל דגימה ב 1.2 מיליליטר חיץ קוסמי.
    1. להוסיף 133 μl כל של 100 מ"מ פלואוריד phenylmethylsulfonyl (PMSF), 100 מ"מ benzamidine, ו -150 מיקרומטר pepstatin מעכבי פרוטאז טרי לריכוז סופי של 1 מ"מ לPMSF וbenzamidine ו -1.5 מיקרומטר לpepstatin. פתרון פיצול של lysate התא לשני ענבר 1.7 מיליליטר צינורות microcentrifuge.
  2. Sonicate עם sonicator 35 דקות (10 שניות על, 10 שניות את, 60% כוח) לפצל את הגנום לבין 100נ"ב nd 500.
    1. לשמור על הרמה של פתרון הכרומטין במקביל צינור microcentrifuge לרמה של מים במאגר. אשר רמה זו על ידי בדיקה ויזואלית.
      הערה:. ודא שה- DNA היה טעון עם 1.5% agarose ג'ל 55
    2. לייעל את זמן sonication באופן אמפירי. השתמש בכמות מינימאלית של קרח במאגר לצנן את הדגימות, ולהבטיח את הקרח לא מפריע בין הדגימות וקרן הכוס.
  3. צנטריפוגה המדגם XG 12,000 10 דקות. שמור את התמיסה המימית המכילה הכרומטין המסיס על ידי העברתו לצינור microcentrifuge הענבר חדש עם טפטפת. זורק את הכדור.
  4. העבר את 110 μl (10%) של מדגם לצינור microcentrifuge חדש ולתייג אותו DNA קלט. חנות ב -80 מעלות צלזיוס. שמור את שאר מדגם הכרומטין על קרח לשימוש בשלב 3.3.

3. לכידה של יגנד-DNA Crosslinks

  1. השתמש פיפטה לוותר streptavi 60 μlדין מצופה חרוזים מגנטיים בצינור microcentrifuge. הוסף 1 מיליליטר חיץ קוסמי ולערבב בדקות nutator 5 ב RT. הנח חרוזים מגנטיים על הפרדה מגנטית לצבור 2 דקות כדי ללכוד חרוזים. הסר חיץ קוסמי עם טפטפת.
    הערה: אל תאפשר את החרוזים להתייבש. פנה מייד לשלב הבא.
  2. להוסיף מדגם הכרומטין (~ 1 מיליליטר) לחרוזים (60 μl) וresuspend את החרוזים. דגירה הכרומטין עם חרוזים streptavidin מצופה מגנטיים לפחות 4 שעות במערבל מסתובב, מתנדנד על 4 מעלות צלזיוס. דגירה דגימות O / N אם תרצה בכך.

4. בידוד של DNA מטוהר-זיקה

  1. לשטוף חרוזים עם 7 מרווח דקות ב RT עם המאגרים לשטוף הבאים כדי להסיר אינטראקציות שאינן ספציפיות. השתמש במדף הפרדה מגנטי כדי ללכוד חרוזים לאחר כל שטיפה. Resuspend חרוזים לאחר כל שינוי בחיץ כביסה.
  2. הכן מאגרים לשטוף במים ללא יונים מזוקקים ומסנן (0.2 מיקרומטר) לפני השימוש. מאגרים לשטוף חנות 1 ו -2 על 4 מעלות צלזיוס ליםחודשי everal. הכן הצפת לשטוף 3 טרי בכל יום. הוספה והסרה של מאגרים לשטוף מן המדגם עם טפטפת. עבור 2 ו -4, להוסיף 1 ו -3 (5 מ"מ), בהתאמה, בשוטף. בנוסף ניתן לכבס דגימות פעמיים עם חיץ קוסמי (פעם אחת 12 שעות, פעם 4 שעות) לפני שוטף המפורטים להלן.
    1. שטפי פעם עם הצפת לשטוף 1 (10 מ"מ טריס-Cl [pH 8.0], 1 mM EDTA, 3% SDS). שטפי פעם עם הצפת לשטוף 2 (10 מ"מ טריס-Cl [pH 8.0], 250 מ"מ LiCl, 1 mM EDTA, 0.5% NP40, 1% deoxycholate נתרן). לשטוף פעמיים עם הצפת לשטוף 3 (4 M אוריאה, 10 מ"מ טריס-Cl [pH 7.5], 1 mM EDTA, 0.1% NP-40). לשטוף פעמיים עם טריס EDTA (TE) חיץ (10 מ"מ טריס-Cl [pH 8.0], 1 mM EDTA).
  3. Resuspend חרוזים במאגר TE 200 μl עם טפטפת. מדגם זה של ה- DNA שנתפס נקרא DNA מטוהר זיקה (AP).
  4. להשלים את ה- DNA הקלט וAP עם 10x היפוך מאגר Crosslink (100 מ"מ טריס-Cl [pH 8.0], 1 M KOH, 4 מ"מEDTA) ל1x ריכוז סופי. 56,57 30 דקות לדגור על 90 מעלות צלזיוס.
    הערה: גם 254 ננומטר קרינת UV ניתן להשתמש כדי להפוך את crosslink psoralen, 58 אבל יכולים להיווצר הדימרים פירימידין cyclobutyl מקרינה באורך גל זה ומפריע לעיבוד במורד הזרם של ה- DNA.
  5. לAP DNA, במקום צינור microcentrifuge המכיל את המדגם על הפרדה מגנטית לצבור 2 דקות ב RT והנוזלי (DNA) בידוד עם טפטפת. העבר AP DNA (שכבר שוחרר מהחרוזים) לצינור microcentrifuge הענבר חדש.
    הערה: ה- DNA AP הרצוי בנוזל, כבר לא מחובר לחרוזים.
  6. לנטרל קלט וDNA AP עם HCl המרוכז לpH 7 על ידי הוספה כ 1 μl 6 N HCl לכל 100 מדגם μl עם טפטפת. לאשר את הדגימות נוטרלו על ידי הוספה ~ 0.5 μl על נייר pH עם טפטפת אזהרה:. HCl מרוכז הוא חומצת מאכל חזקה. ידית פי המוסד שלך217; הנחיות של לציוד מגן האישי המתאים.
  7. להוסיף RNase (100 מ"ג / מיליליטר) 0.2 מיקרוגרם / μl ריכוז סופי לשני קלט וAP DNA. דגירה השעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס. להוסיף proteinase K (20 מ"ג / מיליליטר) 0.2 מיקרוגרם / μl ריכוז סופי לשני קלט וAP DNA, להוסיף. דגירה שעה 1 על 55 מעלות צלזיוס.
  8. לטהר את ה- DNA עם ערכת ניקוי עמודת ה- DNA (ראה רשימת חומרים). 55 Elute DNA ב -58 H הכיתה DNA μl 2 O. דגימות קלט החנות וAP ב -20 או -80 מעלות צלזיוס
  9. לנתח AP DNA על ידי תגובת השרשרת של פולימראז כמותיים (qPCR) עם פריימרים מוקד ספציפי, ו / או על ידי רצף של הדור הבא. לqPCR, להשתמש 2 μl DNA AP למוקד עם הפרמטרים הבאים: מחזור 1 של 95 מעלות צלזיוס 10 דקות ו -40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס 20 שניות, 54 מעלות צלזיוס או 56 ° C 20 שניות, 72 מעלות צלזיוס 40 שניות.
    הערה: טמפרטורת חישול צריכה להיות שונה בהתאם לטמפרטורת ההתכה של זוגות פריימר משמשים. בחר טמפרטורות חישולמחדש שממזער את מחזור quantitation ללא הגברה ספציפי.
    הערה: לניתוח על ידי רצף של הדור הבא, לשאוף לפחות 10 מיליון ממופים קורא. מספר הממופה קורא יכול להיות מוגבר על ידי הגדלת כמות ה- DNA AP ועל ידי שילוב של פחות דגימות בריצה רצף. עוד קוראים לשפר את הרגישות. חבילות סטנדרטיים לניתוח שבב seq (למשל, הומרו, 59 MACS, 60 וSPP 61) לעבוד עם נתונים קוסמי ואילך. כמו בשיטות אחרות המסתמכות על רצף של הדור הבא, כוללים רצף הגנום ושבב seq, אזורים חוזרים ליצור בהירויות ביישור והרכבה ובכך להישאר אתגר טכני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להסביר את פיצול הגנום לא אחיד ומשתנים אחרים, את ה- DNA המטוהר תמיד צריך להיות מנורמל נגד התייחסות של ה- DNA קלט. ניתן להשתמש בפריימרים ספציפיים למוקד של עניין. זה מועיל גם לנתח מוקד שבו המולקולה אינה צפויה לאגד, כביקורת שלילית. אנו רואים עלייה> פי 100 בתפוסת פוליאמיד על הקרנה עם 365 ננומטר אור (איור 2).

DNA המועשר יכול גם להיות מנותח על ידי רצף של הדור הבא. DNA מוכן לסידור באותו אופן כמו השבב ה- DNA מוכן (למשל, עם מדגם ערכת הכנה מסחרית, ראה חומרי רשימה). אפילו עם רצף של הדור הבא, אנחנו עדיין משתמשים qPCR כדי לאשר העשרה של ה- DNA בלוקוסים שבו אנו מצפים פוליאמיד להיות מחויבים. רצף פעם אחת, DNA הגלם קורא מיושרים לעקבות הגנום וצפיפות מוכנות עם אותה התוכנה שנועדה לנתח נתונים שבב seq (איור 3). תוֹאַר רִאשׁוֹןsed על הניתוח של הפצות פוליאמיד בתאים שלנו, מצאנו כי התקבצו אתרי קישור, פורש מגוון רחב של זיקות, הטוב ביותר לחזות התפוסה בתאים. אנחנו פיתחנו אלגוריתם להבקיע הגנום כולו למחייב עם הנתונים שלנו במבחנה CSI (איור 4 א). שיטת ניקוד זה גילה כי לוקוסים הגנומי שונים עם ציונים מחייבים חזו דומים להפגין אשכולות המגוונים של אתרים מרובים של זיקות שונות (איור 4).

איור 2
איור 2. תוצאות של COSMIC-qPCR. השפעת קרינת UV 365 ננומטר על החלק של AP / קלט מתאי HEK293. AP, מטוהר זיקה. תוצאות נרשמות על בקנה מידה יומן ומייצגות ממוצע ± SEM

איור 3
אינטרנט אלחוטיאיור 3. תוצאות של COSMIC-seq בתאי H1. מסלול צפיפות תג קוסמי-seq לפוליאמיד יניארי 4 נועד למקד חוזר AAG. צפיפות תג מנורמלת 10 7 תגים ומוצגת עם המשולב הגנום Viewer. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
דגם איור 4. של פוליאמיד המחייב. מגרשי כינור () של ציונים חזו עבור 2 ו -4 מחייבים על פני כל הגנום. genomescapes נציג ל4 גם מוצג. עם שיטת ניקוד bioinformatic מועסק, לוקוסים הגנומי יכולים לסכם לאותו ציון חזה בדרכים שונות. (ב) לוקוסים עם sho רצפים נמוכים מרובות ובינוני-זיקהתפוסת פוליאמיד דומה w ללוקוסים עם רצפים גבוהה זיקה כמה. הודפס מחדש באישור. 51 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) any source
Benzamidine any source
Pepstatin any source
Proteinase K any source
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Life Technologies 65001
PBS, pH 7.4 Life Technologies 10010-023 Other sources can be used
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Life Technologies A1110501
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 We have tried other manufacturers of DNA columns with success.
TruSeq ChIP Sample Prep Kit Illumina IP-202-1012 This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing
Matrigel Basement Membrane Matrix BD Biosciences 356231 Used to coat plates in order to grow H1 ESCs
pH paper any source
amber microcentrifuge tubes any source
microcentrifuge tubes any source
pyrex filter any source Pyrex baking dishes are suitable
qPCR master mix any source
RNase any source
HCl (6 N) any source
10-cm tissue culture dishes any source
Serological pipettes any source
Pasteur pipettes any source
Pipette tips any source
15-ml conical tubes any source
centrifuge any source
microcentrifuge any source
nutator any source
Magnetic separation rack any source
UV source CalSun B001BH0A1A Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically
Misonix Sonicator Qsonica S4000 with 431C1 cup horn Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically
Humidified CO2 incubator any source
Biological safety cabinet with vacuum outlet any source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and Its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2013).
  2. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nat Rev Genet. 10, 252-263 (2009).
  3. Meier, J. L., Yu, A. S., Korf, I., Segal, D. J., Dervan, P. B. Guiding the Design of Synthetic DNA-Binding Molecules with Massively Parallel Sequencing. J. Am. Chem. Soc. 134, 17814-17822 (2012).
  4. Dervan, P. B. Molecular recognition of DNA by small molecules. Bioorg. Med. Chem. 9, 2215-2235 (2001).
  5. Wemmer, D. E., Dervan, P. B. Targeting the minor groove of DNA. Curr. Opin. Struct. Biol. 7, 355-361 (1997).
  6. Eguchi, A., Lee, G. O., Wan, F., Erwin, G. S., Ansari, A. Z. Controlling gene networks and cell fate with precision-targeted DNA-binding proteins and small-molecule-based genome readers. Biochem. J. 462, 397-413 (2014).
  7. Mrksich, M., et al. Antiparallel side-by-side dimeric motif for sequence-specific recognition in the minor groove of DNA by the designed peptide 1-methylimidazole-2-carboxamide netropsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7586-7590 (1992).
  8. Edayathumangalam, R. S., Weyermann, P., Gottesfeld, J. M., Dervan, P. B., Luger, K. Molecular recognition of the nucleosomal "supergroove". Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 6864-6869 (2004).
  9. Suto, R. K., et al. Crystal structures of nucleosome core particles in complex with minor groove DNA-binding ligands. J. Mol. Biol. 326, 371-380 (2003).
  10. Gottesfeld, J. M., et al. Sequence-specific Recognition of DNA in the Nucleosome by Pyrrole-Imidazole Polyamides. J. Mol. Biol. 309, 615-629 (2001).
  11. Chenoweth, D. M., Dervan, P. B. Structural Basis for Cyclic Py-Im Polyamide Allosteric Inhibition of Nuclear Receptor Binding. J. Am. Chem. Soc. 132, 14521-14529 (2010).
  12. Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-κB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 1023-1028 (2012).
  13. Yang, F., et al. Antitumor activity of a pyrrole-imidazole polyamide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1863-1868 (2013).
  14. Mapp, A. K., Ansari, A. Z., Ptashne, M., Dervan, P. B. Activation of gene expression by small molecule transcription factors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3930-3935 (2000).
  15. Ansari, A. Z., Mapp, A. K., Nguyen, D. H., Dervan, P. B., Ptashne, M. Towards a minimal motif for artificial transcriptional activators. Chem. Biol. 8, 583-592 (2001).
  16. Arora, P. S., Ansari, A. Z., Best, T. P., Ptashne, M., Dervan, P. B. Design of artificial transcriptional activators with rigid poly-L-proline linkers. J. Am. Chem. Soc. 124, 13067-13071 (2002).
  17. Nickols, N. G., Jacobs, C. S., Farkas, M. E., Dervan, P. B. Modulating Hypoxia-Inducible Transcription by Disrupting the HIF-1–DNA Interface. ACS Chemical Biology. 2, 561-571 (2007).
  18. Pandian, G. N., et al. A synthetic small molecule for rapid induction of multiple pluripotency genes in mouse embryonic fibroblasts. Sci. Rep. 2, 544 (2012).
  19. Pandian, G. N., et al. Synthetic Small Molecules for Epigenetic Activation of Pluripotency Genes in Mouse Embryonic Fibroblasts. Chem Bio Chem. 12, 2822-2828 (2011).
  20. He, G., et al. Binding studies of a large antiviral polyamide to a natural HPV sequence. Biochimie. 102, 83-91 (2014).
  21. Edwards, T. G., Vidmar, T. J., Koeller, K., Bashkin, J. K., Fisher, C. DNA Damage Repair Genes Controlling Human Papillomavirus (HPV) Episome Levels under Conditions of Stability and Extreme Instability. PLoS ONE. 8, e75406 (2013).
  22. Edwards, T. G., Helmus, M. J., Koeller, K., Bashkin, J. K., Fisher, C. HPV Episome Stability is Reduced by Aphidicolin and Controlled by DNA Damage Response Pathways. Journal of Virology. , (2013).
  23. Edwards, T. G., et al. HPV episome levels are potently decreased by pyrrole-imidazole polyamides. Antiviral Res. 91, 177-186 (2011).
  24. Dickinson, L. A., et al. Inhibition of RNA polymerase II transcription in human cells by synthetic DNA-binding ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12890-12895 (1998).
  25. Dickinson, L. A., et al. Arresting Cancer Proliferation by Small-Molecule Gene Regulation. Chem. Biol. 11, 1583-1594 (2004).
  26. Nickols, N. G., et al. Activity of a Py–Im Polyamide Targeted to the Estrogen Response Element. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 675-684 (2013).
  27. Raskatov, J. A., Puckett, J. W., Dervan, P. B. A C-14 labeled Py–Im polyamide localizes to a subcutaneous prostate cancer tumor. Bioorg. Med. Chem. 22, 4371-4375 (2014).
  28. Jespersen, C., et al. Chromatin structure determines accessibility of a hairpin polyamide–chlorambucil conjugate at histone H4 genes in pancreatic cancer cells. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 4068-4071 (2012).
  29. Chou, C. J., et al. Small molecules targeting histone H4 as potential therapeutics for chronic myelogenous leukemia. Molecular Cancer Therapeutics. 7, 769-778 (2008).
  30. Nickols, N. G., Dervan, P. B. Suppression of androgen receptor-mediated gene expression by a sequence-specific DNA-binding polyamide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 10418-10423 (2007).
  31. Minoshima, M., Bando, T., Sasaki, S., Fujimoto, J., Sugiyama, H. Pyrrole-imidazole hairpin polyamides with high affinity at 5CGCG3 DNA sequence; influence of cytosine methylation on binding. Nucleic Acids Res. 36, 2889-2894 (2008).
  32. Warren, C. L., et al. Fabrication of duplex DNA microarrays incorporating methyl-5-cytosine. Lab on a Chip. 12, 376-380 (2012).
  33. Dudouet, B., et al. Accessibility of nuclear chromatin by DNA binding polyamides. Chem. Biol. 10, 859-867 (2003).
  34. Carlson, C. D., et al. Specificity landscapes of DNA binding molecules elucidate biological function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4544-4549 (2010).
  35. Warren, C. L., et al. Defining the sequence-recognition profile of DNA-binding molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 867-872 (2006).
  36. Tietjen, J. R., Donato, L. J., Bhimisaria, D., Ansari, A. Z. Chapter One - Sequence-Specificity and Energy Landscapes of DNA-Binding Molecules. Methods Enzymol. Voigt, C. 497, Academic Press. 3-30 (2011).
  37. Puckett, J. W., et al. Quantitative microarray profiling of DNA-binding molecules. J. Am. Chem. Soc. 129, 12310-12319 (2007).
  38. Keles, S., Warren, C. L., Carlson, C. D., Ansari, A. Z. CSI-Tree: a regression tree approach for modeling binding properties of DNA-binding molecules based on cognate site identification (CSI) data. Nucleic Acids Res. 36, 3171-3184 (2008).
  39. Hauschild, K. E., Stover, J. S., Boger, D. L., Ansari, A. Z. CSI-FID: High throughput label-free detection of DNA binding molecules. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 3779-3782 (2009).
  40. Lee, M., Roldan, M. C., Haskell, M. K., McAdam, S. R., Hartley, J. A. In vitro Photoinduced Cytotoxicity and DNA Binding Properties of Psoralen and Coumarin Conjugates of Netropsin Analogs: DNA Sequence-Directed Alkylation and Cross-Link. 37, 1208-1213 (1994).
  41. Wurtz, N. R., Dervan, P. B. Sequence specific alkylation of DNA by hairpin pyrrole–imidazole polyamide conjugates. Chem. Biol. 7, 153-161 (2000).
  42. Tung, S. -Y., Hong, J. -Y., Walz, T., Moazed, D., Liou, G. -G. Chromatin affinity-precipitation using a small metabolic molecule: its application to analysis of O-acetyl-ADP-ribose. Cell. Mol. Life Sci. 69, 641-650 (2012).
  43. Rodriguez, R., Miller, K. M. Unravelling the genomic targets of small molecules using high-throughput sequencing. Nat Rev Genet. 15, 783-796 (2014).
  44. Guan, L., Disney, M. D. Covalent Small-Molecule–RNA Complex Formation Enables Cellular Profiling of Small-Molecule–RNA Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 10010-10013 (2013).
  45. White, J. D., et al. Picazoplatin, an Azide-Containing Platinum(II) Derivative for Target Analysis by Click Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 135, 11680-11683 (2013).
  46. Rodriguez, R., et al. Small-molecule–induced DNA damage identifies alternative DNA structures in human genes. Nat Chem Biol. 8, 301-310 (2012).
  47. Bando, T., Sugiyama, H. Synthesis and Biological Properties of Sequence-Specific DNA-Alkylating Pyrrole−Imidazole Polyamides. Acc. Chem. Res. 39, 935-944 (2006).
  48. Anders, L., et al. Genome-wide localization of small molecules. Nat. Biotechnol. 32, 92-96 (2014).
  49. Jin, C., et al. Chem-seq permits identification of genomic targets of drugs against androgen receptor regulation selected by functional phenotypic screens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 9235-9240 (2014).
  50. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
  51. Erwin, G. S., Bhimsaria, D., Eguchi, A., Ansari, A. Z. Mapping Polyamide–DNA Interactions in Human Cells Reveals a New Design Strategy for Effective Targeting of Genomic Sites. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 10124-10128 (2014).
  52. Hyde, J. E., Hearst, J. E. Binding of psoralen derivatives to DNA and chromatin: influence of the ionic environment on dark binding and photoreactivity. Biochemistry. 17, 1251-1257 (1978).
  53. Erwin, G. S., Bhimsaria, D., Rodríguez-Martínez, J. A., Grieshop, M. P., Ansari, A. Z. Genome-wide localization of polyamide-based genome readers reveals sequence-based binding to repressive heterochromatin. In preparation. , (2015).
  54. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8, 424-429 (2011).
  55. Deliard, S., Zhao, J., Xia, Q., Grant, S. F. A. Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq). J Vis Exp. (74), e50286 (2013).
  56. Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link. Biochemistry. 27, 5174-5178 (1988).
  57. Kumaresan, K. R., Hang, B., Lambert, M. W. Human Endonucleolytic Incision of DNA 3′ and 5′ to a Site-directed Psoralen Monoadduct and Interstrand. J. Biol. Chem. 270, 30709-30716 (1995).
  58. Cimino, G. D., Shi, Y. B., Hearst, J. E. Wavelength dependence for the photoreversal of a psoralen-DNA crosslink. Biochemistry. 25, 3013-3020 (1986).
  59. Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol. Cell. 38, 576-589 (2010).
  60. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137 (2008).
  61. Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotech. 26, 1351-1359 (2008).
  62. Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).
  63. Martinson, H. G., True, R. J. On the mechanism of nucleosome unfolding. Biochemistry. 18, 1089-1094 (1979).
  64. Gloss, L. M., Placek, B. J. The Effect of Salts on the Stability of the H2A−H2B Histone Dimer. Biochemistry. 41, 14951-14959 (2002).
  65. Jackson, V. Formaldehyde Cross-Linking for Studying Nucleosomal Dynamics. Methods. 17, 125-139 (1999).
  66. Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Meth. 11, 203-209 (2014).
  67. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18602-18607 (2013).
  68. Kundaje, A. Phantompeakqualtools home page. , ENCODE Consortium, Computer Science Dept. Available from: https://www.encodeproject.org/software/phantompeakqualtools/ (2010).
  69. Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 307-320 (2005).
  70. Hurley, L. H. DNA and its associated processes as targets for cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 2, 188-200 (2002).

Tags

ביולוגיה מולקולרית גיליון 107 קוסמי CSI הכרה מולקולרית cheminformatics גנומיקה הכימית פוליאמיד מיקוד הגנום רפואת דיוק DNA immunoprecipitation הכרומטין רצף של הדור הבא
מיפוי הגנום של תרופות-DNA בתאי אינטראקציות עם COSMIC (Crosslinking של מולקולות קטנות לבודד הכרומטין)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Erwin, G. S., Grieshop, M. P.,… More

Erwin, G. S., Grieshop, M. P., Bhimsaria, D., Eguchi, A., Rodríguez-Martínez, J. A., Ansari, A. Z. Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin). J. Vis. Exp. (107), e53510, doi:10.3791/53510 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter