Summary
我们描述用于产生从耳朵和小鼠的尾部的成纤维细胞初级一个简单而快速的实验程序。该过程不需要特殊的动物训练和可用于成纤维细胞培养的产生从存储在RT至10天耳朵。
Abstract
原代细胞是直接从组织来源和被认为是更具有代表性的细胞在体内比建立的细胞系的生理状态。然而，原代细胞培养，通常具有有限的寿命，需要频繁重新建立。成纤维细胞是原代细胞的一个方便的来源。在这里，我们讨论一个简单而快速的实验程序，以建立从耳朵和老鼠尾巴初级成纤维细胞培养。该协议可以用于建立初级成纤维细胞培养从存储在RT至10天耳朵。当协议是经过精心接着，污染物是不太可能发生尽管使用储存延长的时间在某些情况下，非无菌的组织。成纤维细胞增殖迅速在培养和接受复制衰老之前可扩展到相当数量。
Introduction
主细胞来源于体外条件下活组织进行培养。它通常假设原代细胞更接近生理状态和其原始比永生化或肿瘤细胞系1的组织的遗传背景。出于这个原因，原代细胞代表用于研究生物学问题2,3的有用模型。然而，不同于无限增长建立的细胞系，原代细胞最终经历衰老中培养并需要经常重新建立。
常用的原代细胞包括成纤维细胞，上皮细胞，内皮细胞，T细胞，B细胞，骨髓衍生的巨噬细胞（BMDM）和骨髓来源的树突细胞（BMDC）。成纤维细胞通常用作原代细胞培养模型。它们提供超过其他初级细胞关键优势。细胞培养物容易建立，容易地维持和不需要purifica用前，培养细胞。他们有快速的初始扩散和专门的媒体或活化协议没有要求。成纤维细胞可以使用的生物，化学和物理协议4,5-有效地转染。有一种可能性，以存储耳朵之前建立的细胞培养物达10天室温。成纤维细胞培养有利于胞质突起的可视化和适于重新编程成诱导多能干细胞（iPS）6。
成纤维细胞是结缔组织的重要细胞分泌胶原蛋白和细胞外基质7。它们所提供的结构框架在许多组织8和播放在伤口愈合和组织修复9,10-必不可少的作用。
在这里，我们描述了一个简单而快速（<4小时）协议来建立从耳朵成纤维细胞培养和小鼠11尾。该协议需要最少的鼠标经验收获组织（相对于其它协议12,13），并且可以用于建立从存储在介质在RT至10天耳朵培养物。
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Protocol
小鼠饲养在无病原体条件符合机构的指导方针，直到安乐死（机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指导方针，在新加坡国立大学和国家咨询委员会的实验动物研究（NACLAR）的指导方针）。
1.鼠标
- 订购一个鼠标适当的遗传背景。这个协议是基于组织从一个C57BL / 6小鼠衍生的。
2.准备完全培养基
- 10％胎牛血清（FCS），50μM2-巯基乙醇，100微米的天冬酰胺，2mM谷氨酰胺，1％青霉素，链霉素溶液：通过添加以下组件来罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）1640培养基准备完全培养基。
3.准备酶溶液
- 准备在一个15毫升的锥形底部管胶原酶D溶液。
- 称取10毫克胶原酶D.迪在4毫升ssolve胶原酶d完成网上平台。
- 准备在1.7 ml离心管链霉蛋白酶的解决方案。
- 称取10毫克链霉的。
- 加入5微升的1M Tris缓冲液（pH 8.0）。加入1微升的0.5M EDTA（pH 8.0）中。
- 加满494微升无菌水。
- 孵育在37℃的水浴中的链霉蛋白酶溶液30分钟。
4.准备胶原酶D-链霉混合（≤2反面）
注意：请在无菌细胞培养罩随后的步骤。
- 加入250微升链霉蛋白酶溶液至4毫升胶原酶D溶液。
- 通过0.2微米的针筒式过滤器的胶原酶D-链霉蛋白酶混合物到无菌的15毫升锥形底部管。
5.提取成纤维细胞，从耳朵和尾巴组织
- 根据相应的制度指引安乐死小鼠。
- 放置在细胞培养罩蒸压手术器械（剪刀和镊子）。
- 加入10 mL完全培养基分为两10厘米细胞培养每个菜肴。
- 切耳（〜1厘米半径）和5厘米的尾巴（从尾部的尖端）的小鼠用剪刀和在无菌50ml锥形底部管孵育5分钟在40毫升70％的乙醇。
- 风干耳朵和尾巴通过将它们放置在一个开放的10个厘米细胞培养皿在引擎盖5分钟。一旦干燥，如在步骤5.3中所述转印耳和尾件两个培养皿贴上“耳朵”和含有10ml完全培养基“尾巴”。
- 从耳朵和尾巴用剪刀取下头发。
- 切耳朵和尾巴成片超过3毫米大小用剪刀小。
- 转移切割组织进入标有“耳朵”和“尾”1.8毫升冻存管小瓶和补充足够的胶原D-链霉蛋白酶溶液的体积达到1.8 ml刻度的小瓶。
- P水平花边冻存管瓶在振荡器上，在37℃下摇晃样品以200rpm进行90分钟。
- 经过90分钟孵化，请从摇床冻存管小瓶，并将小瓶在通风橱中。
- 加入10 mL完全培养基分为两10厘米细胞培养皿，标有“耳朵”和“尾”每一个，并把一个70微米的细胞过滤的每一道菜。
- 将被消化的耳朵和尾巴组织在70微米的细胞过滤在步骤5.11编制的相应标记菜肴和强制使用10毫升注射器推杆> 5分钟研磨组织。偶尔摇动细胞过滤培养基中洗细胞出细胞滤网。
- 移液器从每道菜的细胞悬液到标有“耳朵”和“尾”两个15毫升锥形底管。洗净的菜，过滤与另外10 ml完全介质和介质添加到相应的15毫升锥形底管。
- 降速细胞悬浮液在580〜xg离心7分钟，并使用冷冻细胞离心机4℃。
- 除去上清液，加入10 ml完全培养基将细胞沉淀在15毫升的锥形底部管和悬浮细胞。
- 重复步骤5.14和5.15。
6.培养细胞混合物的
- 除去上清液。确保细胞沉淀未受干扰。
- 重悬的细胞在10ml完全培养基和相应混合物添加到标记的“耳朵”和“尾”两个10厘米细胞培养皿。
- 加10微升两性霉素B溶液（原液：250微克/毫升）的培养。
- 孵育在湿润的5％CO 2培养箱细胞在37℃。
- 在第三天，用含有10微升两性霉素B以除去碎片10 ml的新鲜完全培养基（ 图1和2）替代培养基。
成纤维细胞7次文化
- WHEN培养达到约70％汇合（3-4培养天）取出介质，并用5毫升无菌1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗细胞。
- 除去PBS中并加入2毫升无菌1×胰蛋白酶-EDTA溶液到细胞中。
- 在湿润的5％CO 2培养箱孵育细胞5分钟，在37℃。
- 5分钟后，轻轻拍打培养皿，并添加6 ml完全培养基的细胞中。
- 细胞悬液转移到15毫升锥形底部管和使用冷冻细胞离心机旋转离心管5分钟，在450〜XG和4℃。
- 除去上清液，并轻轻重新悬浮在5ml完全培养基将细胞沉淀。
- 种子2×10 5个细胞中有10厘米细胞培养皿并重复步骤7.1至7.6之前孵育细胞，在37℃在湿润的5％CO 2培养箱3-4天。
8.准备耳朵装运
注：执行牛逼他在无菌细胞培养罩后续步骤。
- 根据相应的制度指引安乐死小鼠。
- 放置蒸压剪刀和镊子进入细胞培养罩。
- 加入50 ml完全培养基到50毫升锥形底部管。
- 切割的小鼠用剪刀耳（〜1厘米半径）。
- 转移耳朵入50ml锥形底部管（如制备步骤3）使用镊子。
- 在适当的箱海运在室温之前密封50毫升锥形筒底部用封口膜。
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Representative Results
来自组织的结果的成纤维细胞的一个显著量组织碎片的提取（ 图1）。在对比组织碎片，纤维母细胞附着到1天，3培养的间组织培养塑料表面。成纤维细胞培养物的培养基可以安全地变更上培养，其中应显著减少在培养（图2）的碎片本水平的3天。的成纤维细胞显示的细长形态和一个清晰可见的细胞质（图1和2）。有丝分裂的细胞应该从培养的第3天起，现在和细胞应在3-4天的文化达到的细胞融合的70-80％。从耳和尾组织中有10厘米培养皿的屈服范围从4至5×10 5（耳朵）和5至6×10 5个细胞（尾翼）上培养3天。下面的成纤维细胞隔离的第三天，细胞可以传代，并接种在每10cm培养皿2×10 5个细胞。
从存储在RT 10天耳朵的成纤维细胞的提取应导致内培养的5至6天的70-80％的细胞融合（ 图3）。 5天之后，接种细胞在每10cm培养皿2×10 5细胞也应产生约1×10 6个细胞在3-4天内培养的。长期贮存不影响所花费的成纤维细胞，以我们的经验进入衰老的时间（数据未显示）。
后培养3天后验证单元的身份，细胞可以标记为成纤维细胞标记物波形蛋白14.使用上述协议由波形蛋白染色（图4）所指示的，我们经常获得纯成纤维细胞培养物。
在之前3天提取后图1成纤维细胞培养，以改变介质。细胞碎片的代表性亮场图像（白色箭头）存在于培养的第3天。图像用光学显微镜拍摄的以100×放大倍数。比例尺为100μm。 请点击此处查看该图的放大版本。
后第3天提取除了新媒体之后，图2成纤维细胞培养，在培养3天的成纤维细胞的代表性亮场图像。图像是用光学显微镜拍摄的100×320×放大倍率。比例尺为100μm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.后第3天的提取从存储在RT 10天耳组织成纤维细胞培养。成纤维细胞在培养3天代表亮场图像。图像是用光学显微镜拍摄的100×320×放大倍率。比例尺为100μm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.标签成纤维细胞培养的波形蛋白，耳朵和尾巴成纤维细胞在培养的第3天代表共聚焦图像。成纤维细胞从组织中提取被标记为波形蛋白（红色）和DAPI（蓝色）。激光共聚焦MICROS被收购的荧光图像复制。比例尺代表10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在这里，我们提供了一种简单，廉价且快速的实验步骤建立从耳朵和小鼠的尾巴初级成纤维细胞培养物。提取应导致粘附和迅速分裂成纤维细胞内后3天的隔离组织。原代细胞的一个重要的限制是衰老，一个永久生长停滞15。使用的协议，成纤维细胞培养可传代5-6次之前的成纤维细胞变得衰老，通过细胞的扁平化表示，尺寸增加（2-3倍增加）和故障扩大。
当执行的成纤维细胞的分离，注意一定组织的中断期间支付，作为切削不足或消化将导致成纤维细胞的回收率低。有可能凝聚耳和尾部的成纤维细胞，以增加成纤维细胞的数目。可以添加额外的组织，包括腹膜并以相同的方式处理的肺组织，以增加吨他的成纤维细胞。虽然碎片中存在以下的成纤维细胞提取培养，建议为成纤维细胞需要时间来粘附细胞培养皿仅后的第三天改变介质。
该协议的一个潜在的限制是使用非无菌组织和微生物污染的可能性相关联。为了减少污染的危险，耳朵和尾巴收获前的成纤维细胞温育在70％的乙醇。此外，该抗真菌两性霉素B被添加到原代培养，以防止酵母和真菌的生长，一个共同的问题建立成纤维细胞培养时。该培养基还含有青霉素和链霉素以防止细菌污染。使用这些预防措施，污染正在建立从耳朵和尾部保持在室温几天成纤维细胞，即使很少观察到。
一个本协议的主要优点是ABIL性，以产生从之前的成纤维细胞分离储存在介质在RT至10天该耳成纤维细胞。我们在存放10天后（达到70-80％汇合在5-6天内相比，3-4天的新鲜分离的组织）的建立耳朵成纤维细胞培养观察到适度降低效率。因此，小鼠的耳朵可以通过使用标准运输研究人员进行交换，虽然快件建议。根据我们的经验，使用的便利性，以获得耳和该组织极少用于实验程序的事实往往允许访问的转基因小鼠的组织，可能是耗时的，以获得否则。对于尾部恢复成纤维细胞保存后的效率有很大的不同和尾巴应该只使用，如果耳朵不适用于装运。最后，大多数人都应该能够执行协议，作为组织的收获需要在处理的小鼠的最小的专门知识和训练。
该协议只被用小鼠组织进行测试，但在理论上应允许使用其它物种的组织，虽然该协议可能需要进一步优化成纤维细胞培养的产生。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | SV30160.03 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159 | |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 107017 | Absolute for analysis |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088866001 | From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile |
| Pronase protease | Merck Millipore | 53702 | From Streptomyces griseus |
| Tris buffer (pH 8) | 1st BASE | 1415 | Ultra pure grade |
| 0.5M EDTA (pH 8) | 1st BASE | BUF-1053 | Biotechnology grade |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | 1st BASE | BUF-2040-10X4L | Ultra pure grade |
| Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2492-20ml | 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered |
| Scissors | Aesculap | ||
| Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
| 0.2 μM syringe filter | Sartorius Stedim | 16534 | |
| 70 μM cell strainer | SPL | 93070 | |
| Syringe plunger | Terumo | SS+10L | |
| Cryovial tube | NUNC | 368362 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm cell culture dish | Greiner | 664160 | Cell culture treated dish |
| 15 ml conical bottom tube | Greiner | 188271 | |
| 50 ml conical bottom tube | Greiner | 227261 | |
| Water bath | GFL | 1002 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Incubation shaker | Sartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
| Zeiss Axiovert 25 light microscope | Carl Zeiss AG |
References
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