Una nuova strategia che unisce Array-CGH, sequenziamento dell'intero-esoma e nell'Utero elettroporazione in roditori per identificare geni causativi per le malformazioni del cervello

Sommario

Eterotopia nodulare periventricolare (PNH) è la forma più comune di malformazione dello sviluppo corticale (MCD) nell'età adulta, ma la base genetica rimane sconosciuta nei casi più sporadici. Recentemente abbiamo sviluppato una strategia per identificare nuovi geni candidati per MCDs e confermare direttamente loro ruolo causativo in vivo.

Abstract

Difetti di nascita che coinvolgono la corteccia cerebrale — conosciuto anche come malformazioni dello sviluppo corticale (MCD) — sono importanti cause di disabilità intellettiva e account per 20-40% dell'epilessia resistente alla droga nell'infanzia. Formazione immagine del cervello ad alta risoluzione ha facilitato l'identificazione in vivo di un grande gruppo di fenotipi MCD. Nonostante gli avanzamenti nella formazione immagine del cervello, analisi genomica e generazione di modelli animali, un semplice flusso di lavoro sistematicamente la priorità geni candidati e per testare gli effetti funzionali delle mutazioni putative è manca. Per ovviare a questo problema, una strategia sperimentale che consentano l'identificazione di nuovi geni causativi per MCD è stata sviluppata e validata. Questa strategia si basa sulla identificazione candidato regioni genomiche o geni mediante array-CGH o intero-dell'esoma sequenziamento e caratterizzare gli effetti della loro inattivazione o della sovraespressione di mutazioni specifiche nel roditore cervelli via in utero di sviluppo elettroporazione. Questo approccio ha portato all'identificazione del gene C6orf70 , che codifica per una proteina vescicolare, alla patogenesi di eterotopia nodulare periventricolare, un MCD causati da difetti di migrazione neuronali.

Introduzione

La corteccia cerebrale svolge un ruolo chiave nei processi cognitivi e intellettuali ed è coinvolta nella memoria come apprendimento e controllo emotivo. Pertanto, non è sorprendente che molte malattie neurologiche e psichiatriche derivano da malformazioni dello sviluppo corticale (MCD). L'eziologia di MCD è complesso poiché entrambi acquisito e fattori genetici sono coinvolti. La prevalenza cumulativa di geneticamente determinata proporzione di MCD è circa il 2% e sono nella maggior parte dei casi sporadici. Per esempio, l'incidenza di disgenesia cerebrale congenita è stata stimata per essere superiore all'1% nella popolazione umana, e alcune forme di MCD sono osserv....

Protocollo

Dichiarazione etica: Ratti Wistar erano accoppiati, mantenuti e utilizzati nelle strutture animale INMED, in accordo con la legislazione dell'Unione europea e francese.

1. DNA estrazione e quantificazione per Array-CGH e WES

1. Estrarre il DNA genomico (gDNA) dai leucociti del sangue umano da pazienti che usando un robot automatico di isolamento del DNA o disponibili in commercio kit di estrazione del DNA manuale secondo il protocollo del produttore. Quantificare tutti i campioni usando uno spettrofotometro.

2. protocollo array-CGH

1. Digestione di limitazione di gDNA
   <....

Risultati

La strategia sperimentale progettata per identificare nuovi geni causativi di MCD è ricapitolata nella Figura 1.

Eseguendo l'array-CGH in una coorte di 155 pazienti con anomalie dello sviluppo cerebrale combinando variamente PNH (Figura 2A), disgenesia del corpo calloso, colpocephaly, ipoplasia cerebellare e la polimicrogiria associata a epilessia, atassia e danno conoscitivo, abbiamo identifica.......

Discussione

MCDs sono importanti cause di disabilità intellettiva e account per 20-40% di epilessia resistente alla droga infanzia^1,2. Interesse in MCDs sono aumentato drammaticamente durante la decade passata a causa di due fattori principali. Il primo è il miglioramento nel cervello (in particolare RMN), che consente a medici e scienziati di visualizzare molte malformazioni cerebrali che precedentemente non sono state riconosciute. L'altro è l'evoluzione di strumenti genet.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Picospritzer III	Parker Hannifin Corp	P/N 051-0500-900	Sistemi di dispensazione per microiniezione intracellulare
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	Fast green consente il monitoraggio visivo dell'iniezione
BTX ECM 830 elettroporatore	BTX Harvard Apparatus	45-0002	L'ECM 830 è un generatore di impulsi a onda quadra progettato per applicazioni
in vitro e in vivoMicrotomo HM 650 V	Microm	10076838	Microtomo HM 650 V vibratomo 240V 50/60Hz con lama vibrante
FluoView 300	Olympus		L'Olympus FluoViewTM 300 è un microscopio a scansione laser confocale a scansione puntiforme, rilevamento puntiforme, progettato per applicazioni di ricerca biologica
Software eCELLence	Glance Vision Technologies		eCELLence è un software progettato per l'analisi quantitativa della migrazione cellulare
Agilent Microarray Scanner Bundle			Vetrini
per 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K o 8 x 15K	Agilent	Agilent p/n G4900DA, G2565CA o G2565BA
per 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K o 8 x 60K	Agilent	Agilent p/n G4900DA o G2565CA
di ibridazione, inox	Agilent	Agilent p/n G2534A	Camera per l'ibridazione
dell'array CGHGuarnizioni per camera di ibridazione,			array CGH
per microarray in confezione da 1 o	Agilent	Agilent p/n G2534-60003
per microarray in confezione da 2	Agilent	Agilent p/n G2534-60002
per microarray in confezione da 4	Agilent	Agilent p/n G2534-60011
per microarray in confezione da 8	Agilent	Agilent cod. G2534-60014
Forno di ibridazione	Agilent	Agilent p/n G2545A
Rotatore del forno di ibridazione per Camere di ibridazione Agilent Microarray	Agilent	Agilent p/n G2530-60029
Termociclatore con coperchio riscaldato	Agilent	Agilent p/n G8800A o equivalente	Termociclatore per incubazioni
1,5 mL Provetta Microfuge senza RNasi	Ambion	p/n AM12400 o equivalente	Microcentrifuga
Barra di agitazione magnetica	Corning	p/n 401435 o equivalente	Strumento per agitare
Qubit Fluorimetro	Life Technologies	p/n Q32857	Strumento per la quantificazione del DNA
Kit di analisi Qubit dsDNA BR, da utilizzare con il fluorimetro Qubit	Invitrogen	p/n Q32850	Kit per fluorimetro Qubit
UV-VIS spettrofotometro	Thermo Scientific	NanoDrop 8000 o 2000, o equivalente	Strumento per la quantificazione del DNA
Pipette P10, P20, P200 e P1000	Pipetman o dispensazione di DNA equivalente
Concentratore sottovuoto	Thermo Scientific	p/n DNA120-115 o equivalente	Strumento per concentrare il DNA
SureTag Kit completo di marcatura del DNA	Agilent	p/n Kit di marcatura del DNA 5190-4240	(per campioni umani)
Colonne di purificazione (50 unità)	Agilent	p/n 5190-3391	(per campioni umani)
AutoScreen A, piastre a 96 pozzetti	GE Healthcare	p/n 25-9005-98	Kit di etichettatura del DNA (per campioni umani)
Kit di pulizia GenElute PCR	Sigma-Aldrich	p/n NA1020	(per campioni umani)
Genomica umana DNA		p/n G1521	Kit di etichettatura del DNA (per campioni umani)
Per microarray CGH:	Promega	(femmina) o p/n G1471 (maschio)	Array CGH control DNA
Per microarray CGH+SNP:	Coriell	p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878 o NA18579	Array CGH control DNA
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit o	Agilent	p/n 5188-5226	Array CGH ibridazione e lavaggio
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 e	Agilent	p/n 5188-5221	Array CGH ibridazione e lavaggio
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2	Agilent	p/n 5188-5222	Array CGH ibridazione e lavaggio
Soluzione di stabilizzazione e asciugatura	Agilent	p/n 5185-5979	Array CGH ibridazione e lavaggio
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit	Agilent	cod. 5188-5220 (25) o cod. 5188-5380 (100)	Ibridazione e lavaggio Array CGH
Cot-1 DNA	Agilent	p/n 5190-3393	Ibridazione e lavaggio Array CGH
Scanner Agilent C	Scanner Agilent		per vetrini array CGH
Kit di reagenti			per l'arricchimento del target
Piattaforma HiSeq (HSQ), 16 campioni	Agilent	p/n G9621A
Piattaforma HiSeq (HSQ), 96 Campioni	Agilent	p/n G9621B
Piattaforma HiSeq (HSQ), 480 Campioni	Agilent	p/n G9621C
Piattaforma MiSeq (MSQ), 16 Campioni	Agilent	p/n G9622A
Piattaforma MiSeq (MSQ), 96 Campioni	Agilent	p/n G9622B
Piattaforma MiSeq (MSQ), 480 Campioni	Agilent	p/n G9622C
Kit DNA 1000	Agilent	p/n 5067-1504	Kit per la separazione, il dimensionamento e la quantificazione di frammenti di dsDNA da 25 a 1000 bp.
Kit DNA ad alta sensibilità	Agilent	p/n 5067-4626	Kit per l'analisi di DNA frammentato o librerie di DNA.
Kit AMPure XP Kit			per la purificazione automatizzata della PCR.
5 mL	Agencourt	p/n A63880
60 mL	Agencourt	p/n A63881
450 mL	Agencourt	p/n A63882
Dynabeads MyOne Streptavidin T1			Isolamento e manipolazione di acidi nucleici biotinilati
2 mL	Life Technologies	Cat #65601
10 mL	Life Technologies	Cat #65602
Kit di analisi Quant-iT dsDNA BR, per il fluorimetro			Quantificazione del DNA
100 saggi, 2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32850
500 saggi, 2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32853
Qubit	Life Technologies	p/n Q32856	Quantificazione del DNA
Librerie di acquisizione SureSelec tXT2	Agilent	a seconda dell'esperimento	Kit per l'acquisizione delle librerie
SureCycler 8800 Thermal Cycler	Agilent	p/n G8800A
Modulo piastra a 96 pozzetti per SureCycler 8800 Thermal Cycler	Agilent	p/n G8810A	Amplificazione del DNA
Piastre a 96 pozzetti compatibili con SureCycler 8800	Agilent	p/n 410088	Amplificazione del DNA
Striscia ottica tappi	Agilent	p/n	401425 Amplificazione del DNA
Strisce di tappi per tubi, bombati	Agilent	p/n 410096	Amplificazione del DNA
Tappetini di compressione	Agilent	p/n 410187	Amplificazione del DNA
2100 Bioanalyzer Laptop Bundle	Agilent	p/n G2943CA	Amplificazione del DNA
2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set	Agilent	p/n G2947CA	Amplificazione del DNA
Sistema di preparazione dei campioni Covaris, serie E o serie S	DNA	Covaris
Portacampioni		Covaris p/n 520078	Taglio del DNA
Miscelatore a piastre Nutator	BD Diagnostics	p/n 421105 o equivalente	Miscelatore a piastre
GaIIx	Illumina		sequenziatore di nuova generazione

Camera guarnizione in confezione da 5 per o o Kit di etichettatura del DNA Human SureSelect XT2 Qubit Provette per saggi Taglio del