Introduction
由于越来越多地使用黄金数的应用，如电子，催化剂，生物传感器，或医疗器械，这种贵金属的需求增长在过去几年的时间内6-9。黄金以及许多其他的贵金属和重金属释放到环境中，通过工业废水稀的浓度，通过采矿活动，以及废物处理7,8,10，虽然大多数环境的污染较重或贵金属是一个持续的过程主要是由于科技活动。这导致自然生态系统的一个显著干扰并且可能潜在地威胁人类健康9。了解这些负面结果促进寻求新的技术来去除污染的生态系统和改善金属的工业废水回收金属。像沉淀或离子交换行之有效的物理 - 化学方法不是那么有效，尤其是在高LY稀释溶液7,8,11。生物吸附，无论是与活的或死的生物质，是污水处理10,12有吸引力的选择。使用这样的生物材料可以减少有毒化学品的消耗量。许多微生物已经描述累积或固定金属。例如，Lysinibacillus球形的细胞（L.球形 ）JG-A12显示高结合能力的贵金属，例如，钯（Ⅱ），铂（II），金（III）和其他有毒金属如铅（II）的或U（Ⅵ）4,13， 巨大芽孢杆菌的为铬（VI）14细胞， 酿酒酵母的铂（II）和Pd（II）的15，和小球藻俗为金细胞（Ⅲ）和U（Ⅵ）16 17。以前金属如金的结合（Ⅲ），钯（Ⅱ），和Pt（II）中也已报道了脱硫脱硫弧菌 18和L.球形 JG-B53 19,20。然而，没有人升微生物结合大量的金属及其应用为吸附材料有限12,21。此外，金属结合能力取决于不同的参数，例如，细胞组合物中，所用的生物成分或环境和实验条件（pH，离子强度，温度等）。分离的细胞壁片段22,23的研究，如膜脂质，肽聚糖，蛋白质，或其它部件，有助于理解该金属结合复合构成的全细胞8,21的处理。
该电池组件在这项研究集中于有S层蛋白。 S-层蛋白是许多细菌和古细菌的外细胞膜的部分，它们构成约15 - 20％的这些微生物的总蛋白质量的。作为第一接口的环境中，这些细胞的化合物强烈地影响细菌吸着性质3。 S-层蛋白分子量范围从40到几百kDa的的是在细胞内产生的，但外被组装在那里他们能够形成层上的脂膜或聚合细胞壁成分。一旦分离，几乎所有的S-层蛋白质具有的固有属性自发自组装在悬浮液中，在界面处，或在表面上形成的平面的或管状结构3。蛋白质单层的厚度取决于细菌，是一个范围为5内- 25纳米24。在一般情况下，所形成的S-层蛋白结构可具有一倾斜（P1或P2），正方形（P4），或六边形（P3或P6）对称性为2.5晶格常数至35nm 3,24。晶格的形成似乎是在许多情况下，依赖于二价阳离子和主要对Ca 2+ 25,26，拉夫，J。等。 S层基纳米复合材料为在基于蛋白质的工程化纳米结构的工业应用。 （编辑蒂亚娜Z.树丛和Aitziber L. Cortajarena）（施普林格，2016（提交））。尽管如此，完整的反应级联，尤其是二价阳离子如Ca 2+和Mg 2+单体折叠，单体-单体相互作用，晶格的形成，和不同的金属的作用，仍然没有完全了解。
革兰氏阳性菌株L.球形 JG-B53 27（从后新的进化分类球形芽孢杆菌改名），从铀矿开采废料堆“哈伯兰”（约汉格奥尔根斯塔特，萨克森，德国）4,28,29隔离。其功能S-层蛋白（SLP1）具有一个正方形晶格，116 kDa的30的分子量，并在活细菌细胞31的厚度≈10纳米。在以往的研究中， 在体外形成一个封闭的和稳定的蛋白质层的厚度为约10nm，在不到10分钟19达到了。相关应变L.球形 JG-A12，还从“哈伯兰”桩一个分离物，具有高的金属结合能力和其分离的S层蛋白已经显示出对等贵金属的Au具有高的化学和机械稳定性和良好的吸附速率（Ⅲ），铂（II），和Pd（II）的4,32,33。这种贵金属的结合是或多或少特异于一些金属和取决于官能团的聚合物的外和内表面蛋白，并在其孔中，离子强度的可用性，和pH值。由蛋白质有关的官能团为金属相互作用是COOH-，NH 2 - ，OH - ，PO 4 - ，SO 4 - ， - SO-和。原则上，金属结合的能力打开了广泛的应用， 拉夫，J。等光谱 。 S层基纳米复合材料为在基于蛋白质的工程化纳米结构的工业应用。 （编辑蒂亚娜Z.树丛和Aitziber L. Cortajarena）（施普林格2016（提交））。 例如，作为用于去除或回收biosorptive组件溶解有毒或有价金属，合成或定期结构的金属纳米颗粒（纳米颗粒）的催化，以及其他生物工程材料，如生物传感层3,5,18,33的定义沉积模板。规则排列的NP阵列状的Au（0）-nps可用于主要应用范围从分子电子学和生物传感器，超高密度存储设备，和催化剂对CO氧化34-37。这样的应用程序以及这些材料的智能设计的发展，就必须的基本金属绑定机制有了更深的了解。
一个先决条件，例如生物基材料的发展是可靠的实施的生物分子和技术表面38,39之间的界面层的。例如，聚电解质组装有层-层（层层）技术40,41已被用作用于S层蛋白39的重结晶的界面层19,42，拉夫，J。等人的相互作用的语句。 S层基纳米复合材料为在基于蛋白质的工程化纳米结构的工业应用。 （编辑蒂亚娜Z.树丛和Aitziber L. Cortajarena）（施普林格，2016年（提交））。然而，蛋白质的吸附和蛋白质表面相互作用的复杂的机制尚未完全了解。特别是在构象，图案方向和涂层密度信息仍下落不明。
石英晶体微量天平耗散监测（QCM-D）的技术已引起关注，在近年来作为用于研究蛋白质的吸附，涂层动力学的工具，和相互作用的亲正如事实上纳米尺度19,43-45。此技术允许质量吸附在实时的详细检测，并且可以作为对蛋白质晶格19,20,42,46-48蛋白自组装过程和功能分子偶合的一个指标。另外，QCM-D测量开来研究金属的互动过程与天然生物条件下，蛋白质层的可能性。在最近的研究中，在S-层蛋白质的与选定的金属，如铕的相互作用（Ⅲ），金（Ⅲ），钯（Ⅱ），和Pt（II）中已研究了的QCM-D 19,20。吸附的蛋白质层可以作为革兰氏阳性细菌的细胞壁的简化模型。这种单一组分的研究有助于金属的相互作用有更深的了解。然而，仅仅QCM-D实验不允许有关表面结构和金属蛋白的影响报表。其它技术是必需的，以获得这样的信息。一个POS上的结构特性sibility用于成像的生物纳米结构和获取信息是原子力显微镜（AFM）。
所呈现的研究的目的是调查的金（Au（III）和Au（0）-nps）到S层蛋白质的吸附，在L的特定SLP1 球形 JG-B53。 5.0使用ICP-MS和使用QCM-D固定的S-层 - 悬浮的蛋白质上一批规模2.0的pH范围内进行了实验。此外，关于晶格稳定性金属盐溶液的影响进行了研究与随后AFM研究中。这些技术的组合，有助于更好地理解在体外金属的相互作用过程中为更多地了解关于结合特定金属的亲和力对整个细菌细胞活动的工具。这些知识不仅是适用的过滤材料的发展为金属环保的回收和再保护的关键源49，同时也为高度有序的金属纳米颗粒关于各种技术应用的阵列的发展。
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Protocol
1.微生物和培养条件
注：所有实验均在无菌条件下完成的L。球形 JG-B53是从低温保存的文化29,30获得。
- 转印低温保存的净化台下培养（1.5毫升）至300毫升无菌营养肉汤（NB）媒体（3克/升肉提取物，5克/升胨，10克/升NaCl）中。之后搅拌在30℃的溶液进行至少6小时，以获得预培养种植。
- 培育在NB培养基需氧条件下的细菌在pH = 7.0，30℃下，在70μL的缩放蒸汽就地生物反应器。因此，填充在反应器与≈57大号去离子水。直接在生物反应器中加入溶解固体NB介质（浓度见上文）。
- 此外消泡剂（30微升/ L NB - 介质）添加至媒体以抑制培养中泡沫的形成，然后高压灭菌（122℃，温度保持时间为30分钟）的媒体内的反应器设施。
- 降温介质，并执行完整的血氧饱和度。将pH调节至7.0（用1 MH 2 SO 4和2M的NaOH），并开始自动接种300 ml的预培养。开始栽培参数的数据记录在接种点。登录的培养内在线参数如溶解氧水平（DO 2），酸和碱加成，和pH值。
- 由非侵入性浊度测量监视联机的细菌生长。
- 每隔一小时培养后执行附加抽样，并确定进一步的参数，如生物干重（BDW）和脱机光密度（OD）。因此，收集20毫升培养液中，在无菌条件下，每个采样点。
- 确定离线外径由吸附在600nm的光度测量。使用无菌过滤NB介质为空值。前前后后呃到达吸附> 0.4稀细胞悬液以下朗伯 - 比尔定律的线性度。
- 测定BDW离心机1到5ml细菌悬浮液（取决于细胞密度）在5000×g离心5分钟，室温。干燥所得到的细胞沉淀在105℃下在加热炉中达到的质量稳定性，并测量粒料的质量。
- 取显微图像与光学相差显微镜研究在400和1000倍放大（分别相差冷凝器2和3），用于检查细菌生长和作为交叉污染控制。
- 达到由在线检测到的指数生长期后做2 和在线浊度，收获的生物质由流过离心以15,000×g离心，4℃，并用标准缓冲液（50mM TRIS洗生物量的两倍，10毫氯化镁 ，3毫NaN 3的，pH值= 7.5）。
注意：得到的生物质颗粒可以储存在-18＆＃176; C，直到进一步的使用隔离。
2，S层蛋白分离纯化
注意：根据一个适于方法如先前所描述2,19,30,32,50,51纯化SLP1聚合物。
- 均化从种植在标准缓冲液中得到的洗涤和解冻粗生物质（1：1（重量/体积）），以通过使用在冰浴中冷却，在4℃的分散器（第3级，10分钟）除去鞭毛。
- 离心悬浮液（8000×g离心，4℃，20分钟），并用标准缓冲液洗得到的颗粒两次（1：1（重量/体积））。洗涤和离心（8000×g离心，4℃，20分钟）后，悬浮在标准缓冲液将沉淀（1：1（重量/体积））中，添加DNA酶II和RNA酶（0.4单位/ g的生物量），以悬浮液和崩解将细胞在1000巴用高压均化器。之后离心悬浮液以27500×g离心，4℃1小时。
注意：控制细胞悬液的研究MIcroscope。 3完整细胞是在400倍放大显微镜的视野可见 - 当小于2破裂完成。 - 与标准的缓冲液洗两次沉淀（1：1（重量/体积）），并再次执行离心。随后重悬在标准缓冲液将沉淀（2：1（重量/体积）），用1％的Triton X-100混合并孵育，使能根据连续振荡（100转）20分钟，以溶解脂质沉积物。
- 离心溶液（27500×g离心，4℃1小时），并用标准缓冲液洗涤得到的颗粒三次（1：1（重量/体积））。
- 孵育6小时在标准缓冲液后附加离心分离（27500×g离心，4℃1小时）中得到的沉淀物（1：1（重量/体积）），与0.2克/升溶菌酶，混合以水解肽聚糖在50联系。另外添加脱氧核糖核酸酶II和RNA酶（各0.4单位/ g的生物量），以悬浮液中。
- 离心分离（45500×g离心，4℃，1小时）后，重悬在上白蛋白相用叔的低体积他离心上清液（<30毫升）含蛋白质亚基。
- 1用6M盐酸胍（6M盐酸胍，50mM的TRIS，pH值= 7.2）：通过混合1溶解白色悬浮液。该解决方案变得明亮。
- 执行盐酸胍处理溶液后的一个附加高速离心（45500×g离心，4℃，1小时）的无菌过滤（0.2微米）。
- 将上清液转移到渗析膜管（截留分子量50000道尔顿）和透析它针对重结晶缓冲液（1.5mM的TRIS，10mM的氯化钙 ，pH值= 8.0）48小时。
- 转移在45500×g离心，4℃1小时的白再结晶蛋白聚合物溶液进入管和离心机。重悬沉淀在超纯水中（<30毫升）的小体积。
- 之后，转移到悬浮液透析膜管，并执行对超纯水透析24小时以除去缓冲内容。
注：缓冲区或超纯水ð几个变化uring透析是不可缺少的。 - 冻干纯化的SLP1在冷冻干燥机。
3.表征SLP1的和定量的实验
注意：SLP1浓度为吸附和涂层实验由紫外 - 可见分光光度法定量。
- 吸取2微升溶解SLP1样品直接在光度计下测量基座。确定蛋白质浓度在吸附最大值在280纳米的波长，特性的蛋白质。使用0.61的消光系数来确定SLP1浓度。使用的参考测量SLP1免费的解决方案。
- 稀释蛋白质用缓冲液（用于吸附实验在分批模式下使用0.9％的氯化钠，pH值= 6.0和QCM-D的实验使用重结晶缓冲液，pH = 8.0），以期望的浓度进行实验（1克/升和0.2克/升分别）。
- 由标准bioanal分析SLP1质量和分子量ytical方法十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）用的Laemmli，英国52所述。
- 金（0）用10％的聚丙烯酰胺凝胶分离后-NP培养使用SLP1内实验和如之前进行SDS-PAGE。
- 进行SDS-样品混合≈10微升样品缓冲液的培养或蛋白质样品（1.97克的TRIS，5毫克溴酚蓝，5.8 ml的甘油，1克SDS，2.5 ml的β巯基乙醇，填充用超纯水至50毫升）的1（体积/体积）和吸取的混合物经过4分钟温育在95℃到凝胶袋：1的比。
- 运行SDS-PAGE 30分钟，在60 V的电压，直到试品通过收集凝胶，并改变电压120伏，一旦通过了分离胶。
- 从凝胶系统中移除凝胶，冲洗用超纯水和地点1小时到固定溶液（10％酸性酸，50％无水乙醇）。随后，漂洗用超纯水的凝胶。
- 染色凝胶通过使用一个适应不确定的胶体考马斯亮蓝法53,54。脱色72,73后，根据制造商的协议采取的SDS-PAGE的图像被凝胶文档系统。
在批处理模式和金属量化4.吸附试验
- 对于分批吸附实验准备从氯金酸4金（Ⅲ）原液∙3 H 2 O的，稀的金属盐和与SLP1 / NaCl溶液至1mM的初始金属浓度为1g / L和最终SLP1浓度混合它。请在三胞胎实验没有SLP1一个额外的阴性对照。用5毫升的吸附实验的总体积。
- 摇之间连续2.0的悬浮液在RT下在不同的预调pH值至5.0 24小时（pH调节具有低浓HCl和NaOH水溶液）。
- 吸附后，离心样品在15000×g离心，4℃，20分钟），SEPAR从上清吃SLP1。
- 将上清液转移到超滤管（截留分子量50000道尔顿）和离心此以15,000×g离心，4℃，20分钟，以除去溶解蛋白单体。
- 确定在所得滤液通过ICP-MS 19,20中的金属浓度和由SLP1干重使用结果背计算吸附的金属。测量原理，方法和所使用的ICP-MS的部件的机会，在文献55进行了描述。
- 制备样品和参考用1％的HNO 3作为基质和铑作为内标（1毫克/毫升）的ICP-MS测量。
5。合成的Au-NP和粒度测定
注意：柠檬酸盐稳定化的Au（0）-NP分别根据由Mühlpfordt，H。等先前所述适配方法合成。 （1982），得到的球形颗粒的直径为10 - 15毫微米56,57
- 准备一个稳定的25毫米氯金酸4∙3 H 2 O的股票为NP形成。
- 稀释250μl的这种储备溶液在19.75 ml的超纯水，并培育这些在61℃下连续摇动15分钟。
- 准备5毫升的第二储液（12毫鞣酸，7 mM柠檬酸钠二水合物，0.05毫K 2 CO 3），并分别孵育2次溶液在61℃下进行15分钟。
- 加下恒定搅拌该第二原液溶液之一。在61℃至少10分钟搅拌反应混合物。之后冷却该溶液，并用它来对QCM-D的实验内SLP1晶格NP涂层。
注意：将所得的Au（0）-NP均在最大吸光度为520纳米，典型地用于形成Au构成的检测（0）-nps 58特征在于用UV-VIS光谱学。可将溶液保存在4℃。 - 分析所形成的大小金（0）-NP通过光子相关光谱法（PCS），其也被称为动态光散射。
- 为判定的NP尺寸的，在层流箱转移1.5毫升合成的Au（0）-NP溶液到反应杯无尘的条件下，并将其与一个大小和ζ电位粒度仪分析。 PCS和样品制备的详细描述中给出Schurtenberger，P。等。 （1993）59和耆那，R。等。 （2015年）60。
6. QCM-D实验 - SLP1涂层的表面和Au-NP吸附到SLP1格
注意：测量是进行与QCM-D配备多达四个流动模块。所有的QCM-D进行实验以125微升/分钟在25℃的恒定流速。 SLP1涂层和金属/ NP孵育分别与≈5 MHz的基本频率上进行的 SiO 2的压电AT切石英传感器（直径7-14毫米）。漂洗步骤，并添加解决方案银行足球比赛都标在代表结果的一部分的数字。的QCM-D的实验可以被描述为一步步方式开始的清洗中使用的传感器随后SLP1重结晶和稍后的金属和金属的NP相互作用和表面改性。
- 清洗程序：
- 装备流体细胞传感器的假人。泵至少20毫升（每每个模块）的碱性液体清洁剂（2％的清洁剂在超纯水（v / v））中通过QCM-D和管体系。通过该系统之后泵送超纯水的五倍体积（各每个模块）（流量高达300微升/分钟）。根据制造商的协议执行清洁。
- 孵育（至少20分钟）中的2％SDS溶液清洗流动模块之外的 SiO 2传感器和用超纯水61,62之后冲洗传感器几次。
- 干燥，过滤补偿晶体ressed空气并将它们放置在臭氧清洁腔20分钟63,64。
- 重复清洗步骤两次，以除去所有的有机内容。
- 从传感器表面去除结合的金属用1M HNO 3冲洗该传感器。随后，执行与超纯水冲洗使用步骤。
- 传感器表面改性聚电解质：
注：表面改性既可以做内（流经过程）或流量控制模块外（层层技术）。在这些实验中，下列方式来修改表面被使用。- 用3克聚乙烯亚胺（PEI，MW 25000）和聚苯乙烯磺酸盐（PSS，分子量70000）的通过浸涂交替的PE层的使用先前在文章通过为特殊应用的系统中描述的LbL技术40,41 / L，修改所述传感器苏尔，M。等。 （2014年）19。
- 将传感器的相应PE-解决方案在深W¯¯内ELL板孵育这些在室温10分钟。
- 取传感器出PE-溶液和冲洗每浸涂步骤密集用超纯水之间的传感器。
注意：新的表面改性包括至少三个PE层终止的带正电的PEI。 - 这个外部修改后放置流量控制模块内的传感器和通过启动实验之前用超纯水漂洗平衡的传感器。
- SLP1单层重结晶：
- 在4M尿素溶解SLP1用于将聚合物成单体。
- 离心monomerized蛋白以15000×g离心，4℃1小时，以除去大附聚物蛋白质。
- 混合溶解并离心SLP1上清液用重结晶缓冲液的最终蛋白质0.2克/升的浓度。
注意：根据SLP1（自组装）的再结晶钙开始加入拍摄的rystallization缓冲区。因此，泵为125μl/ min的立即的流速传感器（放置在流模块内）的混合溶液中。再结晶是QCM-D实验中检测到的频率和功耗的变化稳定值后进行。 - 在流模块内部在PE改性的传感器的顶成功蛋白重结晶后冲洗用重结晶缓冲或超纯waterintensively 125微升/分钟的流速，直到次数耗散移稳定值涂覆的传感器进行检测。
注：SiO 2的表面改性用PE购买吸附实验上SLP1单层和AFM研究可视化在图1中。
图1. PE表面改性SLP1单层的方案设计涂料;该图已被修改从苏尔，M。等。 （2015年）19与施普林格许可。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 金属和金属NP互动：
注意：用金金属盐溶液的吸附（氯金酸4∙3 H 2 O），进行在1毫米或5毫米，在pH = 6.0中的0.9％NaCl溶液的浓度。的Au-NP吸附用未稀释的Au纳米粒在pH≈5.0做在1.6毫三钠 - 柠檬酸缓冲。- 成功SLP1涂料在流模块后，冲洗所得的SLP1层集中地用0.9％NaCl溶液，直到检测到的频率和耗散移稳定值。
- 泵所制备的金属溶液（1毫摩尔）和NP溶液至流动模块以125微升/分钟的流速和跟踪质量吸附到SLP1层。质量吸附可以直接通过跟踪频率偏移参照索尔布雷公式 （公式1）来检测。
- 在完成金属和金属NP互动后，用清水冲洗金属/ NP自由缓冲层，除去弱结合或弱附着金属或纳米粒子。
注意：实验装置的示意图示于图2。
图2.使用流量模块QFM 401 * 66 QCM-D设置方案设计 。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 数据记录和评价 ：
- 记录频率的偏移，单位为Hz（ΔFn）和耗散（ΔDñ）通过使用QCM-D特定软件的QCM-D的实验中。
- 用于吸附的质量灵敏度（ΔM）的索尔布雷等式/模型（ 等式1）65 66，其有效期为薄且刚性薄膜耦合无摩擦于施加到第 n个泛音传感器表面的评价。术语C（绍尔布赖常数）的使用5MHz的AT切割石英传感器是17.7纳克∙赫兹-1∙厘米-2 68。对于刚性，均匀分布，和足够薄吸附层使用公式1作为一个很好的近似。
- 根据开尔文-沃伊特模型中有效黏弹性分子68-71制造商特定的软件执行其他建模，并与该绍尔布赖模型的比较结果。
- 对于层厚度的计算和大规模吸收利用作为重要的建模参数的1.35的吸附层的层密度克∙cm -3的对应于先前针对S-层蛋白72-75所述的值。使用相同的值的金属相互作用的与蛋白质层的计算。
7. AFM测量
- 在一个倒置的光学显微镜进行与完全能够AFM研究。
- 使用直接在涂覆的QCM-D传感器的再结晶缓冲液或超纯水的液体中的记录AFM图像。
- QCM-D实验后冲洗用超纯水的传感器，并把它们的原子力显微镜中细胞内。因此，使用一个封闭的流体细胞以约1.5毫升的总体积。保持流体细胞的温度恒定在30℃。
- 使用悬臂用的≈25千赫在水中的共振频率和<0.1牛顿/米的硬度。调节在2.5和10微米/秒的扫描速度。
注意：高图像示用z-规模而z值表示的表面的精确地形。振幅（伪3D）图像显示无Z-规模，因为幅度z值取决于扫描参数，并承担有限的信息。做用三种不同的评价软件77的图像分析。
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Representative Results
培养微生物和SLP1表征
细菌生长的记录的数据表示在指数生长期的末尾在约5小时。以前的研究表明，SLP1可以从此点收获（4.36克/升湿生物量（≈1.45克/升（BDW））与最大收率19中分离出来。然而，培养通过使用定义的媒体组件或优化补料分批培养策略将导致更高的生物量产率，这是不可剥夺了使用高含量的生物量的工业应用。 从在线和值脱机记录栽培参数总结于图3A中。微观控制（图3B）在时刻的L.球形 JG-B53的收割显示非孢子细胞。
图3：（A） 的在线和离线测量培养L.参数球形 JG-B53和（B）的微观L的重要细菌细胞的图像球形 JG-B53在收获在400倍放大的时间;该图已被修改从苏尔，M。等。 （2014年）19与施普林格许可。 请点击此处查看该图的放大版本。
另外，可追加取得的SDS-PAGE蛋白质谱（图4A）表示的SLP1以5小时培养的最大时间量。对应于SLP1蛋白条带（≈150 kDa）的是厚，但是从这里对强度的损失，观察accompan通过增加所造成的可能的蛋白质碎片或其他蛋白质的偏析低分子量的蛋白质组卷。由上述（ 图4B）中提到的方法获得的分离并纯化的蛋白质的条带对应于约150 kDa的，这比基于SLP1（116 kDa）的30的测序数据所计算的重量较重的分子量。这很可能是由于翻译后修饰。其他原因在SDS凝胶中的理论分子量和所观察到的分子质量之间的失配被可能依赖人工制品在SDS凝胶30充电。
制通过SDS-PAGE（A）的图4.蛋白质概况崩解从培养样品和（B）的成功分离后纯化SLP1获得细菌细胞;该FI古尔已经被修改苏尔，M。等。 （2014年）19与施普林格许可。 请点击此处查看该图的放大版本。
批量吸附实验和中金与ICP-MS
最大金属结合能力的Au（III）中由悬浮SLP1（q个最大）示于图5中 。结果表明，金（Ⅲ）中的稳定所研究的pH范围内的24小时温育过程中约束SLP1。结果表明在大约80的范围内为 Q MAX - 100毫克金（Ⅲ）/克SLP1。的汇总值（见表1）具有大约75毫克的Au的吸附能力（Ⅲ）/克SLP1先前报道苏尔，M。等人进行了比较。 （2014）从实验与自调整得到的pH值通过加入金属盐溶液（pH≈4.3）19。总之，SLP1已经显示出结合大量的初始加入金（三）证明了其高结合能力，此元素的能力。
使用所报告的苏尔，M。等人的自调pH值（≈4.3） 图5.图的最大金属的 pH调节的实验内容量金（Ⅲ）的（Q 最大 ） 绑定到 SLP1聚合物相比吸附的结果。 （2014）19。 请点击此处查看该图的放大版本。
计算出的金属去除效率（RE）所研究的pH范围内为50％ - 60％从而证实了重由苏尔，M。等制成sults。 （2014），其中分别达到了40％左右的值。在以前所作的实验中，金（Ⅲ）的有官能团如 carboxylic-，羟基和氨基强相互作用，已观察到对S层蛋白质如SLP1和用于比较蛋白L的 SLFB 球形 JG-A12 1.78。扬科夫斯基，U.等。 （2010）检测到的光谱的Au（Ⅲ）的一个强烈的相互作用主要与SLFB羧酸基团也可以推导出L的 SLP1 球形 JG-B53 20,79,80。而且，内在蛋白性质，将减少金（Ⅲ），以金（0）在不存在还原剂的可能是一个原因强相互作用79。此外，本研究的结果显示的SLP1在较低的pH值的优选的结合的倾向。另一方面，一个结合在较低pH值也有可能导致SLP1的变性。研究的SLP1证明了一个蛋白质的稳定性下降至pH =3.0（未公布结果）。从在酸性条件下解吸试验，使用例如，硝酸或使用诸如EDTA或柠檬酸盐（未示出数据）络合剂，验证金稳定地约束，并不能从SLP1聚合物释放。
| 金（三）对L.球形JG-B53的SLP1 | ||||||||
| C初始（毫克/升） | 196.97 | |||||||
| pH值 | 五 | 4.5 | ≈4.3 23 | 4 | 3.5 | 3 | 2.5 | 2 |
| 值 | ||||||||
| 为 Q MAX | 88.3 | 85.3 | 74.7 | 102.5 | 94.1 | 81 | 101.9 | 96.9 |
| （毫克金（Ⅲ）/克SLP1） | ||||||||
| 回覆 | 47.1 | 47.8 | 37.9 | 57.1 | 54.1 | 44.8 | 58.7 | 56.5 |
| （％） | ||||||||
表1：最大金属结合能力（Q max）和 中批量吸附实验金属切削效率（RE）与金（Ⅲ）和SLP1聚合物溶液中通过ICP-MS分析 。相比以前发表的结果从苏尔，M。等人的数据。 （2014）19。
SLP1单层通过重结晶QCM-D跟踪
在频率立即下降（ΔF5，ΔF7，ΔF9，ΔF11）表示快速吸附和蛋白质至PE改性表面（图6A）的高亲和力。等于快速变化的频率，耗散（ΔD5，ΔD7，ΔD9，ΔD11）也随即增加。这一事实表明粘弹分子由于快速阻尼到表面导致增加耗散值的吸附。最高频率偏移5分钟后用≈95赫兹和4.2ΔD的值来实现的。在后一阶段只发生重排结晶SLP1的。 SLP1吸附正是如此进行了超过60分钟，确保牛逼他形成一个几乎完全覆盖面，并定期有序蛋白晶格。实验表明，带正电的PE层是不可剥夺实现稳定涂料，负的结局改性导致弱吸附和更长的涂层动力学（数据未示出）38。较弱地附着蛋白和通过用SLP1无重结晶缓冲漂洗除去附聚物。 ΔF的微小变化ñ证实低蛋白吸附和SLP1稳定的吸附。尽管这样的消散下降到≈2.8表示更大的弹性分子被除去。
图改性二氧化硅 传感器由QCM-D分析 6.再结晶SLP1的 ; （一）ΔF/ΔD情节和（B）面层厚度PROFILË;该图已被修改从苏尔，M。等。 （2014）19与施普林格和苏尔，M.许可（2015）20。 请点击此处查看该图的放大版本。
通过使用以前提到的模型计算出的表面轮廓显示≈11.2纳米的SLP1单层厚度（开尔文-沃伊特模型弹性膜）的10.0纳米（索尔布雷模型刚性层）（图6B）和这些值比低报告的苏尔，M。等。 （2014年）。的差异可以通过蛋白质层密度的建模内的不同使用值进行说明。电流值应该更接近于S层蛋白的层厚度的现实L上的活细胞的细胞表面球形 JG-B53 31,42-。这种建模表明，索尔布雷关系我是因为在粘弹性液体薄膜81,82，其导致被吸附的SLP1质量和厚度的低估剪切弹性波的传播的不适当的声学薄蛋白质层，。这可以通过S层蛋白质的弹性性能和其在吸附过程中的水分子的耦合进行说明。水与蛋白质的相互作用可容易地通过形成水合壳，粘性阻力或截留在空腔中的吸附层83所描述。这影响由开尔文 - 沃伊特模型测定的更高的层的厚度和也可以澄清在由两个不同的模型中得到的层厚度的差异。在以往的AFM研究中，层的厚度约为8-12毫微米SLP1晶格的进行测定。通过计算质吸附SLP1的，而不是层厚度，1506.6纳克∙厘米-2（开尔文-沃伊特模型）总ΔM计算。在冲浪群众吸附的数据尖子都总结在表2中，并显示出高质量的吸附通过开尔文-沃伊特模型的价值。
| m以下 | ΔM 最大 | 厚度 | 厚度 | |
| （毫微克/厘米2） | （毫微克/厘米2） | （NM） | （NM） | |
| （开尔文-沃伊特） | （绍尔布赖） | （开尔文-沃伊特） | （绍尔布赖） | |
| 涂层和冲洗后SLP1 | 1,505.6 | 1,351.6 | 11.2 | 10 |
表2：SLP1的改性聚电解质的 SiO 2 晶体的重结晶缓冲液冲洗后分析由QCM-D 吸附质谱（pH 值= 8.0）和计算层厚度。
QCM-D作为工具用于检测金属和金属NP互动与蛋白质类SLP1单层
重结晶SLP1单层用1mM和5mM溶解金（Ⅲ）的相互作用进行了调查。从计算的变化频率和耗散的所记录的数据的和建模得到的总吸附质量的结果总结于表3。金（Ⅲ）相互作用的QCM-D研究与单层提供金属-生物分子的更深入的了解相互作用。首次，结合能力，吸附动力学，以及如何元升影响蛋白质稳定性进行了研究纳米范围。在加入金属盐溶液的SLP1单层的前5分钟内的频率降低表示快质量吸附。然而，Au中吸附未在60分钟后如在以前的研究中19描述的其它金属如钯（Ⅱ）完成。发生多达18小时的质量增加。在此时间后，进行用金属自由缓冲器表明被吸附的金属几乎稳定地结合到重结晶SLP1层漂洗步骤。最后，在情况下，1毫金（Ⅲ）溶液和4,534.4±5.5纳克∙厘米-2（开尔文-福格特模型）中得到的955.0±2.7纳克∙厘米-2（开尔文-福格特模型）共金属吸收情况下为5mM金（Ⅲ）。由5mM的金（Ⅲ）溶液中获得的更高的值可以通过SLP1的其中最小的金属金（0）-NP从该溶液中形成的固有还原性进行说明。这些减少正确SLP1的关系已被报道已在以往的研究为钯（II）和金（Ⅲ）32,33,79,84。数据还表明，随着金溶液的相互作用不会导致该蛋白质层的不稳定。这表明金（Ⅲ）SLP1，这已被证实也通过使用蛋白质聚合物的ICP-MS测量的特定且稳定的结合。
的金（0）-NP合成期间形成可以通过从起始的黄色溶液于微红一种颜色变化可视化。这种颜色的变化是由金属纳米粒子的表面等离子体振荡的激励引起的，证明形成的Au（0）-nps 1,78。此外较小纳米颗粒可通过还原剂的浓度（较高鞣酸浓度）85中可见的溶液不同的着色和由PCS测量结果验证的变化来合成（数据未显示）。在另一方面，增加单宁酸浓度导致的NP稳定性的损失，纳米粒子易于团聚20。作为原则证明，预合成的Au（0）-nps（10大小分布- 18nm的由见于图7A PCS测量）孵育悬浮SLP1 48小时，并通过SDS-PAGE分析。 图 7B中所示的蛋白图谱验证从QCM-D个数据得出的结论，即金（0）-nps不会干扰SLP1结构。所观察到的蛋白条带，在150 kDa的证明完好SLP1的存在。
图7（A）数加权尺寸预合成金的分布（0）-nps由PCS和（B）SLP1的SDS-PAGE蛋白质谱测量;泳道1：2微克SLP1金（0）-nps 2交互和车道前：在停牌1微克SLP1聚合物后48小时incuba化预合成的Au（0）-nps。 请点击此处查看该图的放大版本。
对NP-合成和表征后，QCM-D进行实验。预先综合金属的金吸附（0）-nps示例性地示出了在ΔF/ΔD图（ 图8的 ），并作为厚度和质量型材（图8B）的QCM-D的实验。
图8.吸附预合成的Au（0）-nps到再结晶SLP1格子QCM-D（A）的ΔF/ΔD情节和（B）层的表面质量轮廓分析 。空白“>点击此处查看该图的放大版本。
可以确认该QCM-D可以被用于检测10的吸附 - 18nm的球形金（0）-nps。加入未稀释的Au-NP溶液后（甲520nm处 = 1）通过所述合成获得，频率降低，这是由索尔布雷公式 （公式1）的预测所述质量吸附的直接指标。金的吸附（0）-nps物在少于60分钟基本完成。在此时间之后沉积在SLP1晶格的顶部没有更多的纳米粒子，因此可以认为所有的反应位点或孔是由金（0）-nps占据。在散热所显示的下降可以挂靠SLP1格子事业的NP相互作用硬化。总质量吸附的值被总结在表3中，即使密集漂洗用NP-自由柠檬酸盐缓冲液导致NEI疗法以纳米颗粒的解吸，也不利于SLP1单层支队。因此，稳定的和强烈的相互作用可以预测为在同一方面在Au（0）-NP相互作用与金（Ⅲ）。
| 金属 | C金属 | ΔM 最大 | ΔM 最大 | 厚度 | 厚度 |
| （毫微克/厘米2） | （毫微克/厘米2） | （NM） | （NM） | ||
| （开尔文-沃伊特） | （绍尔布赖） | （开尔文-沃伊特） | （绍尔布赖） | ||
| 1毫米 | 955 | 932.6 | --- | --- | |
| 5毫米 | 4,534.4 | 4,687.9 | --- | --- | |
| 金（0） - | --- | 1,382.9 | 1,382.7 | 10.2 | 10.2 |
| 纳米粒子 |
表3：吸附质量上再结晶SLP1格金（III）的相互作用后（pH值= 6.0）和Au-NP吸附（pH值= 4.7）由QCM-D和Au（0）-NP涂后层厚度的计算分析 。相比以前发表的结果从苏尔，M。等人的数据。 （2014年）19。
原子力显微镜的纳米结构的鳞甲可视化
图9. AFM L. 再结晶SLP1格幅度图像 球形 JG-B53在QCM-D晶体涂层后直接到缓冲区，标志着区域放大冲洗 ;该图已被修改从苏尔，M。等。 （2014年）19与施普林格许可。 请点击此处查看该图的放大版本。
图10显示了完整的SLP1孵育金（Ⅲ）溶液后晶格。可以示出，该温育后的蛋白晶格保持完全不变。这证实从QCM-D的实验所预测的涂层的稳定性的结果。在图11A和B中的吸附的预先合成的Au（0）-nps（尺寸从10改变-由PCS测定18纳米）上的SLP1晶格被示出。由于颗粒的大小，在Au（0）-nps被吸附在SLP1毛孔，不遵循SLP1的P4 -symmetry。金（0）-nps是统计分布在蛋白晶格。通过测量颗粒大小在AFM高度图像（数据未示出）的纳米粒子的尺寸在16的范围内- 23纳米，甚至更小，即在大约10纳米19,20的范围内。此版本ifies所确定的NP尺寸先前由PCS测量（ 见图8）。
后孵化图10. AFM重结晶，完整SLP1格对QCM-D传感器晶体幅图片5毫米的Au（III）的解决方案，标志着区域的放大;该图已被修改从苏尔，M。等。 （2014）19与施普林格和苏尔，M.许可（2015）20。 请点击此处查看该图的放大版本。
图11（A）AFM幅度吸附金（0）-nps在再结晶SLP1格在QCM-D传感器晶体（左图像）和（B）的3D重建表面轮廓（右）;这个数字已经被修改苏尔，M.（2015年）20与施普林格和拉夫，J。等权限。 （2016） 拉夫，J。等。 S层基纳米复合材料为在基于蛋白质的工程化纳米结构的工业应用。 （编辑蒂亚娜Z.树丛和Aitziber L. Cortajarena）（施普林格，2016年（提交））。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在这项工作中研究了Au构成的结合S-层蛋白使用的不同的分析方法的组合进行了研究。特别是，Au构成的结合是非常有吸引力的，不仅对于Au中从采矿水域或处理溶液的回收，而且还用于材料，例如，感觉表面的结构。对于在Au相互作用的研究（金（Ⅲ）和Au（0）-nps）悬浮和重结晶SLP1的单层，该蛋白质必须被隔离。因此，本研究表明培育成功的革兰氏阳性细菌菌株L的球形 JG-B53和表面层蛋白质SLP1的隔离。尽管如此，培育和蛋白分离仍然是具有挑战性的，应该进行优化。甲大规模生产的生物量和S层的蛋白质是一个先决条件的工业应用两者， 例如，用于生产金属的选择性的过滤材料。其应用潜力是undoubtedly高的去除有毒金属的或溶于处理用水有价值金属的回收，废水，或排水。此外，本申请的潜力的S-层甚至更大考虑到它们在其他仿生材料，例如生物传感器和催化剂额外的潜力。
悬浮SLP1聚合物的分批吸附实验表明所研究的pH范围内具有高而稳定的结合金（Ⅲ），从2.0至5.0。从而，高达60％的金属去除率可以达成。这一显着的结合行为可以通过金（III）与SLP1通过本蛋白的表面上的羧基和含氮基团的相互作用可能引起强烈的相互作用来解释。此参数可以通过类似的应变L的红外光谱和EXAFS调查中得到加强球形 JG-A12 32,79。此外，SLP1内在的还原性可以解释高RE金（三）由热度CING它纳米粒的Au（0）。它可以假定S层，如细菌对环境的第一接口，应主要参与金属结合。在所研究的pH值范围内，最高的金属结合与102.5毫克金（III）的容量/ g的SLP1在pH值4.0实现。这个结合能力高于报道的其他生物组分，例如， 枯草芽孢杆菌的分离的细胞壁（71.5毫克金（Ⅲ）/克）86或用于小球藻 （98.5毫克金（Ⅲ）/克）8的生物量。
ICP-MS用于确定由SLP1聚合物结合的金属是很敏感的方法，能够实现在本研究最小量的金的检测。 ICP-MS提供了进行微量金属测定， 例如，便于处理系统和检测限低许多好处;如果金价下跌至0.1 - 1个百分点。这使得该方法的多功能工具调查低浓度范围biosorptive流程秒。然而，结果在这次调查中获得与中止的S-层聚合物和不能被容易地转移到再结晶表面上的S层晶格的，因此显示的ICP-MS的限制。例如，分离的蛋白质聚合物的没有直接关系可以作出上重要的细菌细胞的那些S层结构。此外，ICP-MS测定不允许金属吸附动力学的决心。因此，有必要寻找方法更适合于该金属由薄固定蛋白膜结合的调查。
在本研究中，QCM-D分析，用于检测原位形成S层晶格的表面上，以及Au中的蛋白质的沉积。因此，QCM-D是一种可再生的方法识别分子的吸附和互动过程。此外QCM-D是一个相对简单的，具有成本效益，以及非危险方法显示器超级UCH处理网上 。该方法的优点来检测质量变化与最大质量灵敏度在≈0.5液体纳克∙厘米-2。这使的可能性，与溶解的金属检测蛋白质甚至弱相互作用， 例如，或者测量低浓度范围内吸附。 QCM-D的缺点是，这不是一个结构成像方法，它允许如蛋白晶格的可视化。因此，需要其他技术。
该QCM-D分析在这项研究中，随后进行了原子力显微镜成像。这些方法的组合所允许的吸附动力学和Au吸附于涂层的后果的研究，从而证明它们是用于调查薄蛋白质膜的金属相互作用的多用途工具。另外，它表明，在技术支持的S层蛋白质的可靠的再结晶是用于随后的蛋白质相互作用研究是至关重要的。那里前，使用增粘剂表面的修改的兴趣。所描述的实施聚合电解质（带正电的PE的结束），为SiO 2的表面和蛋白层引线之间的中间层，以用于快速蛋白质涂层的改进的方法的。带正电荷的聚电解质层的正效应先前已描述为例如 L的重要细菌细胞的，固定化 球形 JG-B53 31。所提出的PE层的实施是对S层蛋白质的购买成功和可重复的再结晶的最重要和关键的一步。
可以证明，对于薄层SLP1的人的研究，QCM-D是一个很好的方法来显示质量吸附各自的蛋白再结晶作为实时单层膜。这也预先对S层蛋白L的 SbpA的重组被观察球形</ em>的CCM2177 47。通过使用随后的高分辨率的AFM分析蛋白自组装的晶格结构的变化可以被可视化。 AFM测量表明SLP1的p4的对称性和确认SLP 1的模型化的层厚度为约10纳米。另外，溶解的金属离子与蛋白质层直接相互作用可能是由QCM-D证明Au构成良好的结合（Ⅲ）由基础层蛋白质监视。的可能形成的最小的Au（0）-nps从内侧所造成的QCM-D测量内的SLP1晶格的固有还原性的蛋白质的孔的Au（III）的溶液不能被随后的AFM测量检测。这可能与AFM的分辨率极限和实验建立了这项研究。这表明这种技术和高分辨率成像的必要性在副纳米尺度的生物分子的限制。然而，重结晶SLP1层的稳定性高，可以从第推导Ë得到QCM-结果，并通过AFM调查确认。
最后，它能够证明，SLP1聚合物具有高的金属结合能力的研究pH范围内金。此外，调查表明，SLP1晶格是一好基质金属离子结合和金属纳米颗粒的固定化。它可以表明，本文中使用的每一种方法都有检测到小金属的相互作用，或在原子力显微镜可以可视化结构在纳米尺度范围内的可能性。虽然，这是仅通过这些所示的方法的组合，其允许改善研究蛋白质的了解和理解在分子水平上。
主要是，QCM-D和原子力显微镜是首选的蛋白质单分子层吸附未来研究以及它们与金属和功能分子相互作用的首选方法。通过这两种方法，对S层蛋白广告检测组合吸附过程和表面成像提供深入了解分子过程可能能够被转移到增强活细菌的知识和与环境的相互作用。这项研究显示，可能的方法理解蛋白质和金属相互作用乐于助人的摘录。其他有用的技术，可以提高这些过程的细节，从不同的光谱和色谱方法光谱生物分子的调查和知识应包括在未来的研究。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
目前的工作是部分由BMWI和BMBF项目“Aptasens”（BMBF / DLR 01RB0805A）资助的IGF-项目“S-筛”（490 ZBG / 1）资助。特别感谢的Tobias J.半滑舌鳎的宝贵帮助，在原子力显微镜的研究和埃里克V.斯通读取稿件为以英语为母语。此外，该论文的作者要感谢艾琳里特和萨布丽娜Gurlit（从研究所的资源生态为ICP-MS测定的援助），曼加沃格尔，南希·昂格尔，卡伦E. Viacava和亥姆霍兹研究所生物技术组佛莱堡的资源技术。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| equiment and software | |||
| Bioreactor, Steam In Place 70L Pilot System | Applikon Biotechnology, Netherlands | Z6X | Including dO2, pH sensors of Applikon Biotechnology and BioXpert software V2 |
| Noninvasive Biomass Monitor BugEye 2100 | BugLab, Concord (CA), USA | Z9X | --- |
| Spectrometer Ultrospec 1000 | Amersham Pharmacia Biotech, Great Britain | 80-2109-10 | Company now GE Healthcare Life Sciences |
| MiniStar micro centrifuge | VWR, Germany | 521-2844 | For centrifugation of cultivation samples |
| Research system microscope BX-61 | Olympus Germany LLC, Germany | 037006 | Microscope in combination with imaging software |
| Cell^P (version 3.1) | Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Münster, Germany | --- | together with microscope |
| Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-S | Carr Centritech, Florida, USA | 9010PLT | For biomasse harvesting |
| T18 basic Ultra Turrax | IKA Labortechnik, Germany | 431-2601 | For flagella removal and sample homogenization |
| Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, USA | 728411 | Used within protein isolation |
| Mobile high shear fluid processor, M-110EH-30 Pilot | Microfluidics, Massachusetts, USA | M110EH30K | Used for cell rupture |
| Alpha 1-4 LSC Freeze dryer | Martin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, Germany | 102041 | --- |
| UV-VIS spectrophotometry (NanoDrop 2000c) | Thermo Fisher Scientific, USA | 91-ND-2000C-L | For determination of protein concentration |
| Mini-PROTEAN vertical electrophoresis chamber | Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany | 165-3322 | For SDS-PAGE |
| VersaDoc Imaging System 3000 | Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany | 1708030 | Used for imaging of SDS-PAGE gels |
| ICP-MS Elan 9000 | PerkinElmer, Waltham (MA), USA | N8120536 | For determination of metal concentration |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Instruments, Worcestershire United Kingdom | ZEN3600 | For determination of nanoparticle size |
| Q-Sense E4 device | Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden | QS-E4 | ordered via LOT quantum design (software included with E4 platform) |
| Q-Soft 401 (data recording) | Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden | ||
| Q-Tools 3 (data evaluation and modelling) | Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden | ||
| QCM-D flow modules QFM 401 | Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden | QS-QFM401 | ordered via LOT quantum design |
| QSX 303 SiO2 piezoelectric AT-cut quartz sensors | Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden | QS-QSX303 | ordered via LOT quantum design |
| Ozone cleaning chamber | Bioforce Nanoscience, Ames (IA), USA | QS-ESA006 | ordered via LOT quantum design |
| Atomic Force Microscope MFP-3D Bio AFM | Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA | MFP-3DBio | AFM measurements and imaging software |
| Asylum Research AFM Software AR Version 120804+1223 | Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA | --- | imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio |
| Igor Version Pro 6.3.2.3 Software | WaveMetrics, Inc., USA | --- | imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio |
| BioHeater | Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA | Bioheater | Sample heater for AFM measurements |
| Biolever mini cantilever, BL-AC40TS-C2 | Olympus Germany LLC, Germany | BL-AC40TS-C2 | Prefered cantilever for AFM measurements |
| WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013) | Nanotec Electronica S.L. , Spain | freeware | Software for AFM analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Detergents and other equiment | |||
| acidic acid, 100 %, p.A. | CARL ROTH GmbH+CO.KG | 3738.5 | Danger, flammable and corrosive liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. |
| Antifoam 204 | Sigma-Aldrich Co. LLC. | A6426 | For foam suppression |
| bromophenol blue, sodium salt | Sigma-Aldrich Co. LLC. | B5525 | --- |
| Coomassie Brilliant Blue R (C45H44N3NaO7S2) | CARL ROTH GmbH+CO.KG | 3862.1 | --- |
| Deoxyribonuclease II from porcine spleen | Sigma-Aldrich Co. LLC. | D4138 | Typ IV , 2,000 - 6,000 Kunitz units/mg protein |
| Ethanol, 95% | VWR, Germany | 20827.467 | Danger, flammable |
| glycerine, p.A. | CARL ROTH GmbH+CO.KG | 3783.1 | --- |
| Guanidine hydrochloride (GuHCl) | CARL ROTH GmbH+CO.KG | 0037.1 | --- |
| Hellmanex III | Hellma GmbH & Co. KG | 9-307-011-4-507 | --- |
| Hydrochloric acid (HCl) (37%) | CARL ROTH GmbH+CO.KG | 4625.2 | Danger; Corrosive, used for pH adjustment |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich Co. LLC. | L6876 | Lyophilized powder, protein = 90 %, = 40,000 units/mg protein (Sigma) |
| Magnetic stirrer with heating, MR 3000K | Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Germany | 504.10100.00 | Standard stirrer within experiment |
| NB-Media DM180 | Mast Diagnostica GmbH | 121800 | --- |
| Nitric acid (HNO3) | CARL ROTH GmbH+CO.KG | HN50.1 | Danger; Oxidizing, Corrosing |
| PageRuler Unstained Protein Ladder | ThermoScientific-Pierce | 26614 | --- |
| Poly(sodium 4-styrenesulfonat) (PSS) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 243051 | Average Mw ~70,000 |
| Polyethylenimine (PEI), branched | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 408727 | Warning; Harmful, Irritant, Dangerous for the environment; average Mw ~25,000 |
| Potassium carbonate anhydrous (K2CO3) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 60108 | Warning; Harmful |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich Co. LLC. | R5503 | Type I-AS, 50 - 100 Kunitz units/mg protein |
| Sodium azide (NaN3) | Merck KGaA | 106688 | Danger; very toxic and Dangerous for the environment |
| Sodium chloride (NaCl) | CARL ROTH GmbH+CO.KG | 3957.2 | --- |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | L-5750 | Danger; toxic |
| Sodium hydroxide (NaOH) | CARL ROTH GmbH+CO.KG | 6771.1 | Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation and pH adjustment |
| Spectra/Por 6, Dialysis membrane, MWCO 50,000 | CARL ROTH GmbH+CO.KG | 1893.1 | --- |
| Sulfuric acid (H2SO4) | CARL ROTH GmbH+CO.KG | HN52.2 | Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation |
| Tannic acid (C76H52O46) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 16201 | --- |
| TRIS HCl (C4H11NO3HCl) | CARL ROTH GmbH+CO.KG | 9090.2 | --- |
| Triton X-100 | CARL ROTH GmbH+CO.KG | 3051.3 | Warning; Harmful, Dangerous for the environment |
| VIVASPIN 500, 50,000 MWCO Ultrafiltration tubes | Sartorius AG | VS0132 | --- |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich Co. LLC. | M6250 | Danger, toxic |
References
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