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Chemistry

Au-Interacción de SLP1 Polímeros y Monocapa de Published: January 19, 2016 doi: 10.3791/53572
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Helmholtz Institute Freiberg for Resource Technology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, 2Institute for Resource Ecology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf

Introduction

Debido al creciente uso del oro para diversas aplicaciones como la electrónica, catalizadores, biosensores, o instrumentos médicos, la demanda de este metal precioso ha crecido en los últimos pocos años 6-9. Oro, así como muchos otros metales preciosos y pesados ​​se liberan en el medio ambiente a través de efluentes industriales en concentraciones diluidas, a través de las actividades mineras, y la eliminación de residuos 7,8,10, aunque la mayor contaminación ambiental por metales pesados ​​o preciosos es un proceso en curso causado principalmente por las actividades tecnológicas. Esto conduce a una interferencia significativa de los ecosistemas naturales y potencialmente podría amenazar la salud humana 9. Conocer estos resultados negativos promueve la búsqueda de nuevas técnicas para eliminar los metales de los ecosistemas y las mejoras en el reciclaje de metales contaminados por las aguas residuales industriales. Métodos físico-químicos bien establecidos como precipitación o intercambio de iones no son tan eficaces, especialmente en altoly diluye soluciones 7,8,11. Biosorción, ya sea con la vida o la biomasa muerta, es una alternativa atractiva para el tratamiento de aguas residuales 10,12. El uso de tales materiales biológicos puede reducir el consumo de productos químicos tóxicos. Muchos microorganismos se han descrito para acumular o inmovilizar metales. Por ejemplo, las células de Lysinibacillus sphaericus (L. sphaericus) JG-A12 han demostrado capacidades de unión altos para los metales preciosos, por ejemplo, Pd (II), Pt (II), Au (III), y otros metales tóxicos como el Pb (II) o U (VI) 4,13, las células de Bacillus megaterium para Cr (VI) 14, las células de Saccharomyces cerevisiae para Pt (II) y Pd (II) 15, y Chlorella vulgar para Au (III) y U (VI) 16 , 17. La unión de los metales anteriores como Au (III), Pd (II) y Pt (II) también se ha informado de Desulfovibrio desulfuricans 18 y para L. sphaericus JG-B53 19,20. Sin embargo, no all microbios unen altas cantidades de metales y su aplicación como material de sorción es limitada 12,21. Además, la capacidad de unión a metal depende de diferentes parámetros, por ejemplo, la composición celular, la bio-componente utilizado, o ambientales y las condiciones experimentales (pH, fuerza iónica, temperatura, etc.). El estudio de los fragmentos de pared celular aisladas 22,23, como los lípidos de membrana, peptidoglicano, proteínas u otros componentes, ayuda a entender el metal procesos de células enteras construidas complejas 8,21 vinculante.

Los componentes de la célula se centraron en en este estudio son las proteínas de la capa S. Proteínas de la capa S son partes de la envoltura celular externa de muchas bacterias y arqueas, y que constituyen aproximadamente el 15 - 20% de la masa total de proteínas de estos organismos. A medida que la primera interfaz para el medio ambiente, estos compuestos celulares influyen fuertemente en las propiedades de sorción 3 bacterianas. Proteínas de la capa S con pesos moleculares que van desde los cuarentaa cientos de kDa se producen dentro de la célula, pero se ensamblan exterior, donde son capaces de formar capas en las membranas de lípidos o componentes de la pared celular poliméricos. Una vez aislado, casi todos los S-capa proteínas tienen la propiedad intrínseca de auto-ensamblan espontáneamente en suspensión, en las interfaces, o en superficies planas que forman o estructuras similares a tubos 3. El espesor de la monocapa de la proteína depende de la bacteria y se encuentra dentro de una gama de 5 - 25 nm 24. En general, las estructuras de las proteínas S-capa formada pueden tener un oblicua (P1 o P2), cuadrada (p4), o hexagonal (p3 o p6) simetría con constantes de red de 2,5 a 35 nm 3,24. La formación de celosía parece ser en muchos casos dependientes de cationes divalentes y principalmente en Ca 2+ 25,26, Raff, J. et al. S-capa de nanocompuestos basados ​​en aplicaciones industriales en a base de proteína Engineered Nanoestructuras. (eds Tijana Z. Grove y Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (presentado)). Sin embargo, la cascada de la reacción completa de plegado monómero, la interacción monómero-monómero, la formación de un enrejado, y el papel de diferentes metales, especialmente de cationes divalentes tales como Ca 2+ y Mg 2+, todavía no se entiende completamente.

La cepa grampositivos L. sphaericus JG-B53 (renombrado de Bacillus sphaericus después de nueva clasificación filogenética) 27 se aisló de la minería del uranio pila de residuos "Haberland" (Johanngeorgenstadt, Sajonia, Alemania) 4,28,29. Su proteína S-capa funcional (SLP1) posee una red cuadrada, un peso molecular de 116 kDa 30, y un espesor de 10 nm sobre ≈ células de las bacterias que viven 31. En estudios anteriores, la formación in vitro de una capa de proteína cerrado y estable con un espesor de aproximadamente 10 nm se logró en menos de 10 min 19. La cepa relacionada L. sphaericus JG-A12, también un aislamiento de la pila "Haberland", posee capacidades de unión de alta de metal y su proteína aislada S-capa ha mostrado buenos índices de absorción alta estabilidad química y mecánica y para los metales preciosos como el Au (III), Pt (II), y Pd (II) 4,32,33. Esta unión de los metales preciosos es más o menos específica para algunos metales y depende de la disponibilidad de grupos funcionales en la proteína de superficie exterior e interior del polímero y en sus poros, la fuerza iónica, y el valor pH. Grupos funcionales relevantes para la interacción de metal por las proteínas son COOH, NH2 -, OH-, PO 4 -, SO 4 - y SO. En principio, la capacidad de unión a metal abren un amplio espectro de aplicaciones, Raff, J. et al. S-capa de nanocompuestos basados ​​en aplicaciones industriales en a base de proteína Engineered Nanoestructuras. (eds Tijana Z. Grove y Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (presentado)). por ejemplo, como componentes biosorptive para la eliminación o la recuperaciónde metales tóxicos o valiosos disueltos, plantillas para la síntesis o deposición definido de nanopartículas estructuradas regularmente metálicos (NPS) para la catálisis y otros materiales de bioingeniería como capas bio-sensorial 3,5,18,33. Arrays NP dispuestos regularmente como Au (0) -NPs podrían ser utilizados para las principales aplicaciones que van desde la electrónica molecular y biosensores, dispositivos de almacenamiento de densidad ultra alta, y catalizadores para la oxidación de CO-34-37. El desarrollo de este tipo de aplicaciones y el diseño inteligente de estos materiales requiere una comprensión más profunda de los mecanismos de unión de metales subyacentes.

Un requisito previo para el desarrollo de tales materiales de origen biológico es la implementación fiable de una capa de interfaz entre la biomolécula y la superficie técnica 38,39. Por ejemplo, polielectrolitos ensamblan con la capa por capa (LBL) 40,41 técnica se han utilizado como una capa de interfaz para la recristalización de las proteínas de la capa S-39 19,42, Raff, J. et al. S-capa de nanocompuestos basados ​​en aplicaciones industriales en a base de proteína Engineered Nanoestructuras. (eds Tijana Z. Grove y Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (presentado)). Sin embargo, el complejo mecanismo de la adsorción de proteínas y la interacción proteína-superficie no se entiende completamente. Especialmente información sobre la conformación, la orientación de patrones, y densidades de recubrimiento sigue desaparecido.

Cuarzo microbalanza de cristal con el monitoreo de disipación (QCM-D) técnica ha llamado la atención en los últimos años como una herramienta para el estudio de la adsorción de proteínas, la cinética de revestimiento, y la interacción proprocesos en la escala nanométrica 19,43-45. Esta técnica permite la detección detallada de la adsorción de masas en tiempo real, y se puede utilizar como un indicador para el proceso de auto-montaje de proteínas y el acoplamiento de moléculas funcionales en redes de proteínas 19,20,42,46-48. Además, las mediciones QCM-D abren la posibilidad de estudiar los procesos de interacción de metal con la capa proteínica en condiciones biológicas naturales. En un estudio reciente, la interacción de la proteína S-capa con metales seleccionados como Eu (III), Au (III), Pd (II) y Pt (II) se ha estudiado con QCM-D 19,20. La capa de proteína adsorbida puede servir como un modelo simplificado de una pared celular de las bacterias gram-positivas. El estudio de este componente único puede contribuir a una mayor comprensión de la interacción metal. Sin embargo, únicamente los experimentos QCM-D no permiten declaraciones con respecto a las estructuras superficiales y las influencias de los metales a la proteína. Otras técnicas son necesarias para obtener dicha información. Uno posbilidad de imágenes bio-nanoestructuras y la obtención de información sobre las propiedades estructurales es la microscopía de fuerza atómica (AFM).

El objetivo del estudio presentado fue investigar la sorción de oro (Au (III) y Au (0) -NPs) a las proteínas de la capa S, en particular SLP1 de L. sphaericus JG-B53. Los experimentos se realizaron con las proteínas en suspensión en la escala de proceso por lotes en un intervalo de pH de 2,0 - 5,0 usando ICP-MS y con S-capas inmovilizadas utilizando QCM-D. Además, la influencia de la solución de sal de metal sobre la estabilidad de celosía se investigó con los estudios de AFM posteriores. La combinación de estas técnicas contribuye a una mejor comprensión de los procesos de interacción in vitro de metal en como una herramienta para aprender más acerca de los acontecimientos en las células bacterianas enteras respecto afinidades metálicos específicos vinculante. Este conocimiento no sólo es crucial para el desarrollo de materiales de filtración aplicables para la recuperación de metales para la protección ambiental y la conservación de la re49 fuentes, sino también para el desarrollo de matrices de NPs metálicas altamente ordenadas para diversas aplicaciones técnicas.

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Protocol

1. Los microorganismos y Condiciones de cultivo

Nota:. Todos los experimentos se realizaron en condiciones estériles L. sphaericus JG-B53 se obtuvo de una cultura crio-conservado 29,30.

  1. Cultura (1,5 ml) en la mesa de trabajo limpia Transferencia crio-conservados a 300 ml de caldo nutriente estéril (NB) medios de comunicación (extracto de carne 3 g / l, 5 g / L de peptona, 10 g / L de NaCl). Después se agita la solución durante al menos 6 horas a 30 ° C para obtener el pre-cultivo para el cultivo.
  2. Cultivar las bacterias en condiciones aeróbicas en medios NB a pH = 7,0, 30 ° C en un 70 L escalado biorreactor de vapor en el lugar. Por lo tanto, llenar el reactor con ≈ 57 l de agua desionizada. Añadir y disolver medios NB sólida directamente en biorreactor (concentraciones véase más arriba).
    1. Adicionalmente añadir agente antiespumante (30 l / L NB-medios de comunicación) a los medios para suprimir la formación de espuma durante el cultivo, a continuación, el autoclave (122 ° C, temperatura de mantenimiento de tiempo de 30 min) los medios de comunicacióndentro de la instalación del reactor.
  3. Enfriar los medios de comunicación y realizar completa saturación de oxígeno. Ajustar el pH a 7,0 (usando 1 MH 2 SO 4 y 2 M de NaOH) e iniciar la inoculación automático de los 300 ml de precultivo. Iniciar el registro de datos de los parámetros de cultivo en el punto de inoculación. Entrar los parámetros en línea, por ejemplo, el nivel de oxígeno disuelto (OD 2), además de ácido y base, y valores de pH en el cultivo.
    1. Monitorear el crecimiento bacteriano en línea por las mediciones de turbidez no invasivos.
  4. Realizar un muestreo adicional después de cada hora de cultivo y determinar con mayor precisión los parámetros como el peso bio seco (BDW) y la densidad óptica en línea (OD). Por lo tanto, recoger 20 ml de caldo de cultivo en cada punto de muestreo en condiciones estériles.
    1. Determinar offline OD por mediciones fotométricas de la adsorción a 600 nm. Utilice NB-medio filtrado estéril como un valor en blanco. En popaer llegar adsorción> 0,4 ​​diluido la suspensión celular después de la linealidad de la ley de Lambert-Beer.
    2. Para la determinación de BDW centrífuga de 1 a 5 ml de suspensión bacteriana (dependiendo de la densidad celular) a 5000 xg durante 5 min a TA. Secar el pellet celular obtenido a 105 ° C en un horno de calentamiento hasta la estabilidad en masa y medir la masa de pellets.
  5. Tomar imágenes microscópicas con microscopio de fase óptica investigación contraste en 400 y 1000 veces de ampliación (contraste de fase de condensador 2 y 3, respectivamente) para el control del crecimiento bacteriano y como un control de la contaminación cruzada.
  6. Después de alcanzar la fase de crecimiento exponencial detectada por línea no 2 y la turbidez en línea, la cosecha de la biomasa por centrifugación de flujo continuo a 15.000 xg, 4 ° C y se lava la biomasa dos veces con tampón estándar (mM TRIS 50 mM de MgCl 10 2, 3 mM NaN 3, pH = 7,5).
    Nota: El sedimento biomasa obtenida se puede almacenar a -18 & #176; C hasta nuevo uso para el aislamiento.

2. S-capa Aislamiento y Purificación de Proteínas

Nota: Se purifica polímeros SLP1 de acuerdo con un método adaptado como se describió anteriormente 2,19,30,32,50,51.

  1. Homogeneizar la biomasa crudo lavado y descongelada obtenida a partir de cultivo en tampón estándar (1: 1 (w / v)) para eliminar los flagelos mediante el uso de un dispersor (nivel 3, 10 min) bajo enfriamiento baño de hielo a 4 ° C.
  2. Centrifugar la suspensión (8.000 xg, 4 ° C durante 20 min) y lavar el sedimento obtenido dos veces con tampón estándar (1: 1 (w / v)). Después del lavado y centrifugación (8.000 xg, 4 ° C durante 20 min), resuspender el precipitado en tampón estándar (1: 1 (w / v)), añadir la ADNasa II y RNasa (0,4 unidades / g de biomasa) a la suspensión y se desintegran las células a 1.000 bar con un homogeneizador de alta presión. Después se centrifuga la suspensión a 27.500 xg, 4 ° C durante 1 hr.
    Nota: suspensión de células de control con los mi de investigacióncroscope. La ruptura se completa cuando menos de 2 - 3 células intactas son visibles en el campo de visión del microscopio en 400 veces magnificación.
  3. Lavar el sedimento dos veces con tampón estándar (1: 1 (w / v)) y realizar la centrifugación de nuevo. Después resuspender el precipitado en tampón estándar (2: 1 (w / v)) mezclado con 1% de Triton X-100 y se incuba durante 20 min bajo sucesiva agitación (100 rpm) para solubilizar depósitos de lípidos.
  4. Centrifugar la solución (27.500 xg, 4 ° C durante 1 hr) y lavar los pellets obtenidos tres veces con tampón estándar (1: 1 (w / v)).
  5. Incubar el sedimento obtenido después de la centrifugación adicional (27.500 xg, 4 ° C durante 1 hr) durante 6 horas en tampón estándar (1: 1 (w / v)) mezclado con 0,2 g / L de lisozima, para hidrolizar enlaces en peptidoglicano 50. Añadir Además DNasa y RNasa II (cada uno 0,4 unidades / g de biomasa) a la suspensión.
  6. Después de la centrifugación (45.500 xg, 4 ° C, 1 hora), volver a suspender la fase de proteína de clara superior con un bajo volumen de tél sobrenadante de la centrifugación (<30 ml) que contienen subunidades de proteínas.
  7. Solubilizar la suspensión blanca mezclando 1: 1 con 6 M clorhidrato de guanidina (6 M GuHCl, 50 mM TRIS, pH = 7,2). La solución se vuelve brillante.
  8. Realizar la filtración estéril (0,2 micras) de la solución tratada GuHCl seguido de una centrifugación a alta velocidad adicional (45.500 xg, 4 ° C durante 1 hr).
  9. Transferir el sobrenadante a tubos de membrana de diálisis (MWCO 50.000 Dalton) y se dializó frente a tampón que recristalización (1,5 mM TRIS, 10 mM CaCl 2, pH = 8,0) durante 48 horas.
  10. Transferir la solución de polímero proteína recristalizada blanco en tubos y se centrifuga a 45.500 xg, 4 ° C durante 1 hora. Resuspender el precipitado en un bajo volumen de agua ultrapura (<30 ml).
  11. Después, transferir la suspensión en tubos de membrana de diálisis y realizar una diálisis contra agua ultrapura durante 24 horas para eliminar el contenido del búfer.
    Nota: Varios cambios de tampón o agua ultrapura durante la diálisis son indispensables.
  12. Liofilizar la SLP1 purificado en un liofilizador.

3. Caracterización y cuantificación de SLP1 para experimentos

Nota: concentración SLP1 de sorción y revestimiento experimentos se cuantificó por espectrofotometría UV-VIS.

  1. Pipetear 2 l de muestra disuelta SLP1 directamente sobre el pedestal de medición inferior del fotómetro. Determinar la concentración de proteína a la máxima adsorción a una longitud de onda de 280 nm, característico de las proteínas. Utilice el coeficiente de extinción de 0,61 para determinar la concentración SLP1. Utilice SLP1 solución gratuita para mediciones de referencia.
  2. Diluir la proteína con el tampón (para los experimentos de sorción en modo por lotes utilizan 0,9% de NaCl, pH = 6,0 y para los experimentos QCM-D utilizan tampón de recristalización, pH = 8,0) a la concentración deseada para experimentos (1 g / L y 0,2 g / L respectivamente).
  3. Analizar la calidad SLP1 y el peso molecular por el Bioanal estándarelectroforesis ytical método de sodio dodecil sulfato poliacrilamida (SDS-PAGE) descrito por Laemmli, UK 52.
    1. Realizar SDS-PAGE antes de usar SLP1 dentro experimentos y, por ejemplo, después de Au (0) incubación -NP usando 10% en geles de poliacrilamida de separación.
    2. Por SDS-muestras mezcla ≈10 l de la muestra de cultivo o la proteína con tampón de muestra (1,97 g TRIS, 5 mg de azul de bromofenol, 5,8 ml de glicerina, 1 g de SDS, 2,5 ml β-mercaptoetanol, se llenan de agua ultrapura a 50 ml) en una proporción de 1: 1 (v / v) y la pipeta la mezcla después de 4 minutos de incubación a 95 ° C en los bolsillos de gel.
    3. Run SDS-PAGE 30 min a una tensión de 60 V hasta que las muestras pasan la tensión de gel de colección y el cambio a 120 V, una vez que pasa el gel de separación.
    4. Retire los geles del sistema de gel, enjuague con agua ultrapura y lugar durante 1 hora en una solución de fijación (ácido ácida 10%, 50% de etanol absoluto). Después, enjuague los geles con agua ultrapura.
    5. Geles Stainutilizando una coloidal no específica adaptada Coomassie brillante método de 53,54 azul. Después de decoloración 72,73, tomar imágenes de SDS-PAGE por el sistema de documentación de gel de acuerdo con el protocolo del fabricante.

4. Los experimentos de sorción en el modo por lotes y cuantificación de metales

  1. Para el lote experimentos de sorción preparan Au solución madre (III) a partir de HAuCl4 ∙ 3 H 2 O, diluir la sal de metal y se mezcla con la solución SLP1 / NaCl a una concentración de metal inicial de 1 mM y concentración final SLP1 de 1 g / L . Realizar experimentos en tríos con un control negativo adicional sin SLP1. Utilizar un volumen total de 5 ml para los experimentos de sorción.
  2. Agitar la suspensión continuamente a RT a diferentes valores de pH pre-ajustado entre 2,0 a 5,0 durante 24 horas (ajustar el pH con solución de HCl y NaOH concentrado bajo).
  3. Después de la adsorción, centrifugar las muestras a 15.000 xg, 4 ° C durante 20 min) para la SEPARcomió SLP1 del sobrenadante.
  4. Transferir el sobrenadante a tubos de ultrafiltración (MWCO 50.000 Da) y se centrifuga a 15.000 xg este, 4 ° C durante 20 min para eliminar los monómeros de proteínas disueltas.
  5. Determinar la concentración de metal en el filtrado resultante por ICP-MS 19,20 y utilizar los resultados para back-cálculo de sorbido metal mediante la masa seca SLP1. Principios de medición, las oportunidades del método y los componentes de la segunda mano ICP-MS fueron descritos en la literatura 55.
    1. Preparar muestras y referencias para las mediciones de ICP-MS utilizando 1% HNO 3 como matriz y el rodio como patrón interno (1 mg / ml).

5. Síntesis de Au-NP y Determinación del Tamaño de Partículas

Nota: Citrato estabilizado Au (0) -NP se sintetizaron de acuerdo con un método adaptado descrito previamente por Mühlpfordt, H. et al. (1982) para obtener partículas esféricas con un diámetro de 10 - 15 nm 56,57

  1. Preparar un estabilizado mM HAuCl 25 4 ∙ 3 H 2 O stock para la formación NP.
  2. Diluir 250 ml de esta solución madre en 19.75 ml de agua ultrapura y se incuba estos a 61 ° C durante 15 min bajo sucesivas sacudidas.
  3. Preparar 5 ml de una segunda solución madre (12 mM de ácido tánico, 7 mM de citrato de sodio dihidrato, 0,05 mM de K 2 CO 3) y se incuba la solución 2 nd por separado a 61 ° C durante 15 min.
  4. Añadir bajo constante agitación de la solución madre 2 al solución única. Se agita la mezcla de reacción durante al menos 10 minutos a 61 ° C. Luego enfriar la solución y utilizarla para recubrimiento NP en SLP1 celosía dentro experimentos QCM-D.
    Nota: El Au resultante (0) -NP se caracterizaron con espectroscopía UV-VIS en el máximo de absorbancia de 520 nm, típicamente utilizado para la detección de formado Au (0) -NPs 58. La solución puede ser almacenada a 4 ° C.
  5. Analizar el tamaño de la formadaAu (0) -NP por espectroscopia de correlación de fotones (PCS), que también se conoce como dispersión de luz dinámica.
    1. Para la determinación del tamaño de la NP, transferir 1,5 ml de sintetizado Au (0) -NP solución en cubetas bajo condiciones libres de polvo en una caja de flujo laminar y analizarlo con un tamaño y potencial zeta medidor de partículas. Una descripción detallada de PCS y preparación de la muestra se da en Schurtenberger, P. et al. (1.993) 59 y Jain, R. et al. (2015) 60.

6. Los experimentos QCM-D - SLP1 Recubrimiento de Superficies y Au-NP adsorción en SLP1 Entramado

Nota: Las mediciones se llevaron a cabo con un QCM-D equipado con hasta cuatro módulos de flujo. Todos los experimentos QCM-D se realizaron con un caudal constante de 125 l / min a 25 ° C. Recubrimiento SLP1 y metal incubación / NP se realizaron en SiO sensores de cuarzo AT-corte 2 piezoeléctricos (Ø 14 mm) con una frecuencia fundamental de ≈ 5 MHz. Enjuague pasos y añadirition de solución están marcados en las figuras de los resultados de parte representativa. Los experimentos QCM-D podría ser descrito como un paso a modo paso comenzando con la limpieza y la modificación de la superficie de los sensores utilizados, seguido de recristalización SLP1 y más tarde en la interacción NP metal y metal.

  1. Procedimientos de limpieza:
    1. Equipar las células del líquido con maniquíes de sensores. Bomba de al menos 20 ml (cada uno por módulo) de un agente de limpieza líquido alcalino (2% limpiador en agua ultrapura (v / v)) a través del sistema QCM-D y el tubo. Después bombear el volumen de cinco veces (cada uno por módulo) de agua ultrapura a través del sistema (caudal de hasta 300 l / min). Realizar la limpieza de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    2. Limpiar los SiO 2 sensores fuera de los módulos de flujo por incubación (al menos 20 min) en solución de SDS al 2% y enjuagar los sensores después varias veces con agua ultrapura 61,62.
    3. Seque los cristales con un borrador filtradaressed aire y colocarlos en una cámara de limpieza de ozono durante 20 minutos 63,64.
    4. Repita el procedimiento de limpieza dos veces para eliminar todos los contenidos orgánicos.
    5. Para eliminar los metales ligados desde la superficie del sensor enjuague los sensores con 1 M HNO 3. Después, realice todos los pasos de enjuague con agua ultrapura.
  2. Sensor modificación de la superficie por polielectrolitos:
    Nota: la modificación de la superficie se puede hacer ya sea en el interior (fluya a través de procedimiento) o fuera del módulo de flujo (técnica LbL). Dentro de estos experimentos se utilizó la siguiente forma para modificar las superficies.
    1. Modificar los sensores con 3 g / l de capas alternas de educación física de polietilenimina (PEI, MW 25.000) y sulfonato de poliestireno (PSS, MW 70.000) a través de recubrimiento por inmersión utilizando la técnica LbL 40,41 descrito anteriormente para el sistema utilizado especial en el artículo de Suhr, M. et al. (2014) 19.
    2. Coloque los sensores dentro de la solución de PE apropiado en profunda wELL placas e incubar estos para 10 min a TA.
    3. Tome los sensores de PE-solución y enjuague los sensores entre cada paso de recubrimiento por inmersión intensiva con agua ultrapura.
      Nota: La nueva modificación de la superficie se compone de al menos tres capas de terminación PE con carga positiva PEI.
    4. Después de esta modificación externa colocar los sensores en el interior del módulo de flujo y equilibrar los sensores de un enjuague con agua ultrapura antes de comenzar los experimentos.
  3. SLP1 monocapa recristalización:
    1. Disolver SLP1 en 4 M urea para la conversión de polímeros en monómeros.
    2. Centrifugar las proteínas monomerized a 15.000 xg, 4 ° C durante 1 hora para eliminar aglomerados más grandes de proteínas.
    3. Mezclar el sobrenadante y se centrifugó SLP1 solubilizado con tampón de recristalización a una concentración final de proteína de 0,2 g / L.
      Nota: El calcio recristalización dependiendo de SLP1 (auto-montaje) se inicia mediante la adición del recbúfer rystallization. Por lo tanto, la bomba de la solución mezclada con un caudal de 125 l / min a los sensores (colocado dentro de los módulos de flujo) inmediatamente. La recristalización se realiza después de los valores estables de cambios de frecuencia y de disipación fueron detectados en experimentos QCM-D.
    4. Después de la recristalización con éxito la proteína en la parte superior de los sensores modificado PE-dentro de los módulos de flujo enjuagar los sensores revestidos con tampón de recristalización o ultrapura waterintensively con un caudal de 125 l / min hasta que los valores estables de desplazamientos de frecuencia y la disipación se detectaron.
      Nota: La modificación de la superficie SiO 2 con PE para los experimentos de sorción posteriores Onto SLP1 monocapa y AFM estudios se visualiza en la Figura 1.

Figura 1
Figura 1. Esquema Diseño de PE modificación de la superficie y SLP1 MonocapaRevestimiento; Esta cifra ha sido modificado desde Suhr, M. et al. (2015) 19 con permiso de Springer. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Metal y metal NP Interacción:
    Nota: La sorción con la solución de sal de metal Au (HAuCl4 ∙ 3 H 2 O) se llevó a cabo en concentraciones de 1 mM o 5 mM a pH = 6,0 en 0,9% soluciones de NaCl. Au-NP adsorción se realizó con diluir Au-PN en 1,6 mM de tampón trisódico-citrato a pH ≈ 5,0.
    1. Después del recubrimiento SLP1 éxito en los módulos de flujo, enjuague la capa SLP1 obtenido intensamente con solución de NaCl al 0,9% hasta que se detectaron valores estables de cambios de frecuencia y la disipación.
    2. Bombear la solución preparada de metal (1 mM) y la solución de NP a los módulos de flujo con un caudal de 125 l / min y realizar un seguimiento de la adsorción a la masa Slcapa p1. Masa de adsorción se puede detectar directamente mediante el seguimiento de los cambios de frecuencia se hace referencia a la ecuación de Sauerbrey (ecuación 1).
    3. Después de completar la interacción metal y NP metal, enjuagar la capa con tampón libre de metal / NP para eliminar metales débiles o nanopartículas unidos encuadernados o débiles.
      Nota: Una ilustración de la configuración experimental se muestra en la Figura 2.

Figura 2
Figura 2. Esquema de diseño de la instalación QCM-D usando Flujo Módulo QFM 401 * 66. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Grabación de Datos y Evaluación:
    1. Registre los cambios en la frecuencia en Hz (Df n) y la disipación (Dd n) Dentro de los experimentos QCM-D mediante el uso de QCM-D de software específico.
    2. Uso para la evaluación de la sensibilidad de masa adsorbida (Delta M) la ecuación / modelo Sauerbrey (Ecuación 1) 65 66 que es válido para películas delgadas y rígidas acopladas sin fricción a la superficie del sensor aplicado a la n-ésimo armónico. El término C (Sauerbrey constante) para el usado 5 MHz en el sensor de cuarzo de corte es de 17,7 ng ∙ ∙ Hz -1 cm -2 68. Para rígida, distribuidas de manera uniforme, y las capas adsorbidas suficientemente delgadas utilizar la ecuación 1 como una buena aproximación.
      Ecuación 1
    3. Realizar el modelado adicional de acuerdo al modelo de Kelvin-Voigt válida para moléculas viscoelásticas 68-71 con el software específico del fabricante y comparar los resultados con los del modelo Sauerbrey.
    4. Para el cálculo del espesor de la capa y el uso de adsorción de masascomo parámetro de modelado importante una densidad de capa de la capa adsorbida de 1,35 g ∙ cm -3 correspondiente a los valores descritos anteriormente para las proteínas de la capa S 72-75. Utilice el mismo valor para el cálculo de la interacción de metal con la capa proteínica.

7. Medidas AFM

  1. Realizar estudios con plena capacidad AFM en un microscopio óptico invertido.
    1. Imágenes de AFM Records en líquido utilizando el tampón recristalización o agua ultrapura directamente en los sensores QCM-D recubiertos.
    2. Enjuague los sensores con agua ultrapura después de los experimentos QCM-D y colocarlos dentro de la célula de fluido AFM. Por lo tanto, utilizar una célula de fluido cerrada con un volumen total de aproximadamente 1,5 ml. Mantenga la temperatura de la constante de celda de fluido a 30 ° C.
    3. Utilice un voladizo con una frecuencia de resonancia de 25 kHz ≈ en agua y una rigidez de <0,1 N / m. Ajuste la velocidad de exploración entre 2,5 y 10 micras / seg.
      4. 76.
      Nota: Las imágenes de altura indicadas z escala, mientras que los valores z representan la topografía exacta de la superficie. Amplitud imágenes (Pseudo 3D) se muestran sin z escala porque z valores de amplitud dependen de parámetros de análisis y dan información limitada. Análisis de imágenes se realizó utilizando los tres de software de evaluación diferente 77.

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Representative Results

Cultivo de Microorganismos y SLP1 Caracterización

Los datos registrados del crecimiento bacteriano indica el final de la fase de crecimiento exponencial en alrededor de 5 hr. Investigaciones anteriores han demostrado que SLP1 se puede aislar desde este punto de cosecha (4,36 g / L biomasa húmeda (≈ 1,45 g / L (BDW)) con un rendimiento máximo 19. Sin embargo, la optimización del cultivo mediante el uso de componentes de medios definidos o federación estrategias de cultivo por lotes daría lugar a rendimientos de biomasa más altas. Esto es irrenunciable para el uso de la alta cantidad de biomasa para aplicaciones industriales. Los valores de la línea y los parámetros de cultivo fuera de línea grabados se resumen en la Figura 3A. control microscópico (Figura 3B) en el momento de la cosecha muestran células no esporulados de L. sphaericus JG-B53.


Figura 3: (A) medidos en línea y fuera de línea los parámetros de cultivo de L. sphaericus JG-B53 y (B) Imagen microscópica de bacterias células vitales de L. sphaericus JG-B53 en el momento de la cosecha en 400 magnificación redil; Esta cifra ha sido modificado desde Suhr, M. et al. (2014) 19 con permiso de Springer. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Además, un perfil de proteínas SDS-PAGE realizado adicionalmente (Figura 4A) indica la cantidad máxima de SLP1 en el momento de 5 h de cultivo. La banda de proteína correspondiente a SLP1 (≈ 150 kDa) es más gruesa, pero a partir de ahora una pérdida de intensidad se observó acompañied por un aumento en las proteínas con peso molecular más bajo causado por la posible fragmentación de proteínas o la segregación de otras proteínas. Las bandas de proteínas aislados y purificados obtenidos por el método mencionado anteriormente (Figura 4B) corresponden a un peso molecular de aproximadamente 150 kDa, que es más pesado que el peso calculado sobre la base de los datos de secuenciación de SLP1 (116 kDa) 30. Esto es probablemente debido a modificaciones postraduccionales. Otras razones para la falta de correspondencia entre la masa molecular teórico y la masa molecular observado en geles de SDS se cobran posiblemente artefactos dependientes en el gel SDS 30.

Figura 4
Figura 4. Perfiles de proteína producida por SDS-PAGE de (A) se desintegraron células de las bacterias obtenidas de muestras de cultivo y (B) purificado SLP1 después del aislamiento con éxito; Este fifigura se ha modificado a partir de Suhr, M. et al. (2014) 19 con permiso de Springer. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Experimentos Batch-sorción y Determinación de Au con ICP-MS

Las capacidades de unión máxima de metal (q max) de Au (III) por suspendida SLP1 se muestran en la Figura 5. Los resultados muestran que Au (III) fue de manera estable obligado por SLP1 durante la incubación 24 hr dentro del intervalo de pH investigado. Los resultados indican q max en el intervalo de aproximadamente 80 - 100 mg Au (III) / g SLP1. Los valores resumidos (Tabla 1) se compararon con la capacidad de sorción de Au alrededor de 75 mg (III) / g SLP1 informó previamente por Suhr, M. et al. (2014), obtenido a partir de experimentos con autoajustablevalores de pH por adición de la solución de sal de metal (pH ≈ 4,3) 19. En resumen, SLP1 ha demostrado la capacidad de unirse altas cantidades de agregado inicialmente Au (III) demostrando sus capacidades de unión altas para este elemento.

Figura 5
Figura 5. Diagrama de máxima metal Encuadernación Capacidades (q max) de Au (III) para polímeros SLP1 dentro experimentos pH ajustado en comparación con los resultados de sorción usando valores de pH auto-ajustado (≈ 4,3) reportados por Suhr, M. et al. (2014) 19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las eficiencias de remoción de metal calculados (RE) en el rango de pH investigados tenían entre 50 - 60% confirmando así la reresultados hechas por Suhr, M. et al. (2014), donde se alcanzaron valores en torno al 40%. En experimentos realizados previamente, fuertes interacciones de Au (III) con los grupos funcionales, por ejemplo,,, y ​​grupos amino hidroxilo carboxylic-, se ha observado para las proteínas S-capa como SLP1 y para la proteína comparativa SlfB de L. sphaericus JG-A12 1,78. Jankowski, U. et al. (2010) detectaron espectroscópicamente una fuerte interacción de Au (III), principalmente con grupos carboxílicos de SlfB que también podría deducirse de SLP1 de L. sphaericus JG-B53 20,79,80. Además, las propiedades de proteínas intrínsecas que reducirían Au (III) para Au (0) en ausencia de agentes reductores pueden ser una razón de la fuerte interacción 79. Además, los resultados de este estudio muestran la tendencia de una realización preferida unión de SLP1 a valores de pH más bajos. Por otra parte, una unión a valores de pH inferiores también podría llevar a una desnaturalización de SLP1. Los estudios realizados hasta la SLP1 demostraron una estabilidad de la proteína a pH =3.0 (resultados no publicados). A partir de experimentos de desorción en condiciones ácidas, utilizando por ejemplo, ácido nítrico o utilizando agentes complejantes como EDTA o citrato (datos no mostrados), verifica que el oro se une de forma estable y no podía ser liberado a partir de polímeros SLP1.

Au (III) en SLP1 de L. sphaericus JG-B53
c inicial (mg / L) 196.97
pH 5 4.5 ≈ 4.3 23 4 3.5 3 2.5 2
valor
q max 88.3 85.3 74.7 102.5 94.1 81 101.9 96.9
(mg Au (III) / g SLP1)
RE 47.1 47.8 37.9 57.1 54.1 44.8 58.7 56.5
(%)

Tabla 1: Máximo metal Encuadernación Capacidades eficiencias de remoción de metal (RE) de experimentos Batch-sorción con Au (q max) y (III) y SLP1 polímeros en solución analizada mediante ICP-MS. Datos en comparación con los resultados publicados anteriormente de Suhr, M. et al. (2014) 19.

SLP1 monocapa recristalización seguido por QCM-D

La disminución inmediata en la frecuencia (? F 5, 7? F,? F 9, Df 11) indica una adsorción rápida y una alta afinidad de las proteínas a la superficie modificada PE (Figura 6A). Igual al cambio rápido en la frecuencia, la disipación (Dd 5, Dd 7, 9 Delta d, Dd 11) también aumenta inmediatamente. Este hecho indica una adsorción de moléculas viscoelásticas a la superficie debido a la amortiguación rápido resultantes en el incremento de los valores de disipación. El cambio de frecuencia máxima se alcanza después de 5 minutos con un valor de ≈ 95 Hz y Dd de 4,2. En una etapa posterior se producen sólo reordenamientos de recristalizado SLP1. SLP1 adsorción se llevó a cabo thusly durante más de 60 minutos para asegurar la tque la formación de una superficie casi totalmente cubierto y ordenada regularidad red de proteínas. El experimento muestra que la capa de PE cargado positivamente es irrenunciable para lograr recubrimientos estables, modificación negativa final conduce a una adsorción débil y la cinética de revestimiento más largos (datos no mostrados) 38. Débilmente adjunta proteínas y aglomerados se eliminaron por lavado con tampón de recristalización-SLP1 libre. Los pequeños cambios? F n confirman la baja de desorción de proteínas y adsorción estable de SLP1. A pesar de esto la disipación desciende a ≈ 2,8 lo que indica que se eliminan moléculas elásticas más grandes.

Figura 6
Figura 6. La recristalización del SLP1 modificados en SiO 2 Sensores analizados por QCM-D; (A) en Df / parcela Dd y (B) Espesor superficie profilmi; Esta cifra ha sido modificado desde Suhr, M. et al. (2014) 19 con permiso de Springer y Suhr, M. (2015) 20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El perfil de la superficie calculada mediante el uso de los modelos mencionados anteriores muestran un espesor monocapa SLP1 de ≈ 11,2 nm (modelo Kelvin-Voigt para películas elásticas) y de 10,0 nm (modelo Sauerbrey para la capa rígida) (Figura 6B). Estos valores son inferiores a las reportado por Suhr, M. et al. (2014). Las diferencias pueden explicarse por un valor utilizado diferentes de la densidad de la capa de proteína dentro de la modelación. Los valores de corriente deben estar más cerca de las realidades de espesor de la capa de proteínas S-capa en la superficie celular de las células vivas de L. sphaericus JG-B53 31,42. Este modelo demuestra que la relación Sauerbrey is inapropiado para acústica capa proteínica delgada, debido a una propagación de la onda acústica de cizallamiento en películas líquidas viscoelásticas 81,82 que se traduce en una subestimación de la masa adsorbida SLP1 y grosor. Esto puede explicarse por las propiedades elásticas de las proteínas S-capa y su acoplamiento de moléculas de agua durante el proceso de adsorción. La interacción del agua con proteínas se puede describir fácilmente por la formación de cáscaras de hidratación, arrastre viscoso o atrapamiento en cavidades en la capa adsorbida 83. Esto efectúa un espesor de capa más alta medida por el modelo de Kelvin-Voigt y también puede aclarar las diferencias en el espesor de la capa obtenida por los dos modelos diferentes. En los estudios de AFM anteriores, se midieron los espesores de capa de celosías de SLP1 Alrededor 8-12 nm. Mediante el cálculo de la adsorción masa de SLP1, en ​​lugar de espesor de la capa, un Delta M total de 1.506,6 ng ∙ cm -2 (modelo de Kelvin-Voigt) se calculó. Los datos de adsorción de masas en la resacaases se resumen en la Tabla 2 y muestran una alta absorción de masas mediante el uso de los valores del modelo de Kelvin-Voigt.

m max Delta M max espesor espesor
(ng / cm 2) (ng / cm 2) (Nuevo Méjico) (Nuevo Méjico)
(Kelvin-Voigt) (Sauerbrey) (Kelvin-Voigt) (Sauerbrey)
SLP1 después del recubrimiento y aclarado 1,505.6 1,351.6 11.2 10

"1"> Cuadro 2: Adsorbida Misa de SLP1 en Modificados Polyelectrolyte SiO2 cristales analizados por QCM-D después de enjuagar con recristalización Buffer (pH = 8,0) y calculado Espesor de capa.

QCM-D como herramienta para la detección de metales y sus NP Interacción con proteico SLP1 monocapa

La interacción de recristalizado monocapa SLP1 con 1 mM y 5 mM disuelto Au (III) se investigó. Los resultados de la masa total adsorbida obtenida de los cálculos y el modelado de los datos registrados de los cambios en la frecuencia y la disipación se resumen en la Tabla 3. Los estudios QCM-D de Au (III) la interacción con las monocapas proporcionan una comprensión más profunda del metal-biomolécula interacción. Por primera vez, la capacidad de unión, la cinética de sorción, y cómo el metal influye en la estabilidad de la proteína se estudió en un nano-gama. Después de la adición de la solución de sal de metal a la monocapa SLP1 la frecuencia disminuyó dentro de la primera 5 min indica una masa de adsorción rápida. Sin embargo, la adsorción de Au no se completó después de 60 min como se describe para otros metales como Pd (II) en estudios previos 19. El aumento de la masa se produce hasta 18 horas. Después de este tiempo, pasos de lavado se realizaron con tampón libre de metal que muestra que el metal adsorbido es casi estable vinculado a la capa SLP1 recristalizado. Por último, una absorción total de metal de 955,0 ± 2,7 ng ∙ cm -2 (modelo de Kelvin-Voigt) se obtuvo en el caso de la (III) solución 1 mM Au y 4,534.4 ± 5,5 ng ∙ cm -2 (modelo de Kelvin-Voigt) en caso de 5 mM Au (III). Los valores más altos obtenidos por 5 mM Au (III) soluciones pueden explicarse por las propiedades intrínsecas de reducción de SLP1 donde metálico más pequeño Au (0) -NP se formaron a partir de esta solución. Estos reducción adecuadalazos de SLP1 ya se han reportado en estudios anteriores de Pd (II) y Au (III) 32,33,79,84. Los datos también mostraron que la interacción con la solución de oro no conduce a una desestabilización de las capas de proteína. Esto indica la unión específica y estable de Au (III) a SLP1, que ha sido también confirmado por las mediciones de ICP-MS utilizando polímeros de la proteína.

La formación de Au (0) -NP durante la síntesis podría ser visualizado por cambio de color de la solución amarilla de partida a una rojizo. Este cambio de color es causado por la excitación de las oscilaciones de plasmones de superficie de las nanopartículas metálicas y demuestra la formación de Au (0) -NPs 1,78. Además NPs más pequeños podrían ser sintetizados por la variación de la concentración del agente reductor (concentración de ácido tánico superior) 85 visible en una coloración diferente de la solución y verificada por resultados de las mediciones PCS (datos no mostrados). En elPor otro lado, el aumento de la concentración de ácido tánico conduce a una pérdida de estabilidad y NP NP tienden a aglomerarse 20. Como prueba de principio, pre-sintetizado Au (0) (distribución de tamaño de 10 - 18 nm medido por PCS visto en la Figura 7A) -NPs se incubaron con SLP1 suspendido durante 48 horas y se analizó mediante SDS-PAGE. El perfil de proteínas se muestra en la Figura 7B verifica la conclusión extraída de los datos QCM-D, que Au (0) -NPs no te moleste la estructura SLP1. Las bandas de proteínas observadas en 150 kDa prueban la presencia de SLP1 intacta.

Figura 7
Figura 7. (A) número ponderado distribución del tamaño de pre-sintetizado Au (0) -NPs medido por PCS y (B) perfil de proteínas de SDS-PAGE de SLP1; carril 1: 2 mg SLP1 antes Au (0) -NPs interacción y el carril 2: 1 g polímeros SLP1 en suspensión después de 48 horas INCUBA ción con Au pre-sintetizado (0) -NPs. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Después de la NP-síntesis y caracterización, los experimentos QCM-D se llevaron a cabo. La adsorción de pre-metálico sintetizado Au (0) -NPs se muestra a modo de ejemplo para los experimentos QCM-D en las parcelas? F / Dd (Figura 8 A) y como el grosor y los perfiles de masas (Figura 8B).

Figura 8
Figura 8. La adsorción de Pre sintetizado-Au (0) -NPs en recristaliza SLP1 Entramado Analizado por QCM-D, (A) en Df / parcela Dd y (B) superficie de la capa y el perfil de masas.blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se podría confirmó que QCM-D se puede utilizar para detectar la adsorción de los 10 - 18 nm esférica Au (0) -NPs. Después de la adición de la solución de Au-NP sin diluir (A 520 nm = 1) obtenido por la síntesis descrita, la frecuencia disminuye, lo que es un indicador directo de la adsorción de masas descrito por la predicción de la ecuación de Sauerbrey (Ecuación 1). La adsorción de Au (0) -NPs estaba casi completada en menos de 60 min. Después de este tiempo no más NPs fueron depositados en la parte superior de la celosía SLP1, por lo que se puede suponer que todos los sitios reactivos o poros estaban ocupadas por Au (0) -NPs. La disminución se muestra en la disipación puede estar afiliado a la rigidez de SLP1 causa celosía por la interacción NP. Los valores de la adsorción total de masa se ​​resumen en la Tabla 3. Incluso lavado intensivo con el tampón citrato NP-libre lleva neither a una desorción del PN ni a un destacamento de la monocapa SLP1. Por lo tanto, una interacción estable y fuerte se puede predecir para el Au (0) interacción -NP en el mismo respeto que con Au (III).

Metal c metales Delta M max Delta M max espesor espesor
(ng / cm 2) (ng / cm 2) (Nuevo Méjico) (Nuevo Méjico)
(Kelvin-Voigt) (Sauerbrey) (Kelvin-Voigt) (Sauerbrey)
1 mM 955 932.6 --- ---
5 mM 4,534.4 4,687.9 --- ---
Au (0) - --- 1,382.9 1,382.7 10.2 10.2
PN

Tabla 3: Misa adsorbido en recristaliza SLP1 Entramado después Au (III) Interacción (pH = 6,0) y Au-NP adsorción (pH = 4,7) Analizado por QCM-D y Cálculo de Espesor después de Au (0) -NP revestimiento. Datos en comparación con los resultados publicados anteriormente de Suhr, M. et al. (2014) 19.

AFM para la visualización de las estructuras nanométricas Scaled

En la Figura 9, la red de proteínas de SLP1 recristalizó en los sensores de PE modificado se muestra con su red cuadrada típica (p4) como imágenes de amplitud. La constante de red podría ser determinado como 13 - 14 nm, que es comparable a los resultados de los experimentos anteriores 30. El espesor de capa de 10 nm ± 2,0 nm medido por AFM verificó el espesor de la capa predicho de las mediciones QCM-D de ≈ 11,2 nm (modelado Kelvin-Voigt). La pequeña diferencia en la altura de la superficie se puede explicar por el hecho de que el calculajuste ado QCM-D considera toda el área del sensor, mientras que el estudio AFM alta resolución sólo muestra un área parcial. Dado esto, aglomerados de proteínas que se unen a la superficie del sensor se incluyeron en el cálculo de la masa adsorbida, respectivamente, al espesor de la capa y dieron lugar a un espesor de capa superior a la determinada por AFM.

Figura 9
Figura 9. AFM Image Amplitud de recristalizó SLP1 del enrejado de L. sphaericus JG-B53 en Cristales QCM-D Directamente después de Revestimiento y enjuague con tampón y Ampliación de la región marcada; Esta cifra ha sido modificado desde Suhr, M. et al. (2014) 19 con permiso de Springer. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La Figura 10 muestra la SLP1 intacta celosía después de la incubación con solución de Au (III). Se puede demostrar que después de la incubación, la red de proteínas se mantuvo completamente intacta. Esto confirma los resultados de los experimentos de QCM-D que predijeron la estabilidad del recubrimiento. En la Figura 11A y B adsorbido previamente sintetizado Au (0) -NPs (tamaño varía desde 10 hasta 18 nm determinado por PCS) en las celosía SLP1 se muestran. Debido al tamaño de las partículas, el Au (0) -NPs son adsorbidos en los poros SLP1 y no siguen el -symmetry p4 de SLP1. Au (0) -NPs estadística son distribuidos en red de proteínas. Mediante la medición de los tamaños de partícula en imágenes de AFM de altura (datos no mostrados) el tamaño de los NPs está en el rango de 16 - 23 nm y aún más pequeño, es decir, en el intervalo de aproximadamente 10 nm 19,20. Este versículofica el tamaño NP determinado previamente medido por PCS (visto en la Figura 8).

Figura 10
Figura 10. Imagen AFM Amplitud de recristalizadas y Intacto SLP1 de enrejado sobre Cristales QCM-D del sensor después de incubación de 5 mM Au (III) de soluciones y la ampliación de la Región marcada; Esta cifra ha sido modificado desde Suhr, M. et al. (2014) 19 con permiso de Springer y Suhr, M. (2015) 20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11
Figura 11. (A) AFM amplitud imagen de adsorbida Au (0) -NPs recristalizado en celosía SLP1 en cristales de sensores QCM-D (izquierda) Y (B) 3D reconstruido perfil de la superficie (derecha); Esta cifra ha sido modificado desde Suhr, M. (2015) 20 con permiso de Springer y Raff, J. et al. (2.016) Raff, J. et al. S-capa de nanocompuestos basados ​​en aplicaciones industriales en a base de proteína Engineered Nanoestructuras. (eds Tijana Z. Grove y Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (presentado)). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este trabajo estudiado la unión de Au a las proteínas de la capa S se investigó usando una combinación de diferentes métodos analíticos. En particular, la unión de Au es muy atractivo no sólo para la recuperación de Au de las aguas de minería o las soluciones del proceso, sino también para la construcción de materiales, por ejemplo, superficies sensoriales. Para los estudios de la interacción Au (Au (III) y Au (0) -NPs) con suspensión y monocapa de SLP1 recristalizado, la proteína tuvo que aislarse. Por lo tanto, este estudio ha demostrado el cultivo con éxito de la cepa bacteriana gram-positiva L. sphaericus JG-B53 y el aislamiento de la proteína capa superficial SLP1. Sin embargo, el cultivo y aislamiento de proteínas siguen siendo difíciles y deben ser optimizados. Una producción a gran escala de las proteínas de biomasa y S-capa es una condición previa para una aplicación industrial de ambos, por ejemplo, para la producción de materiales de metal filtro selectivo. Su potencial de aplicación es undoubtedly alto para la eliminación de metales tóxicos o la recuperación de metales valiosos disueltos en agua de proceso, aguas residuales, o el agua de drenaje. Por otra parte, el potencial de aplicación de S-capas es aún mayor teniendo en cuenta su potencial adicional en otros materiales bio-inspirados, como biosensores y catalizadores.

Los experimentos por lotes de sorción de polímeros SLP1 suspendidos indicaron una unión de alta y estable de Au (III) dentro del intervalo de pH investigado de 2,0 a 5,0. De este modo, las eficiencias de remoción de metal de hasta el 60% pudieron ser contactados. Este comportamiento de unión notable se puede explicar por una fuerte interacción de Au (III) con SLP1 probablemente inducida mediante la interacción de grupos carboxílicos y los grupos de nitrógeno que lleva presentes en la superficie de la proteína. Este argumentos se podrían reforzar mediante FTIR y EXAFS investigación de la cepa similares L. sphaericus JG-A12 32,79. También, propiedades reductoras intrínsecas de SLP1 pueden explicar la alta RE de Au (III) por reducing a en nanopartículas de Au (0). Se puede suponer que la S-capa, como primera interfaz de bacterias al medio ambiente, debe ser principalmente involucrados en la unión de metal. Dentro de la gama de pH investigados, el más alto de metal de capacidad con 102,5 mg Au (III) de unión / g SLP1 se logró a un pH de 4,0. Esta capacidad de unión es mayor que lo reportado para otros componentes bio, por ejemplo, para la pared celular aislado de Bacillus subtilis (71,5 mg Au (III) / g) 86 o para la biomasa de Chlorella vulgaris (98,5 mg Au (III) / g) 8 .

ICP-MS utilizado para la determinación del metal unido mediante polímeros SLP1 es método muy sensible y permite la detección de cantidades más pequeñas de oro en este estudio. ICP-MS ofrece muchos beneficios para la realización de determinaciones de metales traza, por ejemplo, sistema de fácil manejo y bajos límites de detección; en el caso del oro hasta 0,1 a 1 ppt. Esto hace que este método una herramienta versátil para la investigación de procesos biosorptive en la gama baja concentracións. Sin embargo, los resultados en esta investigación se obtuvieron con polímeros S-capa en suspensión y no se pueden transferir fácilmente a los enrejados S-capa recristalizadas sobre las superficies, y por lo tanto muestran la limitación de la ICP-MS. Por ejemplo, hay una relación directa de polímeros proteína aislada se podría hacer a esas estructuras S-capa en células de las bacterias vitales. Además, las mediciones ICP-MS no permiten la determinación de la cinética de sorción metal. Por lo tanto, es necesario encontrar métodos más adecuado para la investigación de la unión de metal por películas delgadas proteína inmovilizada.

En el presente estudio, se aplicaron análisis QCM-D para detectar la formación in situ de celosías S-capa en las superficies, así como la deposición de Au en las proteínas. Por lo tanto, QCM-D es un método robusto y reproducible para el reconocimiento de procesos de adsorción y la interacción de la molécula. Además QCM-D es relativamente simple, rentable, y el método no peligrosos para monitorear such procesa en línea. El método tiene la ventaja de detectar el cambio de masa, con una sensibilidad masa máxima en líquidos de ≈ 0,5 ng ∙ cm -2. Esto permite la posibilidad de detectar incluso interacción débil, por ejemplo, de la proteína con metales disueltos o para medir adsorciones en rangos de baja concentración. La desventaja de QCM-D es que este no es un método de formación de imágenes estructura que permite la visualización de, por ejemplo, redes de proteínas. Por lo tanto, se necesitan otras técnicas.

La QCM-D analiza en este estudio fueron seguidos por imágenes de AFM. La combinación de estos métodos permite el estudio de la cinética de sorción y las consecuencias de Au sorción para el recubrimiento, lo que demuestra que son herramientas versátiles para la investigación de la interacción de metal de películas delgadas proteicos. Además, se demostró que una recristalización fiable de las proteínas S-capa sobre soportes técnicos es esencial para los estudios de interacción de proteínas posteriores. Ya estátanto, las modificaciones de las superficies utilizando promotores de la adherencia son de interés. La aplicación descrita de polielectrolitos (que terminan con PEs cargados positivamente) como capa intermedia entre SiO 2 superficies y plomo capa de proteína a un método mejorado para un recubrimiento rápida de proteínas. El efecto positivo de una capa de carga positivamente polielectrolito se ha descrito previamente para, por ejemplo, la inmovilización de las bacterias células vitales de L. sphaericus JG-B53 31. La aplicación de los PE-capas presentados son el paso más importante y crítico para la recristalización exitosa y reproducible posterior de las proteínas S-capa.

Se pudo demostrar que para la investigación de capas delgadas de SLP1, QCM-D es un buen método para mostrar la adsorción masa respectiva a la recristalización proteína como películas monocapa en tiempo real. Esto también podría ser observado previamente para el reensamblaje de la proteína S-capa SBPA de L. sphaericus </ em> CCM2177 47. Mediante el uso posterior de alta resolución AFM analiza los cambios de la estructura reticular de las proteínas de auto-ensambles se pueden visualizar. AFM mediciones revelaron la simetría p4 de SLP1 y confirman el espesor de capa modelada de SLP1 de aproximadamente 10 nm. Además, la interacción directa de iones metálicos disueltos con la capa de proteína podría ser monitoreado por QCM-D demostrando buena unión de Au (III) por la capa de proteína subyacente. La probable formación de los más pequeños Au (0) -NPs de Au solución (III) en el interior de los poros de proteínas causadas por propiedades reductoras intrínsecas de la red SLP1 dentro mediciones QCM-D podría no se ha detectado por mediciones AFM posteriores. Esto podría estar relacionado con el límite de resolución de AFM y el montaje experimental en este estudio. Esto muestra la limitación de esta técnica y la necesidad de formación de imágenes de alta resolución para las biomoléculas en la escala nanométrica sub. Sin embargo, una alta estabilidad de la capa de SLP1 recristalizado podría deducirse de THe obtuvo QCM-resultados y fue confirmado por la investigación AFM.

En conclusión, se podría demostrado que los polímeros SLP1 tienen capacidades de unión de alta de metal de oro en el intervalo de pH investigado. Además, la investigación revela que la red SLP1 es vinculante un ión metálico buena matriz y para la inmovilización de nanopartículas metálicas. Podría ser demostrado que cada método utilizado en este artículo tiene la posibilidad de detectar incluso las interacciones de metal pequeños, o en caso de AFM puede visualizar las estructuras en el rango de escala nanométrica. Aunque, es sólo por la combinación de estos métodos que se muestran, que ha permitido mejorar el conocimiento y la comprensión de las proteínas estudiadas a nivel molecular.

Principalmente, QCM-D y AFM son los métodos preferidos de elección para la futura investigación de adsorción monocapa proteínas y su interacción con los metales y moléculas funcionales. Mediante la combinación de estos dos métodos, la detección de S-capa proteica adprocesos de adsorción y de imágenes de superficie ofrece una visión de los procesos moleculares que pueden ser capaces de ser transferidos para mejorar el conocimiento de las bacterias que viven y de la interacción con su entorno. Este estudio mostró un extracto de posibles métodos de votos para la comprensión de proteínas y la interacción metal. Otras técnicas útiles que podrían mejorar el conocimiento de tales procesos en detalle que van desde diversos métodos de espectrometría y cromatográficas para espectroscópico investigación de biomoléculas y deben ser incluidos en futuros estudios.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El presente trabajo fue parcialmente financiado por el IGF-proyecto "S-tamiz" (490 ZBG / 1), financiado por el BMWi y BMBF-proyecto "Aptasens" (BMBF / DLR 01RB0805A). Un agradecimiento especial a Tobias J. Günther por su valiosa ayuda durante los estudios de AFM y a Erik V. Johnstone por leer el manuscrito como un hablante nativo de Inglés. Además, el autor de este trabajo quiere agradecer a Aline Ritter y Sabrina Gurlit (del Instituto de Ecología de Recursos para la asistencia en las mediciones de ICP-MS), Manja Vogel, Nancy Unger, Karen E. Viacava y el Grupo de Biotecnología del Instituto Helmholtz- Freiberg de Tecnología de Recursos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
equiment and software
Bioreactor, Steam In Place 70L Pilot System Applikon Biotechnology, Netherlands Z6X Including dO2, pH sensors of Applikon Biotechnology and BioXpert software V2
Noninvasive Biomass Monitor BugEye 2100 BugLab, Concord (CA), USA Z9X ---
Spectrometer Ultrospec 1000 Amersham Pharmacia Biotech, Great Britain 80-2109-10 Company now GE Healthcare Life Sciences
MiniStar micro centrifuge VWR, Germany 521-2844 For centrifugation of cultivation samples
Research system microscope BX-61 Olympus Germany LLC, Germany 037006 Microscope in combination with imaging software
Cell^P (version 3.1) Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Münster, Germany --- together with microscope
Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-S Carr Centritech, Florida, USA 9010PLT For biomasse harvesting
T18 basic Ultra Turrax IKA Labortechnik, Germany 431-2601 For flagella removal and sample homogenization
Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA 728411 Used within protein isolation
Mobile high shear fluid processor, M-110EH-30 Pilot Microfluidics, Massachusetts, USA M110EH30K Used for cell rupture
Alpha 1-4 LSC Freeze dryer Martin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, Germany 102041 ---
UV-VIS spectrophotometry (NanoDrop 2000c) Thermo Fisher Scientific, USA 91-ND-2000C-L For determination of protein concentration
Mini-PROTEAN vertical electrophoresis chamber Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 165-3322 For SDS-PAGE
VersaDoc Imaging System 3000 Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 1708030 Used for imaging of SDS-PAGE gels
ICP-MS Elan 9000 PerkinElmer, Waltham (MA), USA N8120536 For determination of metal concentration
Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments, Worcestershire United Kingdom ZEN3600 For determination of nanoparticle size
Q-Sense E4 device  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-E4 ordered via LOT quantum design (software included with E4 platform)
Q-Soft 401 (data recording) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
Q-Tools 3 (data evaluation and modelling) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
QCM-D flow modules QFM 401  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QFM401 ordered via LOT quantum design
QSX 303 SiO2 piezoelectric AT-cut quartz sensors Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QSX303 ordered via LOT quantum design
Ozone cleaning chamber Bioforce Nanoscience, Ames (IA), USA QS-ESA006 ordered via LOT quantum design
Atomic Force Microscope MFP-3D Bio AFM Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA MFP-3DBio AFM measurements and imaging software
Asylum Research AFM Software AR Version 120804+1223 Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
Igor Version Pro 6.3.2.3 Software WaveMetrics, Inc., USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
BioHeater Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA Bioheater Sample heater for AFM measurements
Biolever mini cantilever,  BL-AC40TS-C2 Olympus Germany LLC, Germany  BL-AC40TS-C2 Prefered cantilever for AFM measurements
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013) Nanotec Electronica S.L. , Spain freeware Software for AFM analysis
Name Company Catalog Number Comments
Detergents and other equiment
acidic acid, 100 %, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3738.5 Danger, flammable and corrosive liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage.
Antifoam 204 Sigma-Aldrich Co. LLC. A6426 For foam suppression
bromophenol blue, sodium salt Sigma-Aldrich Co. LLC. B5525 ---
Coomassie Brilliant Blue R (C45H44N3NaO7S2) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3862.1 ---
Deoxyribonuclease II from porcine spleen Sigma-Aldrich Co. LLC. D4138 Typ IV , 2,000 - 6,000 Kunitz units/mg protein
Ethanol, 95% VWR, Germany 20827.467 Danger, flammable
glycerine, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3783.1 ---
Guanidine hydrochloride (GuHCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 0037.1 ---
Hellmanex III Hellma GmbH & Co. KG 9-307-011-4-507 ---
Hydrochloric acid (HCl) (37%) CARL ROTH GmbH+CO.KG 4625.2 Danger; Corrosive, used for pH adjustment
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich Co. LLC. L6876  Lyophilized powder, protein = 90 %, = 40,000 units/mg protein (Sigma) 
Magnetic stirrer with heating,  MR 3000K Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Germany 504.10100.00 Standard stirrer within experiment
NB-Media DM180 Mast Diagnostica GmbH 121800 ---
Nitric acid (HNO3) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN50.1 Danger; Oxidizing, Corrosing
PageRuler Unstained Protein Ladder ThermoScientific-Pierce 26614 ---
Poly(sodium 4-styrenesulfonat) (PSS) Sigma-Aldrich Co. LLC. 243051 Average Mw ~70,000
Polyethylenimine (PEI), branched Sigma-Aldrich Co. LLC. 408727 Warning; Harmful, Irritant, Dangerous for the environment; average Mw ~25,000
Potassium carbonate anhydrous (K2CO3) Sigma-Aldrich Co. LLC. 60108 Warning; Harmful
Ribonuclease A from bovine pancreas  Sigma-Aldrich Co. LLC. R5503 Type I-AS, 50 - 100 Kunitz units/mg protein 
Sodium azide (NaN3) Merck KGaA 106688 Danger; very toxic and Dangerous for the environment
Sodium chloride (NaCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3957.2 ---
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich Co. LLC. L-5750 Danger; toxic
Sodium hydroxide (NaOH) CARL ROTH GmbH+CO.KG 6771.1 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation and pH adjustment
Spectra/Por 6, Dialysis membrane, MWCO 50,000  CARL ROTH GmbH+CO.KG 1893.1 ---
Sulfuric acid (H2SO4) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN52.2 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation
Tannic acid (C76H52O46) Sigma-Aldrich Co. LLC. 16201 ---
TRIS HCl (C4H11NO3HCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 9090.2 ---
Triton X-100 CARL ROTH GmbH+CO.KG 3051.3 Warning; Harmful, Dangerous for the environment
VIVASPIN 500, 50,000 MWCO Ultrafiltration tubes Sartorius AG VS0132 ---
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich Co. LLC. M6250 Danger, toxic

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References

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