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Immunology and Infection

सूजन डर्मिस में इमेजिंग सीडी 4 टी सेल बीचवाला प्रवासन

Published: March 25, 2016 doi: 10.3791/53585
Automatic Translation
1, 1, 1
1David H. Smith Center for Vaccine Biology and Immunology, Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry, Rochester, NY

Summary

तंत्र है कि सूजन की साइटों पर सीडी 4 प्रेरक टी कोशिकाओं के मध्य गतिशीलता शासन अपेक्षाकृत अनजान हैं। हम एक गैर-आक्रामक दृष्टिकोण कल्पना और सूजन कान डर्मिस इन विट्रो -primed सीडी 4 टी कोशिकाओं में हेरफेर, बगल में इन कोशिकाओं के गतिशील व्यवहार के अध्ययन के लिए अनुमति देने के लिए उपस्थित थे।

Abstract

प्रेरक कार्यों को पूरा करने के लिए सीडी 4 टी कोशिकाओं की क्षमता एक के रूप में अभी तक अपरिभाषित तंत्र के माध्यम से सूजन परिधि के ऊतकों में इन कोशिकाओं का तेजी से और कुशल प्रवास पर निर्भर है। प्रतिरक्षा प्रणाली के अध्ययन के लिए multiphoton माइक्रोस्कोपी के आवेदन बरकरार ऊतकों के भीतर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की गतिशीलता को मापने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है। यहाँ हम सूजन माउस कान डर्मिस में सीडी 4 टी कोशिकाओं की गैर इनवेसिव intravital multiphoton इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। एक कस्टम इमेजिंग मंच का प्रयोग करें और एक शिरापरक कैथेटर कुंजी आणविक गतिशीलता में शामिल घटकों के लिए एंटीबॉडी अवरुद्ध के अलावा के माध्यम से वास्तविक समय में इन कोशिकाओं से पूछताछ करने की क्षमता के साथ, चमड़े का interstitium में सीडी 4 टी सेल गतिशीलता के दृश्य के लिए अनुमति देता है। इस प्रणाली में इन विट्रो मॉडल और शल्य चिकित्सा इनवेसिव इमेजिंग प्रक्रियाओं दोनों से अधिक लाभ प्रदान करता है। गतिशीलता के लिए सीडी 4 टी कोशिकाओं द्वारा इस्तेमाल के लिए रास्ते को समझना अंततः बसी में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता हैसीडी 4 टी कोशिकाओं की सी समारोह के साथ ही पुराने संक्रमण से दोनों स्व-प्रतिरक्षित बीमारियों के रोगजनन और पैथोलॉजी।

Protocol

चूहों को शामिल सभी प्रक्रियाओं रोचेस्टर विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है, और राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा प्रशासित पशु कल्याण अधिनियम और सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा नीति मानवीय देखभाल और प्रयोगशाला पशु के उपयोग पर साथ सख्त अनुसार बाहर किया स्वास्थ्य, प्रयोगशाला पशु कल्याण के कार्यालय के।

1. प्रेरक सीडी 4 टी कोशिकाओं की तैयारी

नोट: BALB / ग TCR ट्रांसजेनिक चूहों DO11.10 कि विशेष रूप से चिकन अंडे ovalbumin से एक पेप्टाइड (pOVA: ISQAVHAAHAEINEAGR) को पहचानते हैं। अन्य TCR ट्रांसजेनिक सिस्टम प्रतिस्थापित किया जा सकता, pOVA के स्थान पर उचित आत्मीय पेप्टाइड का उपयोग कर जहां संकेत दिया।

  1. भोले सीडी 4 टी कोशिकाओं को शुद्ध
    1. 2 एल को उजागर करके एक 6-8 सप्ताह पुराने महिला DO11.10 BALB / ग माउस euthanize / मिनट सीओ 2 तक माउस आंदोलन या 1 मिनट के लिए साँस लेने का कोई संकेत नहीं है, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद, या के अनुसार चलतास्थानीय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के दिशा निर्देशों। एक 70% इथेनॉल समाधान के साथ माउस स्प्रे और पेट नीचे रास्ते का 2/3 करने के लिए माउस की ठोड़ी से त्वचा में एक लगभग 7 सेमी चीरा बनाते हैं। पिछले पैर की ओर पेट में चीरा के अंत से 2-3 सेमी त्वचा चीरों बनाओ। पेरिटोनियम में कटौती नहीं करने के लिए सावधान रहें।
    2. ध्यान से धीरे संदंश के साथ खींच कर पेरिटोनियम से त्वचा को अलग। वंक्षण लिम्फ नोड्स शरीर के साथ पिछले पैरों के जंक्शन के पास की त्वचा पर स्थित हैं। लोभी और HBSS के 8 मिलीलीटर 2% नवजात बछड़ा सीरम (NCS) के साथ पूरक में संदंश और जगह के साथ खींच कर निकालें।
    3. लोभी और संदंश के साथ धीरे खींच कर माउस से कक्षा और बाहु लिम्फ नोड्स हार्वेस्ट। वंक्षण लिम्फ नोड्स के साथ HBSS + 2% एनसीएस में रखें।
    4. गहरी और सतही ग्रीवा लिम्फ OT साथ संदंश और HBSS + 2% एनसीएस में जगह के साथ माउस की गर्दन में स्थित नोड्स हार्वेस्टउसकी लिम्फ नोड्स।
    5. धीरे पेरिटोनियम में कटौती, देखभाल करने के आंतों में कटौती करने के लिए नहीं। Cecum और संदंश के साथ पेट के समझ और mesenteric लिम्फ नोड्स कि सिर्फ पेट के किनारे स्थित हैं बेनकाब। ध्यान से संदंश के साथ mesenteric लिम्फ नोड्स को हटाने और अन्य लिम्फ नोड्स के साथ जगह है।
    6. पेरिटोनियल गुहा में तिल्ली जानें, और ध्यान से इसे हटाने, संदंश के साथ पकड़ रहा है और संयोजी ऊतक शल्य कैंची की एक जोड़ी के साथ दूर काटने। लिम्फ नोड्स के साथ तिल्ली रखें।
    7. HBSS + 2% एक धातु झरनी एक 60 x 15 मिमी संस्कृति डिश में रखा में तिल्ली और लिम्फ नोड्स युक्त एनसीएस गिरने से एक एकल कक्ष निलंबन तैयार करें। धीरे HBSS + 2% एनसीएस में एक 10 मिलीलीटर सिरिंज से सवार के साथ धातु झरनी के माध्यम से प्लीहा और लिम्फ नोड्स मैश।
    8. एक विंदुक का प्रयोग, एक साफ 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में सेल निलंबन चलते हैं। HBSS + 2% एनसीएस के एक अतिरिक्त 10 मिलीलीटर के साथ धातु झरनी और संस्कृति पकवान कुल्ला, यूएक पिपेट गाते हैं, और सेल निलंबन के रूप में ही 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में इस समाधान जगह है।
    9. 600 XG पर कोशिकाओं स्पिन 5 मिनट धीरे pipetting द्वारा 10 मिलीलीटर HBSS + 2% एनसीएस में कोशिकाओं और resuspend गोली करने के लिए। जब तक अन्यथा निर्दिष्ट, सभी centrifugation 5 मिनट के लिए 600 XG पर किया जाना चाहिए।
    10. 1:10 कमजोर पड़ने के लिए पीबीएस में 0.1% trypan नीले रंग के 90 μl में सेल निलंबन के 10 μl पतला। hemocytometer के किनारे पर नाली में समाधान pipetting द्वारा एक hemocytometer पर trypan नीले रंग में कोशिकाओं के 10 μl रखें। hemocytometer के केंद्र ग्रिड में सफेद रक्त कोशिकाओं की गणना, कि के रूप में छोटा दिखाई एरिथ्रोसाइट्स, गोल, लाल hued कोशिकाओं और नीले मृत / मर कोशिकाओं की अनदेखी। 10 4 से गिना कोशिकाओं की संख्या गुणा, कमजोर पड़ने कारक (10) से, और कोशिकाओं (10 एमएल) की मात्रा से 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में एकत्र कोशिकाओं की कुल संख्या निर्धारित करने के लिए।
    11. सीडी 4 टी कोशिकाओं के लिए समृद्ध है, अपकेंद्रित्रगोली कोशिकाओं के लिए, और लगभग 1 माइक्रोग्राम / एमएल विरोधी सीडी 8 (क्लोन 3.155), 1 माइक्रोग्राम / एमएल विरोधी MHC वर्ग द्वितीय (क्लोन M5 / 114), और 1 माइक्रोग्राम से युक्त एक समाधान में 2x10 7 कोशिकाओं / एमएल में कोशिकाओं resuspend / HBSS + 2% एनसीएस में मिलीलीटर विरोधी CD24 (क्लोन J11d) एंटीबॉडी धीरे pipetting द्वारा।
      नोट: इस चरण में इस्तेमाल किया एंटीबॉडी हाइब्रिडोमा सेल लाइनों से घर में प्राप्त कर रहे हैं और सांद्रता approximated हैं। एकाग्रता और ये एंटीबॉडी पूरक सेल के लिए आदर्श की मात्रा अनुभव से निर्धारित किया गया है और प्रयोगशालाओं के बीच अलग अलग होंगे। वैकल्पिक रूप से, कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट भोले सीडी 4 टी कोशिकाओं की शुद्धि के लिए उपलब्ध हैं और पूरक सेल और CD62L + शुद्धिकरण की प्रक्रिया यहाँ का प्रतिनिधित्व के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है। अन्य विधि का उपयोग भोले सीडी 4 टी कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए करते हैं, तो इस प्रोटोकॉल 1.2 कदम से जारी रखा जा सकता है।
    12. 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं। इस ऊष्मायन के अंत में, तेजी से एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी ख में रखकर गिनी पिग पूरक पिघलनालगभग 2 मिनट के लिए एथलीट। पूरक सेल निलंबन में सीधे pipetting द्वारा एंटीबॉडी समाधान में कोशिकाओं के हर 1 मिलीलीटर के लिए पूरक के 100 μl जोड़ें। 30 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कोशिकाओं को सेते हैं।
    13. HBSS + 2% एनसीएस अपकेंद्रित्र ट्यूब में 20 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए कोशिकाओं लाने के लिए जोड़ें। कोशिकाओं के नीचे आरटी घनत्व centrifugation मीडिया के 8 मिलीलीटर (घनत्व 1.086 g / एमएल) में परत। इसके तत्काल बाद सेंट्रीफ्यूज ब्रेक बंद के साथ 15 मिनट के लिए आरटी पर 1400 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।
    14. एक नया 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट और हस्तांतरण कोशिकाओं का उपयोग इंटरफेस में कोशिकाओं को ले लीजिए। HBSS + 2% एनसीएस और centrifuging के साथ 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में मात्रा लाकर कोशिकाओं को धो लें।
    15. एमएसीएस बफर में कोशिकाओं Resuspend धीरे pipetting और कदम 1.1.10 में के रूप में पहले गिनती, द्वारा (पीबीएस 2% एनसीएस और 2 मिमी EDTA के साथ पूरक)।
    16. भोले सीडी 4 टी कोशिकाओं के लिए समृद्ध है, एक समाधान में 2x10 7 कोशिकाओं / एमएल में कोशिकाओं resuspendएमएसीएस बफर में 2.5 माइक्रोग्राम / एमएल बायोटिन संयुग्मित विरोधी CD62L एंटीबॉडी, संख्या कदम 1.1.16 में गिना के आधार पर की। बर्फ पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    17. 10 मिलीलीटर एमएसीएस बफर कोशिकाओं को जोड़ने, तो centrifuging द्वारा कोशिकाओं को धो लें। 10 7 कोशिकाओं एमएसीएस बफर में / 100 μl में कोशिकाओं resuspend और कोशिकाओं को सीधे 1:10 कमजोर पड़ने पर streptavidin संयुग्मित चुंबकीय जुदाई मोती जोड़ें। 20 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
    18. कोशिकाओं के रूप में पहले 500 μl की एक न्यूनतम मात्रा में, कदम 1.1.17 में धो लें और एमएसीएस बफर में 2x10 8 कोशिकाओं / एमएल में कोशिकाओं resuspend।
    19. चुंबक धारक में एक चुंबकीय जुदाई स्तंभ प्लेस और 3 मिलीग्राम एमएसीएस बफर के माध्यम से प्रवाह की अनुमति के द्वारा स्तंभ धो लें। एक विंदुक के साथ स्तंभ के लिए कोशिकाओं को लागू करें।
    20. स्तंभ धो लें 3 मिलीग्राम एमएसीएस स्तंभ पर बफर pipetting और एमएसीएस बफर के माध्यम से प्रवाह, और 3 बार दोहराने के लिए अनुमति देकर चुंबकीय स्तंभ से बाध्य नहीं कोशिकाओं को हटाने के लिए। अंश के माध्यम से प्रवाह त्यागें।
    21. removई चुंबकीय स्टैंड से स्तंभ और एक नया 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब पर पकड़। Pipet 5 स्तंभ पर एमएसीएस बफर के मिलीलीटर और पुश करने के लिए एमएसीएस स्तंभ स्तंभ बाध्य कोशिकाओं जारी है और उस के माध्यम से समृद्ध भोले सीडी 4 टी सेल शामिल प्रवाह इकट्ठा करने के लिए के माध्यम से बफर सवार स्तंभ के साथ संलग्न का उपयोग करें।
    22. अपकेंद्रित्र कोशिकाओं और 10 मिलीलीटर RPMI में resuspend 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस), 100 आइयू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2 मिमी एल glutamine के साथ पूरक है, और 50 माइक्रोन के 2-मर्केप्टोइथेनाल (RPMI-10)। कोशिकाओं की गणना के रूप में पहले कदम 1.1.10 में।
    23. अंतिम RPMI-10 में 6x10 5 / मिलीलीटर भोले सीडी 4 टी कोशिकाओं की एकाग्रता को समायोजित करें।
  2. शुद्ध टी सेल समाप्त प्लीहा APCs
    1. कदम 1.1.1 के रूप में एक 6-8 सप्ताह पुराने मादा जंगली प्रकार BALB / ग माउस euthanize।
    2. एक 70% इथेनॉल समाधान के साथ माउस स्प्रे और माउस के abdome के बाईं ओर एक लगभग 3 सेमी चीरा द्वारा तिल्ली का पर्दाफाशएन। पेरिटोनियल परत खुले में कटौती और धीरे संदंश के साथ लोभी और एक शल्य कैंची के साथ अंतर्निहित को जोड़ने के ऊतकों से इसे दूर काटने से तिल्ली को हटा दें।
    3. तिल्ली HBSS + 2% एनसीएस के 8 मिलीलीटर में रखें।
    4. एक एकल कक्ष निलंबन तिल्ली mashing द्वारा, के रूप में पहले, चरणों में तैयार धोने, और कोशिकाओं की गिनती 1.1.7-1.1.10
    5. गोली 5 मिनट के लिए 600 XG पर कोशिकाओं कताई द्वारा टी कोशिकाओं को क्षीण करने, और धीरे pipetting द्वारा लगभग 1 माइक्रोग्राम / एमएल विरोधी Thy1.2 एंटीबॉडी (J1J क्लोन) का एक समाधान में 2x10 7 कोशिकाओं resuspend। 30 मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को सेते हैं।
      नोट: इस एंटीबॉडी एक हाइब्रिडोमा सेल लाइन से घर में निकाला गया था और concentraton अनुमानित है। एकाग्रता और पूरक सेल के लिए इस एंटीबॉडी आदर्श की मात्रा अनुभव से निर्धारित किया गया था और प्रयोगशालाओं के बीच अलग अलग होंगे। अगर वांछित splenocytes से सफ़ाई APCs के लिए अन्य तरीकों प्रतिस्थापित किया जा सकता है। भोले टी कोशिकाओं और APCs पंथ में तैयार किया जाना चाहिए1.3 कदम से Ure।
    6. गिनी पिग पूरक जोड़ें, सेते हैं, और एक घनत्व centrifugation मीडिया ढाल पर कोशिकाओं को अलग रूप में पहले, कदम 1.1.13-1.1.14 में।
    7. RPMI-10 की 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend और समय की लंबाई है कि 25 Gy विकिरण करने के लिए कोशिकाओं को बेनकाब करेंगे के लिए एक गामा irradiator में एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में कोशिकाओं रखकर APCs चमकाना। समय का यह लंबाई irradiator के आधार पर अलग अलग होंगे और हर बार कोशिकाओं को किरणित हैं और इसकी गणना करने की आवश्यकता होगी।
    8. एक hemocytometer पर कोशिकाओं की गणना के रूप में पहले कदम 1.1.10 में, और RPMI-10 में 2.4x10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए एपीसी कोशिकाओं को समायोजित।
  3. कोशिकाओं को उत्तेजित और एक 5 दिन की संस्कृति में एक Th1 phenotype के लिए सीडी 4 टी कोशिकाओं को अलग।
    नोट:, या टी हालांकि हम यहां की तैयारी कर रहा है और भोले सीडी 4 टी कोशिकाओं से उत्पन्न Th1 प्रभावोत्पादक इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है, इस प्रोटोकॉल एक अलग phenotype के लिए भोले कोशिकाओं को अलग करने के लिए समायोजित किया जा सकताओ ऐसे CD8 टी कोशिकाओं के रूप में अन्य प्रकार की कोशिकाओं का उपयोग करें। भड़काना और भेदभाव के लिए स्थितियां अनुभव से निर्धारित करना होगा।
    1. 24 अच्छी तरह से संस्कृति डिश के प्रत्येक कुएं में, 3x10 5 टी कोशिकाओं की कुल और 1.2x10 अच्छी तरह से प्रति 6 APCs के लिए, भोले सीडी 4 टी कोशिकाओं के 500 μl और प्रत्येक कुएं में विकिरणित APCs के 500 μl गठबंधन।
    2. 2 माइक्रोन आत्मीय ओवीए पेप्टाइड, 20 यू / एमएल पुनः संयोजक एक आईएल -2, 80 माइक्रोग्राम / एमएल विरोधी आईएल 4 (क्लोन 11B11) और 40 एनजी / एमएल पुनः संयोजक आईएल 12 और फिल्टर का उपयोग कर 0.2 युक्त RPMI-10 में एक समाधान तैयार माइक्रोन सिरिंज फिल्टर। प्रत्येक कुएं में 2 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए कोशिकाओं में से प्रत्येक में अच्छी तरह से करने के लिए इस समाधान के 1ml जोड़ें।
    3. 3 दिनों के लिए 5% सीओ 2 में एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं।
    4. 3 दिन, धीरे कोशिकाओं resuspend pipetting और अच्छी तरह से एक नई संस्कृति में प्रत्येक अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर ले जाकर संस्कृतियों विभाजित। / की अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर जोड़ने RPMI-10 से 2 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक लाओ + 20 यू / एमएल पुनः संयोजक आईएल -2। </ Li>
    5. इनक्यूबेटर प्लेटें लौटें और कोशिकाओं 5 दिन तक विस्तार करने की अनुमति देते हैं।

2. प्रकोष्ठों के स्थानांतरण और सूजन की प्रेरण

नोट: इमेजिंग के लिए इष्टतम सेल नंबर के लिए, 5x10 6 fluorescently लेबल Th1 कोशिकाओं 200 μl पीबीएस की कुल मात्रा में प्रत्येक माउस के लिए स्थानांतरित किया जाना चाहिए। प्रकोष्ठों इधर, हरे रंग CFSE या निकट लाल रंग CMTMR के साथ लेबल रहे हैं, हालांकि अन्य सेल पर नजर रखने के रंगों का इस्तेमाल किया जा सकता है। CFSE और CMTMR लेबल की कोशिकाओं दो अलग प्रेरक सीडी 4 आबादी की ट्रैकिंग के लिए अनुमति देने के लिए सह-स्थानांतरित किया जा सकता है।

  1. CFSE के साथ लेबल प्रेरक टी कोशिकाओं
    1. सख्ती प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं pipetting और एक pipet के साथ एक बाँझ 50ml अपकेंद्रित्र ट्यूब के हस्तांतरण से संस्कृति व्यंजन से कोशिकाओं फसल। कदम 1.1.10, तो सेंट्रीफ्यूज के रूप में कोशिकाओं की गणना और 10 7 कोशिकाओं / पीबीएस + 5% एनसीएस में मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend।
    2. पतला 5 मिमी स्टॉक CFSE समाधान 1: 100 मेंपीबीएस। तेजी से ट्यूब के किनारे पर CFSE समाधान की एक बूंद रखने और फिर ट्यूब कमाल के आगे और पीछे मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए कोशिकाओं में से प्रत्येक 1 मिलीलीटर के लिए 110 μl CFSE समाधान जोड़ें।
    3. आरटी पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं सेते हैं, तो कोशिकाओं की ट्यूब को भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) सीधे के 5 मिलीलीटर जोड़कर CFSE बुझा लेते हैं। पीबीएस + 5% एनसीएस के साथ 50 मिलीलीटर मात्रा लाओ।
    4. कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और 20 मिलीलीटर पीबीएस + 5% एनसीएस में गोली resuspend। इस प्रक्रिया को दोहराएं दो बार 3 बार कुल कोशिकाओं को धोने के लिए। एक hemocytometer पर कोशिकाओं की गणना, के रूप में पहले कदम 1.1.10 में, और चूहों के हस्तांतरण के लिए 2.5 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल बाँझ पीबीएस में कोशिकाओं resuspend।
  2. CMTMR साथ लेबल प्रेरक टी कोशिकाओं
    1. कदम 2.1.1 में ऊपर के रूप में कोशिकाओं फसल, तो गिनती, सेंट्रीफ्यूज और RPMI-10 में 10 7 कोशिकाओं / एमएल में कोशिकाओं resuspend।
    2. 10 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता के लिए कोशिकाओं को सीधे 10 मिमी CMTMR शेयर समाधान जोड़ें। जल्दी pipet वेंई कोशिकाओं को अच्छी तरह से CMTMR में मिश्रण और डाई की वर्षा को रोकने के लिए।
    3. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 30 मिनट के लिए सेते हैं। धो कोशिकाओं के रूप में पहले पीबीएस + 5% एनसीएस में 3x, कदम 2.1.3-2.1.4 में। गणना और कोशिकाओं बाँझ पीबीएस में चूहों को हस्तांतरण के लिए 2.5x10 पर 7 कोशिकाओं / एमएल resuspend।
  3. स्थानांतरण प्रेरक टी कोशिकाओं 6-8 सप्ताह पुराने महिला BALB / ग चूहों भोले।
    1. एक सिरिंज में सेल निलंबन (कदम 2.1.4 या 2.2.3) ड्रा, देखभाल करने के लिए यदि आवश्यक हो, सिरिंज सुई पक्ष को पकड़े, धीरे सिरिंज के पक्ष flicking और सवार ऊपर और नीचे ले जाकर सभी बुलबुले को दूर करने के लिए ।
    2. एक साफ पिंजरे में चूहों और गर्मी धीरे से एक गर्मी दीपक के नीचे रखें जब तक पूंछ नस vasodilated प्रकट होता है। एक निरोधक डिवाइस में माउस प्लेस और एक शराब झाड़ू के साथ पूंछ पोंछे। धीरे-धीरे पार्श्व पूंछ नस में सेल निलंबन के 200 μl इंजेक्षन। वहाँ त्वचा के नीचे इंजेक्शन या दिखाई बुदबुदाती करने के लिए कोई विरोध नहीं होना चाहिए।
  4. पूरा Freund के सहायक के साथ immunizing द्वारा त्वचीय सूजन पैदा (सीएफए)
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, सूजन अंतर्त्वचीय इंजेक्शन से प्रेरित है सीएफए या तो आत्मीय या गैर आत्मीय प्रतिजन के साथ emulsified। अन्य भड़काऊ मॉडल, प्रतिस्थापित किया जा सकता है, हालांकि हस्तांतरण और इमेजिंग के समय के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या अनुभव से समायोजित करने की आवश्यकता होगी।
    1. एक 200 माइक्रोन के एक microcentrifuge ट्यूब में बाँझ पीबीएस में ओवीए पेप्टाइड का समाधान तैयार है। Pipet पेप्टाइड समाधान के शीर्ष पर सीएफए के एक बराबर मात्रा।
    2. यह एक 28 G1 / 2 इंसुलिन सिरिंज में ड्राइंग और फिर समाधान microcentrifuge ट्यूब में वापस डूबनेवाला, तो इस कार्रवाई को दोहराने के लगभग 20 गुना से समाधान पायसी। जब पूरी तरह से emulsified, सीएफए और पेप्टाइड समाधान के लिए एक मोटी और अपारदर्शी मिश्रण के रूप में होगा।
      नोट: यह, पायस फार्म के रूप में पायस एक गैर निश्चित needl में मृत अंतरिक्ष में खो जाएगा एक निश्चित सुई इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करने के लिए आवश्यक हैई सिरिंज।
    3. एक पेट्री डिश में रखा पानी पर एक छोटी राशि छोड़ने के द्वारा पायस का परीक्षण करें। पायस बरकरार रहना चाहिए और पानी में फैलाने के लिए नहीं।
    4. एक 300 μl 28 G1 / 2 इंसुलिन सिरिंज में पायस ड्रा और बड़े हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए सवार पर तेजी से नीचे दबाएँ।
    5. इसके तत्काल हस्तांतरण के fluorescently प्रेरक टी कोशिकाओं लेबल के बाद, 240 मिलीग्राम / किग्रा में 2,2,2-tribromoethanol के आईपी इंजेक्शन द्वारा चूहों anesthetize। एक सज्जन पैर की अंगुली चुटकी द्वारा संज्ञाहरण का आकलन, 1 मिलीग्राम वेतन वृद्धि में और अधिक 2,2,2-tribromoethanol प्रशासन, यदि आवश्यक है।
      नोट: अन्य अनुमोदित anesthetics 2,2,2-tribromoethanol लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
    6. बाईं तर्जनी पर एक नोक प्लेस और ध्यान से बाएं अंगूठे और उदर कान का सामना करना पड़ के साथ तर्जनी के बीच माउस के कान समझ। कान, जो त्वचा के लिए यांत्रिक क्षति हो सकती है पर अत्यधिक दबाव डालती के लिए नहीं सुनिश्चित करें।
    7. सीएफए ई युक्त सुई स्लाइडdermis में mulsion, बेवल पक्ष सामना करना पड़ रहा है, और धीरे-धीरे कान में पायस के 10 μl इंजेक्षन। इंजेक्शन की नियुक्ति पंख के बाहरी 1/3 में होना चाहिए, थोड़ा ऑफ केंद्र इष्टतम इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए।
    8. चूहों पर नजर रखने के लिए जब तक संज्ञाहरण से पहना है और चूहों खुद को सही करने में सक्षम हैं और चल रहे हैं। छवि चूहों टीकाकरण के बाद, समय कान डर्मिस के लिए यातायात को हस्तांतरित टी कोशिकाओं में सूजन के लिए उपलब्ध कराने के विकसित करने के लिए और 3 दिनों के लिए।
      नोट: चूहे किसी भी समय पहुंच से बाहर नहीं छोड़ा जा सकता है, जबकि संज्ञाहरण के तहत।

3. इमेजिंग के लिए माउस तैयारी

  1. एक कैथेटर तैयार
    1. ध्यान से सरौता के साथ एक 30 G1 / 2 ट्यूबरक्यूलिन (टीबी) सिरिंज सुई से धातु सुई को हटाने और किसी भी अतिरिक्त गोंद को साफ, कल्पना करने के लिए कि गोंद पूरी तरह से हटा दिया जाता है एक विदारक गुंजाइश का उपयोग कर।
    2. एक और 30 G1 / 2 टीबी सिरिंज सुई की नोक बंद कट, यह सुनिश्चित करना है कि शेष सुई अब भी पी हैदृश्य निरीक्षण द्वारा atent। छंटनी की सुई पर पीई 10 चिकित्सा टयूबिंग की एक 18 सेमी टुकड़ा पर्ची, और ध्यान से ट्यूबिंग के दूसरे छोर में नंगे धातु सुई लगभग 5 मिमी जगह है, एक कैथेटर बनाने।
  2. बाँझ पीबीएस के साथ एक 1 मिलीलीटर टीबी सिरिंज भरने, किसी भी हवाई बुलबुले को हटाने के द्वारा कैथेटर फ्लश। धीरे सिरिंज की नोक पर कैथेटर जगह और धीरे पीबीएस धक्का हालांकि कैथेटर ट्यूबिंग में किसी भी बुलबुले को दूर करने के लिए।
    नोट: जब कैथेटर के माध्यम से तरल पदार्थ को प्रेरित कर रहा है, यह सिरिंज पर कैथेटर धारण करने के लिए सिरिंज के बंद कैथेटर धकेलने से तरल पदार्थ के दबाव को रोकने के लिए आवश्यक है।
  3. एक साफ पिंजरे में चूहों और गर्मी धीरे से एक गर्मी दीपक के नीचे रखें जब तक पूंछ नस vasodilated प्रकट होता है। कमरे में हवा और isoflurane का एक मिश्रण के साथ माउस anesthetize (5% प्रेरण, 1-2% रखरखाव, 2 एल / मिनट प्रवाह दर पर), nosecone विधानसभा कि isoflurane vaporizer के लिए संलग्न किया गया है के माध्यम से दिया। सुनिश्चित करें कि माउस वाई anesthetized हैएक सज्जन पैर की अंगुली चुटकी वें। संवर्द्धित 0.1% से isoflurane प्रवाह की दर में वृद्धि करता है, तो आंदोलन मनाया जाता है। नेत्र मरहम के साथ आंखों को कवर करते हुए माउस anesthetized है सुखाने और चोट को रोकने के लिए।
    नोट: यह जरूरी है कि चूहों कभी नहीं जबकि anesthetized पहुंच से बाहर नहीं छोड़ा जा सकता है। चूहे अक्सर कोमल पैर की अंगुली चुटकी द्वारा पर्याप्त संज्ञाहरण के लिए निगरानी की जानी चाहिए।
  4. संदंश की एक जोड़ी के साथ आधार पर पूंछ स्थिर, और फिर एक शराब झाड़ू के साथ पूंछ पोंछे। ध्यान से पार्श्व पूंछ नस में कैथेटर स्लाइड और धीरे सिरिंज के सवार पर धक्का द्वारा प्रत्यक्षता की जाँच करें। अगर यह उचित रूप से रखा गया है आंदोलन और त्वचा के नीचे पीबीएस का कोई स्पष्ट बुदबुदाती करने के लिए कोई विरोध नहीं होना चाहिए। इंजेक्शन साइट के लिए cyanoacrylate ऊतक चिपकने की 1-2 बूँदें लगाने से पूंछ को कैथेटर प्रत्यय और सुखाने के लिए, लगभग 30 सेकंड के लिए अनुमति देते हैं।
  5. ध्यान से कैंची की एक जोड़ी के साथ वापस और कान की तरफ से बाल ट्रिम, देखभाल करने के एस को नुकसान नहींमें। साथ ही मूंछ ट्रिम। एक कपास झाड़ू का प्रयोग, पीबीएस के साथ कान के भीतरी सतह गीला।
  6. एक 24 x 50 मिमी नं 1.5 गिलास को कवर पर्ची पर माउस और कान घुमाएँ। संदंश का प्रयोग, धीरे कवर पर्ची पर कान समतल, माउस को ले आवश्यक है, तो यह सुनिश्चित करें कि कान कांच से भरा है। एक ऊतक पोंछ के साथ धीरे सोख्ता द्वारा कान से अतिरिक्त पीबीएस निकालें।
    ध्यान दें: के रूप में पतली त्वचा को आसानी से अत्यधिक दबाव के साथ क्षतिग्रस्त हो सकता है, कान पर बहुत मजबूती से प्रेस करने के लिए नहीं सुनिश्चित करें।
  7. घुमावदार संदंश के दो जोड़े का प्रयोग, लंबाई शीर्ष कोनों पर कपड़ा टेप की एक लगभग 20 मिमी लंबे टुकड़ा समझ। माउस के कान के शीर्ष पर coverslip पर टेप के नीचे रखें और कान के बाकी पर टेप रोल, संदंश के साथ रास्ते से बाहर अतिरिक्त बाल धकेलने यदि आवश्यक हो तो coverslip करने के लिए कान प्रत्यय करने के लिए। धीरे से एक तंग सील सुनिश्चित करने के लिए एक सूखी कपास झाड़ू के साथ कान के आसपास टेप पर प्रेस, देखभाल करने के कान पर ही प्रेस करने के लिए नहीं।
  8. चिपकने वाला टेप के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस हीटिंग ब्लॉक करने के लिए इमेजिंग मंच संलग्न। इमेजिंग मंच के कान क्षेत्र के दोनों तरफ वैक्यूम तेल लागू करें। इमेजिंग मंच पर coverslip जगह करने के लिए माउस घुमाएँ, देखभाल करने लगा के केंद्र में कान संरेखित करें।
    नोट: के रूप में इस का कारण होगा यह कांच कवर पर्ची से अलग करने के लिए आ टेप पर वैक्यूम तेल मिल रहा से बचें।
  9. इमेजिंग मंच पर धारक में isoflurane nosecone स्नैप, यह सुनिश्चित करना है कि nosecone सुरक्षित है और पूरी तरह से माउस की नाक को कवर। मजबूती लेकिन ध्यान से एक साफ, सूखे कपास झाड़ू के साथ इमेजिंग मंच पर coverslip दबाकर coverslip के तहत वैक्यूम तेल बिखरा हुआ है।
  10. टेप के दो टुकड़े और 20 मिमी टेप के दो टुकड़े अब मंच के ऊपरी हिस्से के चारों ओर लिपटा के साथ मंच करने के लिए coverslip प्रत्यय। किसी भी हवाई बुलबुले कान और coverslip के बीच मौजूद हैं, वे धीरे वाई के नीचे से कान पर दबाने से हटाया जा सकता हैमुड़ा हुआ कागज का एक टुकड़ा वें।
    नोट: यह कागज कि बहुत मोटी है या मजबूती से प्रेस करने के लिए उपयोग नहीं करने के लिए आवश्यक है, के रूप में इस ऊतक blanching और नुकसान, परिणाम उलझी पैदा कर सकता है।
  11. खुर्दबीन मंच करने के लिए माउस ले जाएँ और चिपकने वाला टेप के साथ मंच सुरक्षित। पाइप वैक्यूम तेल के एक डबल परत कान के आसपास coverslip पर पानी विसर्जन उद्देश्य के लिए एक जलाशय के रूप में काम करने के लिए।
  12. इमेजिंग मंच के माध्यम से माउस के चारों ओर एक पानी से भरे हीटिंग कंबल लपेटें। 37 डिग्री सेल्सियस आसुत जल के साथ जलाशय भरें। सुनिश्चित करें कि सब कुछ चिपकने वाला टेप के साथ चरण के लिए और कहा कि कैथेटर की सिरिंज आसानी से सुलभ है सुरक्षित है।

4. विवो समय चूक इमेजिंग और नसों में एंटीबॉडी प्रशासन में

नोट: सा लेजर प्रणाली: इस प्रोटोकॉल एक multiphoton तिवारी के साथ सुसज्जित खुर्दबीन के उपयोग की आवश्यकता है। इस्तेमाल किया उद्देश्य 1.05 एनए के साथ एक 25x बढ़ाई लेंस, एक वस्तु के साथ चिपका हैIve हीटर 40 डिग्री सेल्सियस के लिए निर्धारित किया है। इस हीटर के लिए अधिकतम तापमान अनुभव से निर्धारित किया गया था 37 डिग्री सेल्सियस पर कान डर्मिस बनाए रखने के लिए उचित तापमान होने के लिए, और अन्य इमेजिंग सिस्टम में इस्तेमाल के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। अधिग्रहण के साधन और प्रोटोकॉल के लिए समायोजन के बीच भिन्न हो सकते हैं इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर अलग विन्यस्त सिस्टम पर काम करने के लिए किए जाने के लिए हो सकता है। सुनिश्चित करें कि छवियों को एक स्वरूप है कि किसी भी वांछित विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ संगत है में बचाया जा सकता है।

  1. कान के केंद्र पर उद्देश्य से स्थिति और उद्देश्य सिर्फ यह जब तक संपर्क जलाशय में पानी की सतह को कम से eyepieces के माध्यम से डर्मिस का पता लगा। एक बाहरी प्रकाश स्रोत का उपयोग करना, eyepieces के माध्यम से देखते हैं और जब तक कान की सतह ध्यान में आता है धीरे-धीरे उद्देश्य कम करने के लिए जारी है। खुर्दबीन मंच के चारों ओर भीतरी और बाहरी पर्दे कम करें।
  2. माइक्रोस्कोप सेटिंग्स निर्धारित और इमेजिंग के लिए एक क्षेत्र का पता लगाने
    1. कल्पना से पहलेजी, सांसद लेजर नियंत्रक विंडो में 900 एनएम, अधिग्रहण की स्थापना में लेजर सत्ता में लेजर तरंग दैर्ध्य का समायोजन करके अधिक से अधिक उत्तेजना और वांछित fluorophores का पता लगाने के लिए लेजर को विन्यस्त: लेजर खिड़की, और छवि के अधिग्रहण नियंत्रण विंडो में पीएमटी voltages ।
      नोट: यह प्रक्रिया दूसरे हार्मोनिक पीढ़ी (420-460 एनएम), CFSE (495-540 एनएम), और CMTMR (575-630 एनएम) का पता लगाने के लिए फिल्टर के साथ 900 एनएम के एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य उपयोग करता है। अन्य विन्यास के रूप में वांछित विभिन्न fluorophores का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. अधिग्रहण की स्थापना में एक 2 μsec / पिक्सेल ध्यान केन्द्रित करना समय के साथ 512 x 512 पिक्सल रेजोल्यूशन के लिए माइक्रोस्कोप सेट: आकार और मोड Windows। "XY दोहराने" पर क्लिक करके छवि के लिए एक क्षेत्र के लिए ऊतक के माध्यम से स्कैनिंग की अनुमति के लिए एक लाइव इमेजिंग मोड को सक्रिय करें। आदर्श रूप में, क्षेत्र अपेक्षाकृत एक समान होना चाहिए, हवा के बुलबुले के बिना, और घने बालों के रोम के क्षेत्रों से परहेज।
      नोट: सीएफए पायस हरे और पूर्वोत्तर में चमकते autofluorescent हैAR-लाल चैनलों और बचा जाना चाहिए। एक इष्टतम क्षेत्र आमतौर पर पायस के किनारे से लगभग 3 मिमी पाया जा सकता है। लगभग 10 - 100 कोशिकाओं एक ही छवि में लगाया जा सकता है। भी कई कोशिकाओं मौजूद हैं, ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर आम तौर पर बारीकी स्थित कोशिकाओं को अलग करने के प्रयास में त्रुटियों मुठभेड़, छोटा और / या गलत सेल पटरियों के लिए अग्रणी होगा।
    3. एक बार एक उपयुक्त इमेजिंग क्षेत्र स्थित किया गया है, जेड क्षेत्र है कि सेल "उच्चतम" डर्मिस में पता लगाने के द्वारा imaged किया जाएगा निर्धारित करते हैं, "सेट 0" बटन पर क्लिक करके 0 को जेड-स्थिति की स्थापना, और जेड में नीचे स्क्रॉल दिशा सेल गहराई की सीमा को मापने के लिए। 35-75 माइक्रोन के एक इमेजिंग गहराई खासियत है। माइक्रोस्कोप खिड़की: अधिग्रहण की स्थापना में शुरू करने और अंत पदों पर सेट करें। इमेजिंग क्षेत्र की गहराई के दौरान कोशिकाओं के दृश्य अनुकूलन करने के लिए "तेज Z" विंडो में साधन पीएमटी वोल्टेज और लेजर शक्ति को समायोजित करें।
      नोट: लास जुटाने से बचेंनमूना पर ऊपर 25 मेगावाट बिजली एर, के रूप में उच्च शक्ति के स्तर डर्मिस के लिए गर्मी के नुकसान और बाँझ चोट पैदा कर सकता है। प्रत्येक माइक्रोस्कोप के लिए उपयुक्त अधिकतम शक्ति स्तर पर अलग अलग होंगे और मापा जा करना होगा। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ऊतक गहराई के साथ लेजर शक्ति या पीएमटी voltages बढ़ती अधिग्रहण के बाद विश्लेषण में अलग गहराई में छवि चमक के मात्रात्मक तुलना के लिए अनुमति नहीं है।
    4. छवि अधिग्रहण नियंत्रण विंडो में "स्कैन" बटन के नीचे "गहराई" और "टाइम" बटन की जाँच करें। फ़िल्टर मोड खिड़की और छवि के अधिग्रहण में जेड-टुकड़ा गहराई को समायोजित:: छवि अधिग्रहण नियंत्रण में छवि प्रति पंक्ति में 3 बार स्कैन करने के लिए एक Kalman फिल्टर सेट के रूप में उल्लेख किया, माइक्रोस्कोप खिड़की इतना है कि यह लगभग 1 मिनट लगते हैं एक पूरी ढेर पर कब्जा करने के लिए TimeView विंडो में।
      नोट: ढेर के बीच अंतराल लगभग 1 मिनट से अधिक समय नहीं लेना चाहिए, के रूप में लंबे समय तक के अंतराल में तेजी से पलायन कोशिकाओं की ट्रैकिंग को रोकने के। वें पर निर्भर करता हैकोशिकाओं के ई प्रकार imaged किया जा रहा है, इस अंतराल विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा उचित सेल ट्रैकिंग के लिए अनुमति देने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। जेड स्लाइस अधिक से अधिक 5 माइक्रोन होना चाहिए। आम तौर पर 2-5 माइक्रोन के बीच 15-18 जेड स्लाइस मोटी एक 1 मिनट इमेजिंग अंतराल के लिए उपयुक्त हैं।
  3. एक पूर्व एंटीबॉडी समय चूक छवि पर कब्जा
    1. क्षेत्र के एक 5 मिनट के समय चूक छवि पर कब्जा अधिग्रहण की स्थापना में "5" को दोहराता की संख्या निर्धारित करके ऊतक की स्थिरता का आकलन करने के लिए: TimeScan खिड़की और "स्कैन" बटन पर क्लिक।
      नोट: ऊतक "बहाव" पर्याप्त समय कान थर्मल संतुलन, गरीब कान तैयारी तक पहुंचने के लिए, या कान के एक क्षेत्र में स्थानीय बहाव की वजह से हो सकता है के लिए अनुमति नहीं की वजह से हो सकता है। तो 5 मिनट की छवि स्थिर, छवि डर्मिस में एक नया क्षेत्र नहीं है। एक नए क्षेत्र में एक दूसरी छवि अस्थिर रहता है, तो यह सबसे अच्छा है ध्यान से एक ताजा cov के साथ कदम 3.6 से कान की तैयारी और इमेजिंग दोहराने के लिएerslip।
    2. TimeScan खिड़की, कोई मामूली ऊतक बहाव के लिए निगरानी के रूप में छवि है: अगर ऊतक 5 मिनट छवि में स्थिर है, अधिग्रहण की स्थापना में 30 और 45 के बीच के लिए दोहराता की संख्या की स्थापना करके एक 30-45 मिनट समय चूक छवि को इकट्ठा एकत्र। एक स्वरूप है कि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया जा करने के साथ संगत है में फ़ाइल सहेजें।
      नोट: प्रोटोकॉल में इस बिंदु पर, कदम 4.2.2 - 4.3.2 एक ही कान में छवि कई स्थानों पर दोहराया जा सकता है। एक माउस, अब की तुलना में 4 घंटे के लिए anesthetized नहीं किया जाना चाहिए रखा मौत के रूप में और अधिक होने की संभावना है।
  4. अवरुद्ध एंटीबॉडी इंजेक्षन और एक के बाद एंटीबॉडी छवि पर कब्जा।
    1. 1 मिलीलीटर सिरिंज में टीबी एंटीबॉडी मिश्रण ड्रा और सुई को हटाने, सभी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए सुनिश्चित कर रही है। सवार पर प्रेस इतना है कि एंटीबॉडी समाधान सिरिंज के अंत में एक "छोटी बूंद" रूपों।
    2. मंच के आसपास पर्दे लिफ्ट और कैथेटर का पता लगाने। मूल पीबीएस conta हटायेकैथेटर से ining सिरिंज। कैथेटर नीचे की स्थापना के बिना, ध्यान से एंटीबॉडी युक्त नई सिरिंज देते हैं। सिरिंज पर कैथेटर के अंत पकड़ो और धीरे-धीरे कैथेटर में एंटीबॉडी मिश्रण इंजेक्षन। यह सुनिश्चित करने के लिए इंजेक्शन कोई विरोध नहीं है।
    3. कैथेटर नीचे सेट और खुर्दबीन मंच के आसपास के पर्दे कम है। इंजेक्शन के समय ध्यान दें और तुरंत पूर्व एंटीबॉडी छवि के रूप में एक ही साधन सेटिंग्स का उपयोग कर एक ही स्थान में एक नया 20-40 मिनट इमेजिंग अनुक्रम का संग्रह शुरू। एक उचित प्रारूप में फाइल को बचाने के लिए विश्लेषण सॉफ्टवेयर इस्तेमाल किया जाएगा।
      नोट: के बीच के समय चूक छवियों, पर्याप्त संज्ञाहरण और सांस लेने के लिए माउस का पालन। यह एंटीबॉडी के प्रशासन निम्नलिखित छवि के लिए अनुशंसित नहीं है और अधिक से अधिक एक क्षेत्र है, वहाँ के रूप में एंटीबॉडी की निकासी की चर दर हो सकती है।
  5. रक्त वाहिकाओं का पता लगाने, कैथेटर प्रत्यक्षता का आकलन, और ख को मापने के लिए fluorescently लेबल dextran इंजेक्षनlood पोत पारगम्यता
    1. 100 μl में fluorescently संयुग्मित dextran (70,000 मेगावाट) बाँझ पीबीएस की एक 2 मिलीग्राम / एमएल समाधान तैयार है और एक सिरिंज में आकर्षित करते हैं, किसी भी हवाई बुलबुले को दूर।
    2. कदम 4.4.1-4.4.2 के रूप में ही तकनीक का उपयोग करना, कैथेटर पर सिरिंज जगह है और नसों dextran समाधान इंजेक्षन।
    3. मोड खिड़की, समय चूक छवियों के लिए के रूप में ही पीएमटी और लेजर सेटिंग्स के साथ: अधिग्रहण की स्थापना में संकल्प बदलकर 1024 x 1024 पिक्सेल संकल्प पर एक भी ढेर पर कब्जा। छवि को इकट्ठा करने के लिए, "स्कैन" बटन के नीचे "टाइम" बटन अचयनित, और फिर "स्कैन" बटन पर क्लिक करें। इस 3 डी छवि वाहिका में स्थित बहिष्कार टी कोशिकाओं के लिए अनुमति देते हैं और बताते हैं कि कैथेटर पेटेंट था और ठीक से डाला जाएगा। वाहिकाओं के बाहर फ्लोरोसेंट dextran का प्रसार भी स्थानीय संवहनी पारगम्यता आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
      नोट: इस उच्च संकल्प (1024 x 1024) स्थिर छवि जनसंपर्क के लिए प्रयोग किया जाता हैesentation उद्देश्यों और अतिरिक्त समय चूक छवियों के रूप में एक ही क्षेत्र में ऊतक वास्तुकला के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, एक 512 x 512 चित्र को लिया जा सकता है, जो छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग समय चूक छवियों के साथ विलय किया जा सकता। dextran प्रशासन के समय चूक इमेजिंग भी वांछित हो सकता है अलग-अलग प्रयोगशालाओं के अनुसंधान की जरूरत पर निर्भर करता है। इस मामले में, छवि कदम 4.2.3-4.3.2 में के रूप में स्थापित किया जाना चाहिए।
  6. इमेजिंग पूरा हो गया है के बाद, ध्यान उद्देश्य के नीचे से माउस को हटाने और पानी कंबल खोलना। टेप काटने और धीरे गिलास उठाने जब तक यह खिसकाते द्वारा इमेजिंग मंच से coverslip निकालें। माउस अभी भी anesthetized है, वहीं coverslip से कान अलग। यह एक टर्मिनल प्रक्रिया होने के लिए है, तो ग्रीवा अव्यवस्था से माउस euthanize। अगर दोहराया इमेजिंग के लिए इस माउस की बचत, यह एक साफ पिंजरे में लौटने के अन्य चूहों से अलग और निरीक्षण जब तक माउस से ही सही और है सकते हैंचल। एक बार संज्ञाहरण से बरामद, माउस अन्य जानवरों के साथ एक पिंजरे में लौट जा सकता है।
  7. एक छवि विश्लेषण कार्यक्रम में इमेजिंग फ़ाइलें आयात और किसी भी वांछित सुधार प्रदर्शन करते हैं। गैर रेखीय संवर्द्धन और स्वचालित समरेखण या शोर कम करने के कार्यक्रमों और एल्गोरिदम से बचाव की सिफारिश की है। आमतौर पर, छवियों मैन्युअल विश्लेषण से पहले छवि के काले बिंदु में वृद्धि से केवल एक छोटी सी पृष्ठभूमि सुधार की जरूरत है। , मैनुअल सुधार के साथ एक स्वचालित सेल ट्रैकिंग प्रोग्राम का उपयोग करके इमेजिंग डेटा का विश्लेषण Overstreet, Gaylo एट अल 30 में के रूप में।
    नोट: कई छवि विश्लेषण उपलब्ध सूट, दोनों मालिकाना और खुला स्रोत, कि इस प्रोटोकॉल से निकाली गई multiphoton छवियों से सेल गतिशीलता यों इस्तेमाल किया जा सकता है। छवि विश्लेषण की सही विधि और इष्टतम सॉफ्टवेयर संकुल अलग-अलग प्रयोगशालाओं के अनुसंधान की जरूरत पर निर्भर करेगा इस्तेमाल किया जाएगा।

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Representative Results

प्रतिरक्षा पर्यावरण बदलने के बिना बगल में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अध्ययन करने की क्षमता एक सूजन के ऊतकों के साथ टी प्रेरक कोशिकाओं की वास्तविक समय बातचीत का अध्ययन आवश्यक है। इस प्रोटोकॉल, चित्रा 1 ए और बी में उल्लिखित द्वारा बरकरार कान डर्मिस की इमेजिंग, चमड़े का interstitium में स्थानांतरित fluorescently लेबल टी प्रेरक कोशिकाओं के दृश्य के लिए अनुमति देता है। यह दोनों उच्च संकल्प (चित्रा 1 सी) और समय चूक (चित्रा -1, मूवी 1) सूजन डर्मिस में प्रेरक टी सेल गतिशीलता की छवियों परमिट।

आकृति 1
चित्रा 1. उच्च संकल्प और बरकरार त्वचीय interstitium में टी प्रेरक कोशिकाओं के 4 डी इमेजिंग। (ए) प्रायोगिक रूपरेखा। (बी) के एक कान prepar की तस्वीरपायस की साइट (काला लाइन धराशायी) और इमेजिंग (लाल रेखा) के लिए इष्टतम क्षेत्र के साथ इमेजिंग के लिए एड संकेत दिया। एक उच्च संकल्प तंतुमय कोलेजन (नीला) और टेक्सास रेड-dextran से दिखा CFSE लेबल Th1 कोशिकाओं (हरा) हो चुकी है, दूसरे हार्मोनिक संकेत के (सी) अधिकतम 3 डी प्रोजेक्शन वाहिका (लाल) लेबल। सफेद तीर कई autofluorescent बालों के रोम के एक इंगित करता है। स्केल सलाखों प्रतिनिधित्व 50 माइक्रोन (डी) सीएफए-सूजन डर्मिस में 30 मिनट के लिए नज़र रखी Th1 कोशिकाओं के प्रवासी पथ। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

इस इमेजिंग प्रोटोकॉल साँस संज्ञाहरण जबकि इमेजिंग के वितरण के लिए एक विशेष इमेजिंग मंच है कि घर में निर्माण किया गया था का उपयोग करते हैं, साथ ही साथ एक अनुकूलित nosecone की आवश्यकता है। इमेजिंग मंच (चित्रा 2A बी) ओ होते हैंएक उठाया केंद्रीय अनुभाग के साथ एक एल्यूमीनियम बेस प्लेट च। यह उठाया खंड एक क्षेपक भाग एक्रिलिक के साथ खड़े हैं compressing और संभावित पतली ऊतकों को नुकसान पहुँचाए बिना कान के लिए समर्थन प्रदान करने के लिए महसूस किया है। हमारे सेटअप की ज्यामिति इमेजिंग के दौरान साँस संज्ञाहरण वितरित करने के लिए एक लचीला और समायोज्य nosecone के निर्माण की आवश्यकता है। इस nosecone, लचीला ट्यूबिंग (चित्रा 2 सी) के एक 50 मिमी धारा से जुड़े एक संशोधित microcentrifuge ट्यूब से मिलकर, चित्रा (2 डी) एक धारक संशोधित microcentrifuge ट्यूब की रचना के साथ जगह में सुरक्षित और हुक और पाश फास्टनर के माध्यम से इमेजिंग मंच से चिपका है । हुक और पाश फास्टनर के उपयोग nosecone विधानसभा इतना है कि एक माउस के दोनों कान imaged किया जा सकता का repositioning के लिए अनुमति देता है, और बेहतर व्यक्तिगत चूहों के लिए तैनात किया जा सकता है।

चित्र 2
चित्रा 2. समintravital इमेजिंग के लिए pment। शीर्ष (ए) और पक्ष (बी) के विचारों में कस्टम निर्मित इमेजिंग मंच। Isoflurane प्रशासन (सी) और nosecone धारक (डी) के लिए nosecone। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूंछ नस की कैथीटेराइजेशन रक्त वाहिकाओं लेबल करने के लिए इस तरह के उच्च आणविक भार dextran के रूप में एंटीबॉडी और अन्य छोटे अणुओं है कि वाहिका से बाहर फैलाना कर सकते हैं, या बड़ा फ्लोरोसेंट अणु प्रशासन के लिए संचलन के लिए निरंतर उपयोग के लिए अनुमति देता है। विरोधी β 1 और विरोधी β 3 इंटीग्रिन कैथेटर के माध्यम से एंटीबॉडी अवरुद्ध, डर्मिस के भीतर पहले से गतिशील कोशिकाओं गिरफ्तारी (मूवी 2) के 100 माइक्रोग्राम के प्रशासन के बाद। इन कोशिकाओं को एंटीबॉडी के बाद एक कम औसत वेग है प्रशासन (चित्रा 3 ए), साथ ही चकरा देने वाली सूचकांक में एक महत्वपूर्ण कमी, कुल ट्रैक की लंबाई (चित्रा 3 बी) के लिए कुल विस्थापन का अनुपात।

चित्र तीन
चित्रा 3. विरोधी β 1 और विरोधी β 3 एंटीबॉडी के प्रशासन को रोकता है सीएफए-सूजन त्वचा में Th1 कोशिकाओं प्रवासन। (ए) Th1 कोशिकाओं की औसत वेग से पहले और 100 माइक्रोग्राम प्रति विरोधी β 1 और विरोधी β 3 इंटीग्रिन के प्रशासन के बाद एंटीबॉडी अवरुद्ध। (बी) Th1 कोशिकाओं से पहले और एंटीबॉडी नाकाबंदी के बाद से चकरा देने वाली सूचकांक। लगभग 100 पर नज़र रखी कोशिकाओं से पहले और एक प्रतिनिधि प्रयोग में एक माउस से एंटीबॉडी नाकाबंदी के बाद छवियों से कर रहे हैं। मान व्हिटनी द्वारा सांख्यिकी।es / ftp_upload / 53585 / 53585fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

क्योंकि बाल कान की सतह से हटा नहीं है, बालों से इमेजिंग कलाकृतियों आम हैं। बालों के रोम (चित्रा 4 ए) और overlying बाल (चित्रा 4 बी) से ग्रहण और autofluorescence से autofluorescence जहां संभव हो तो बचा जाना चाहिए क्योंकि वे टी कोशिकाओं को अस्पष्ट और स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। इसी तरह, हवा के बुलबुले कान सतह और coverslip के बीच फंस इमेजिंग कलाकृतियों (चित्रा 4C) को जन्म दे सकता है। कान की समुचित तैयारी संख्या और किसी भी शेष बुलबुले के आकार को कम करना चाहिए।

चित्रा 4
चित्रा 4। बाल autofluorescence और गरीब कान पूर्व से आम कलाकृतियोंparation। (ए) autofluorescent बालों के रोम। (बी) के autofluorescent बाल और बालों के रोम (हरा) और कोलेजन (सफेद) overlying बाल छाया, छवि में अंधेरे लाइनों के कारण के साथ। (सी) एक हवाई बुलबुले से साक्ष्य, विस्थापित, autofluorescent keratinized एपिडर्मिस के किनारे (बिंदीदार रेखा) दिखा। स्केल सलाखों 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इसके अतिरिक्त, गर्मी के विभिन्न स्त्रोतों का उपयोग थर्मल विस्तार और संकुचन के कारण ऊतक की स्थिरता के साथ मुद्दों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। गलत थर्मोस्टेट सेटिंग्स, उदाहरण के लिए, इमेजिंग कि मुश्किल परिणाम (मूवी 3) की व्याख्या कर सकते हैं के दौरान बड़े दोलनों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। यह किसी भी प्रणाली है कि एक निरंतर तापमान प्रदान करता है और स्थिरता को अधिकतम करने के लिए इष्टतम सेटिंग्स निर्धारित करने के लिए आवश्यक है। ultimatइली, तापमान नियंत्रित इमेजिंग कक्ष के तापमान में परिवर्तन से परिवर्तनशीलता को दूर करने का सबसे अच्छा तरीका है।

फिल्म 1
मूवी 1. Th1 सीएफए-सूजन डर्मिस में पलायन कोशिकाओं (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। 30 मिनट के समय चूक छवि Th1 कोशिकाओं (हरा) त्वचीय कोलेजन नेटवर्क में पलायन (दूसरा हार्मोनिक पीढ़ी, नीला) दिखा।

फिल्म 2
मूवी 2. Th1 कोशिकाओं β 1 की नाकाबंदी और 3 इंटेग्रिन बीटा पर गिरफ्तारी (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। कोशिकाओं (हरा) administ से पहले 30 मिनट के लिए imaged थेअवरुद्ध एंटीबॉडी का राशन, और फिर एक ही स्थान में एक और 20 मिनट के लिए imaged।

मूवी 3
मूवी 3. एक खराब नियंत्रित हीटिंग थाली से दोलन (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। Th1 कोशिकाओं (हरा) और दूसरा हार्मोनिक पीढ़ी (नीला) के 30 मिनट के समय चूक छवि। बाद में इस छवि को एकत्र किया गया था, हीटिंग इस्तेमाल किया प्लेट इमेजिंग मंच और बाद थर्मल विस्तार और संकुचन के तापमान में दोलनों के कारण एक दोषपूर्ण थर्मोस्टेट है पाया गया था।

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Discussion

महत्व

यहाँ हम बरकरार माउस कान डर्मिस में स्थानांतरित कर दिया, विशिष्ट प्रतिजन प्रेरक Th1 कोशिकाओं के 4D दृश्य के लिए एक पूरा प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इस विधि के कई कारणों के लिए कुछ वर्तमान इमेजिंग तौर तरीकों से अधिक लाभ प्रदान करता है। इमेजिंग उदर कान डर्मिस करके, हम बालों को हटाने कि इमेजिंग अन्य त्वचा साइटों को शामिल प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक है छोड़ने के लिए सक्षम हैं। हालांकि depilatories आम तौर पर हल्के होते हैं, वे एक प्रक्रिया है कि एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 43,44 प्रोत्साहित कर सकते हैं त्वचा बाधा से 42 व्यवधान पैदा करने के लिए दिखाया गया है। यह भी आक्रामक सर्जिकल प्रक्रियाओं के डर्मिस या हाइपोडर्मिस को बेनकाब करने से परहेज करके, इस प्रोटोकॉल नुकसान प्रेरित सूजन और त्वचा में न्यूट्रोफिल 37 और अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं का तेजी से भर्ती से बचाता है। इस प्रणाली में एक शिरापरक कैथेटर के उपयोग कुंजी अणुओं के खिलाफ अवरुद्ध एंटीबॉडी देने के लिए डायना के वास्तविक समय पूछताछ के लिए अनुमति देता हैसीडी 4 टी कोशिकाओं की mic व्यवहार। इस इमेजिंग प्रोटोकॉल का उपयोग सीडी 4 टी सेल मध्य गतिशीलता 30 कि इन विट्रो प्रणालियों 8 में नहीं पाया गया के लिए महत्वपूर्ण आवश्यकताओं को पता चला है।

प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम

किसी भी इमेजिंग प्रोटोकॉल में एक आवश्यक कदम इमेजिंग के लिए एक स्थिर ऊतक तैयारी सुनिश्चित करना है। यह सुनिश्चित करने के लिए है कि वहाँ कान और coverslip के बीच पर्याप्त पीबीएस कोई हवाई बुलबुले देखते हैं कि महत्वपूर्ण है और कान गिलास के साथ संपर्क में है, लेकिन इतना नहीं के रूप में टेप कांच से de-पालन बनने के लिए पैदा करने के लिए। इसी तरह, टेप मंच करने के लिए coverslip और किसी भी वैक्यूम तेल समय के साथ ढीला से टेप कर पाएगा पकड़े बीच संपर्क से परहेज। तापमान भी दोलनों से बचने और थर्मल संकुचन या मंच सामग्री की विस्तार से बहाव स्थिर रखा जाना चाहिए।

सीमाओं और संशोधन

45 intravital इमेजिंग समय चूक के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, कान के निवासी प्रतिरक्षा आबादी पार्श्व या लुटेरा 46 पर त्वचा से अलग है, और माउस कान जब अन्य साइटों 47 की तुलना में अलग संवहनी गुण है। इस प्रकार, कुछ अनुप्रयोगों के लिए, अन्य त्वचा साइट्स के लिए कान इमेजिंग डेटा की तुलना मुश्किल हो सकता है।

इस प्रोटोकॉल भी रक्त प्रवाह के बाहर और डर्मिस में स्थानांतरित टी प्रेरक कोशिकाओं के प्रभावी पलायन की आवश्यकता है। इस रूप में वे मध्य अंतरिक्ष में प्रवेश करने में सक्षम नहीं होगा कोशिकाओं है कि घर वापस आना या परिस्त्राव में दोष का उपयोग करने की क्षमता की सीमा। परिस्त्रावसीधे कान डर्मिस 37,48 में कोशिकाओं को इंजेक्शन, हालांकि यह इस तरह स्थानीयकरण या कोशिकाओं है कि इन विवो परिस्त्राव में से गुजरना के व्यवहार पुनरावृत्ति नहीं हो सकता है में कुछ यांत्रिक क्षति और कोशिकाओं के वितरण के कारण होगा द्वारा नजरअंदाज किया जा सकता है।

यह भी इमेजिंग प्रयोगों, इस तरह के BALB / ग तनाव यहाँ या सूरजमुखी मनुष्य C57BL / 6 Tyr सी-2J चूहों का इस्तेमाल किया रूप के लिए गैर pigmented प्राप्तकर्ता चूहों का उपयोग पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। Pigmented चूहों में मेलेनिन, अत्यधिक autofluorescent होने के अलावा, एक multiphoton लेजर 37 से भी अपेक्षाकृत कम बिजली उत्तेजना के तहत गरमा। यह त्वचा और बाद में सूजन 36 या फ्लोरोसेंट speckling 31, परिणाम उलझी करने के लिए थर्मल नुकसान का कारण बन सकता है। इस fluorophores है कि एक मल्टी पैरामीटर इमेजिंग प्रयोग में इस्तेमाल किया जा सकता सीमित कर सकता है। हालांकि, कुछ बहुत उज्ज्वल है या अत्यधिक व्यक्त फ्लोरोसेंट अणु, कम लेजर शक्ति पर प्रभावी ढंग से उत्साहित किया जा सकता हैpigmented चूहों में प्रभावी दृश्य के लिए कारण।

भविष्य अनुप्रयोगों

क्योंकि यह एक गैर इनवेसिव प्रक्रिया है, यह आसानी से विस्तारित समय अवधि में अनुक्रमिक इमेजिंग के साथ चूहों पर अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। जबकि यहाँ के रूप में वर्णित एक से अधिक 3-4 दिन का समय अवधि में फीका होता फ्लोरोसेंट लेबलिंग, endogenously फ्लोरोसेंट कोशिकाओं या फ्लोरोसेंट संवाददाता कोशिकाओं के उपयोग इस समस्या को समाप्त। दरअसल, हम पहले से असर IFNγ संवाददाता यति 30,49 और आईएल -4 संवाददाता 4get 50 सहित साइटोकाइन पत्रकारों, vivo- उत्पन्न विशिष्ट प्रतिजन प्रभावोत्पादक में ट्रैक करने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है। हम इसके अतिरिक्त सीडी 4-CRE ROSA26 बंद floxed EYFP फ्लोरोसेंट संवाददाता चूहों 30 में अंतर्जात सीडी 4 कोशिकाओं कल्पना की है। EYFP और अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन के फ्लोरोसेंट गुण ऐसे CFSE के रूप में रासायनिक रंगों से अलग रूप में, इमेजिंग पैरामीटर के लिए संशोधन की जरूरत हो सकतीकुशल दृश्य के लिए। इस तरह बढ़ रही पिक्सेल समय ध्यान केन्द्रित कुछ मंद fluorophores के फ्लोरोसेंट संकेत वृद्धि कर सकते हैं, और समय चूक छवियों की लंबाई कम हो रही किसी भी photobleaching कि देखा जा सकता है कम कर सकते हैं के रूप में परिवर्तन। 900 एनएम उत्तेजना में, हम पहले से ही कम इमेजिंग अंतराल पर CFSE, CMTMR, या EYFP की महत्वपूर्ण photobleaching मनाया नहीं किया है।

हालांकि इस प्रक्रिया सीडी 4 टी सेल प्रेरक गतिशीलता की गतिशीलता को मापने पर केंद्रित है, यह इस आवेदन करने के लिए सीमित नहीं है। काम वर्तमान में प्रतिजन dermis में फ्लोरोसेंट संवाददाता चूहों और fluorescently संयुग्मित एंटीबॉडी के इंजेक्शन के उपयोग के माध्यम से कोशिकाओं कोशिकाओं या इमेजिंग के लिए 51,52 से पहले ऊतक संरचनाओं लेबल करने के साथ प्रेरक टी कोशिकाओं की गतिशील बातचीत को मापने के लिए चल रही है। इसके अतिरिक्त, जबकि इस प्रोटोकॉल कैथेटर के उपयोग को दर्शाता अवरुद्ध एंटीबॉडी वितरित करने के लिए है, जबकि इमेजिंग, छोटे अणु inhibitors सहित अन्य यौगिकों, कर सकते हैंप्रशासित किया। अंत में, इस प्रोटोकॉल, समय के साथ प्रतिरक्षा गतिशीलता को मापने के लिए एक गैर-आक्रामक तरीके से विवो में, एक लचीला मंच प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों को लाइव इमेजिंग के साथ मदद के लिए रोचेस्टर Multiphoton माइक्रोस्कोप कोर सुविधा के लिए विश्वविद्यालय को धन्यवाद। एनआईएच AI072690 और AI02851 DJF द्वारा समर्थित; एजी और AI089079 एम जी ओ के लिए AI114036।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BALB/c mice Jackson Laboratories 000651 Mice used were bred in-house
DO11.10 mice Jackson Laboratories 003303 Mice used were bred in-house
HBSS Fisher 10-013-CV Multiple Equivalent
Newborn Calf Serum (NCS) Thermo/HyClone SH30118.03 Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes
Guinea Pig Complement Cedarlane CL-5000
anti-CD8 antibody ATCC 3.155 (ATCC TIB-211) Antibodies derived from  this hybridoma
anti-MHC Class II antibody ATCC M5/114.15.2 (ATCC TIB-120) Antibodies derived from  this hybridoma
anti-CD24 antibody ATCC J11d.2 (ATCC TIB-183) Antibodies derived from  this hybridoma
anti-Thy1.2 antibody ATCC J1j.10 (ATCC TIB-184) Antibodies derived from  this hybridoma
Ficoll (Fico/Lite-LM) Atlanta Biologicals I40650
PBS Fisher 21-040-CV Multiple Equivalent
EDTA Fisher 15323591
biotinylated anti-CD62L antibody (clone MEL-14) BD 553149
streptavidin magnetic separation beads Miltenyi 130-048-101
MACS LS Separation Column Miltenyi 130-042-401
recombinant human IL-2 Peprotech 200-02
recombinant mouse IL-4 Peprotech 214-14
recombinant mouse IL-12 Peprotech 210-12
anti-IFNg antibody (clone XMG 1.2) eBioscience 16-7311-85
anti-IL-4 antibody (clone 11b11) eBioscience 16-7041-85
RPMI VWR 45000-412
Penicillin/Streptomycin Fisher 15303641
L-glutamine Fisher 15323671
2-mercaptoethanol Bio-Rad 161-0710
ovalbumin peptide Biopeptide ISQAVHAAHAEINEAGR-OH peptide
Fetal Calf Serum (FCS) Thermo/HyClone SV30014.03 Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes
24-well culture plate LPS 3526 Multiple Equivalent
CFSE Life Technologies C34554
CMTMR Life Technologies C2927
28 G1/2 insulin syringes, 1ml BD 329420
28 G1/2 insulin syringes, 300μl BD 309301
27 G1/2 TB syringes, 1ml BD 309623
30 G1/2 needles BD 305106
PE-10 medical tubing BD 427400
cyanoacrylate veterinary adhesive (Vetbond) 3M 1469SB
heating plate WPI 61830
Heating plate controller WPI ATC-2000
Water blanket controller Gaymar TP500 No longer in production, newer equivalent available
water blanket Kent Scientific TP3E
Isoflurane vaporizer LEI Medical Isotec 4 No longer in production, newer equivalent available
isoflurane Henry Schein Ordered through Veterinary staff
microcentrifuge tubes VWR 20170-038 Multiple Equivalent
medical tape 3M 1538-0
isoflurane nosecone Built In-house, see Fig 2
imaging platform Built In-house, see Fig 2
curved forceps WPI 15915-G Multiple Equivalent
scissors Roboz RS-6802 Multiple Equivalent
glass coverslips VWR Multiple Equivalent
high vacuum grease Fisher 146355D
cotton swabs Multiple Equivalent
delicate task wipes Fisher 34155 Multiple Equivalent
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM upright microscope with Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser Olympus call for quote
optical table with vibration control Newport call for quote
25x NA 1.05 water immersion objective for multiphoton imaging Olympus XLPLN25XWMP2
objective heater Bioptechs PN 150815
Detection filter cube Olympus FV10-MRVGR/XR Proprietary cube, can be approximated from individual filters/dichroics
anti-integrin β1 antibody (clone hMb1-1) eBioscience 16-0291-85 Azide free, low endotoxin
anti-integrin β3 antibody (clone 2C9.G3) eBioscience 16-0611-82 Azide free, low endotoxin
Texas Red Dextran (70,000 MW) Life Technologies D-1830

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References

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Gaylo, A., Overstreet, M. G., Fowell, D. J. Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis. J. Vis. Exp. (109), e53585, doi:10.3791/53585 (2016).

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