Summary
Mekanismene som styrer interstitiell motilitet av CD4 T-celler på områder av betennelse er relativt ukjent. Vi presenterer en ikke-invasiv metode for å visualisere og manipulere in vitro -primed CD4 T-celler i den betente øret dermis, slik at for undersøkelse av den dynamiske oppførsel av disse cellene in situ.
Abstract
Muligheten av CD4 T-celler til å utføre effektorfunksjonene er avhengig av rask og effektiv migrering av disse cellene i betent perifere vev gjennom en som ennå udefinert mekanisme. Anvendelsen av multiphoton mikroskopi for å studere immunsystemet gir et verktøy for å måle dynamikken i immunresponser i intakt vev. Her presenterer vi en protokoll for ikke-invasiv intra multiphoton avbildning av CD4 T-celler i de betente mus øret dermis. Bruk av en tilpasset bildeplattform og et venekateter tillater visualisering av CD4 T-celle-dynamikk i dermal interstitium, med evnen til å avhøre disse cellene i sanntid via tilsetning av blokkerende antistoffer til viktige molekylære komponentene som er involvert i motilitet. Dette systemet gir fordeler i forhold til både in vitro modeller og kirurgisk invasivt bildebehandling prosedyrer. Forstå trasé som brukes av CD4 T-celler for motilitet kan til slutt gi innsikt i basic funksjon av CD4 T-celler, så vel som patogenesen av både autoimmune sykdommer og patologiske fra kroniske infeksjoner.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer mus ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Rochester, og utføres i henhold til dyrevernloven og Public Health Service politikk på Humane Stell og bruk av forsøksdyr administrert av National Institutes Helse Office of Laboratory Animal Welfare.
1. Utarbeidelse av Effector CD4 T-celler
MERK: BALB / c TCR-transgene DO11.10 mus som spesifikt gjenkjenner et peptid fra kylling egg ovalbumin (pOVA: ISQAVHAAHAEINEAGR). Andre TCR-transgene systemer kan være substituert, ved anvendelse av hensiktsmessig beslektet peptid istedenfor pOVA er angitt.
- Rens naive CD4 T-celler
- Avlive en 6-8 uker gammelt DO11.10 BALB / c mus ved å utsette til 2 l / min CO 2 til mus viser ingen tegn til bevegelse eller pust i 1 min, etterfulgt av cervical forvridning, eller i henhold tilretningslinjene fra lokale Institutional Animal Care og bruk komité. Spray mus med 70% etanol løsning og gjøre en ca 7 cm snitt i huden fra haken av musen til 2/3 av veien ned i magen. Gjør 2-3 cm hud snitt fra slutten av snitt i buken mot bakbeina. Vær forsiktig med å skjære i bukhinnen.
- Løsne forsiktig skinnet fra bukhinnen ved å forsiktig dra med tang. Lyske lymfeknuter er plassert på huden ved krysset mellom bakbena med kroppen. Fjern ved å ta tak og dra med pinsett og legg i 8 ml HBSS supplert med 2% nyfødt kalveserum (NCS).
- Høste aksillære og brachialis lymfeknuter fra mus ved å ta tak og dra forsiktig med pinsett. Sett i HBSS + 2% norsk sokkel med inguinal lymfeknuter.
- Høste dype og overfladiske cervical lymfeknuter lokalisert i nakken av musen med pinsett og sted i HBSS + 2% norsk sokkel med othennes lymfeknuter.
- Forsiktig kuttet i bukhule, tar seg ikke å skjære i tarmen. Ta tak i cecum og tykktarm med pinsett og avsløre mesenteric lymfeknuter som ligger bare langs kolon. Fjern forsiktig mesenteric lymfeknuter med pinsett og plasser med de andre lymfeknutene.
- Finn milt i bukhulen og fjern den, holder med pinsett og kutting av bindevev bort med et par kirurgiske sakser. Plasser milt med lymfeknutene.
- Forbered en enkelt cellesuspensjon ved å helle den HBSS + 2% norsk sokkel inneholder milt og lymfeknuter i et metall sil plassert i en 60 x 15 mm kultur parabolen. Forsiktig mos milt og lymfeknuter gjennom metall sil med stempelet fra en 10 ml sprøyte inn i HBSS + 2% norsk sokkel.
- Ved hjelp av en pipette, beveger cellesuspensjonen inn i en ren 50 ml sentrifugerør. Skyll metall sil og kultur tallerken med ytterligere 10 ml HBSS + 2% NCS, usynge en pipette, og plassere denne løsning i det samme 50 ml sentrifugerør som cellesuspensjonen.
- Spinn-celler ved 600 xg i 5 minutter for å pelletere cellene og resuspender i 10 ml HBSS + 2% NCS ved forsiktig pipettering. Med mindre annet er angitt, skal alle sentrifugering utføres ved 600 xg i 5 minutter.
- Fortynn 10 ul av cellesuspensjonen i 90 ul 0,1% trypanblått i PBS i en fortynning på 1:10. Plassere 10 ul av cellene i trypanblått på et hemocytometer ved å pipettere løsningen inn i sporet i kanten av hemocytometer. Tell de hvite blodcellene i sentrum rutenett av hemocytometer, ignorerer erytrocytter som fremstår som litt mindre, rund, rød-hued celler og de blå døde / døende celler. Multiplisere antall celler tellet ved 10 4, med fortynningsfaktoren (10), og ved at volumet av cellene (10 ml) for å bestemme det totale antall celler oppsamlet i 50 ml sentrifugerør.
- Å berike for CD4 T-celler, sentrifugerceller til pellets, og resuspender cellene ved 2x10 7 celler / ml i en oppløsning inneholdende ca. 1 ug / ml anti-CD8 (klon 3,155), 1 ug / ml anti-MHC klasse II (klon M5 / 114), og 1 ug / ml anti-CD24 (klon J11d) antistoffer i HBSS + 2% NCS ved forsiktig pipettering.
MERK: antistoffer som brukes i dette trinnet er hentet in-house fra hybridomceller cellelinjer og konsentrasjonene er rundet. Konsentrasjonen og volum av disse antistoffene ideelt for komplement lysis ble bestemt empirisk og vil variere mellom laboratorier. Alternativt kan flere kommersielt tilgjengelige sett er tilgjengelige for rensing av naive CD4 T-celler, og kan være substituert for komplementlysering og CD62L + renseprosess representert her. Hvis du bruker en annen metode for å rense naive CD4 T-celler, kan denne protokollen videreføres fra trinn 1.2. - Inkuber på is i 30 min. Ved slutten av denne inkubering, hurtig tines marsvin-komplement ved å plassere i et 37 ° C vann bath i ca. 2 min. Tilsett 100 ul av komplement for hver 1 ml celler i antistoffløsning ved pipettering komplementet direkte inn i cellesuspensjonen. Inkuber cellene i et 37 ° C vannbad i 30 min.
- Legg HBSS + 2% NCS for å bringe cellene til et totalt volum på 20 ml i sentrifugerøret. Lag i 8 ml RT tetthetssentrifugeringsmateriale (tetthet 1,086 g / ml) under cellene. Umiddelbart Sentrifuger cellene ved 1400 xg ved romtemperatur i 15 min med sentrifugen brems.
- Samle celler ved grenseflaten ved hjelp av en serologisk pipette og overføre cellene til en ny 50 ml sentrifugerør. Vask cellene ved å bringe volumet i sentrifugerøret til 50 ml med HBSS + 2% NCS og sentrifugering.
- Suspender cellene i MACS buffer (PBS supplert med 2% norsk sokkel og 2 mM EDTA) ved forsiktig pipettering og teller som tidligere, i trinn 1.1.10.
- For å anrike for naive CD4 T-celler, resuspender cellene ved 2x10 7 celler / ml i en oppløsningpå 2,5 ug / ml biotin-konjugert anti-CD62L-antistoff i MACS-buffer, basert på antall telles i trinn 1.1.16. Inkuber i 30 min på is.
- Vask cellene ved tilsetning av 10 ml MACS-buffer, deretter sentrifugering av cellene. Resuspender cellene ved 10 7 celler / 100 ul i MACS-buffer og legge til streptavidin-konjugerte magnetiske separasjon perler ved en 1:10 fortynning direkte til cellene. Inkuber på is i 20 min.
- Vask cellene som før, i trinn 1.1.17, og resuspender cellene ved 2x10 8 celler / ml i MACS-buffer, i et minimumsvolum på 500 pl.
- Plasser en magnetisk separasjonskolonne i magnetholderen og vaske kolonnen ved å la 3 ml MACS-buffer flyte gjennom. Anvende cellene til kolonnen med en pipette.
- Vaske kolonnen for å fjerne celler som ikke er bundet av den magnetiske kolonne ved å pipettere 3 ml MACS-buffer til kolonnen, og at MACS-buffer til å strømme gjennom, og gjentas 3 ganger. Kast strømmen gjennom fraksjonen.
- Remove kolonnen fra det magnetiske stativet og holder over en ny 50 ml sentrifugerør. Pipettér 5 ml MACS-buffer til kolonnen, og bruk stempelet vedlagte med kolonnen for å presse MACS-buffer gjennom kolonnen for å frigjøre kolonne bundet til cellene og samle strømningen gjennom som inneholder anriket naive CD4 T-celler.
- Sentrifuger cellene og resuspender i 10 ml RPMI supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS), 100 IU / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin, og 50 uM 2-merkaptoetanol (RPMI-10). Telle celler som før, i trinn 1.1.10.
- Juster den endelige konsentrasjonen av naive CD4 T-celler til 6x10 5 / ml i RPMI-10.
- Rens T-celle-fratatte milt APCer
- Avlive en 6-8 uker gammelt villtype BALB / c mus som i trinn 1.1.1.
- Spray mus med en 70% etanolløsning og eksponere milten ved å gjøre en ca. 3 cm innsnitt på den venstre siden av musens abdomen. Skjær åpne peritoneal lag og fjerne milten ved forsiktig å gripe den med tang og klippe det bort fra den underliggende koble vev med en kirurgisk saks.
- Plasser milt i 8 ml HBSS + 2% norsk sokkel.
- Fremstille en enkelt cellesuspensjon ved å mose milt, vaske, og telle cellene, som før, i trinn 1.1.7-1.1.10
- Utarme T-celler ved å spinne cellene ved 600 xg i 5 minutter for å pellet, og resuspender cellene ved 2x10 7 i en oppløsning på omtrent 1 pg / ml anti-Thy1.2 antistoff (klon J1J) ved forsiktig pipettering. Cellene inkuberes på is i 30 min.
MERK: Dette antistoff ble avledet i huset fra en hybridom cellelinje, og konsentreringstrinn approksimeres. Konsentrasjonen og volumet av dette antistoff ideell for komplement-lyse ble bestemt empirisk og vil variere mellom laboratorier. Andre fremgangsmåter for rensing av APCer fra splenocytter kan erstattes hvis ønskelig. Naive T-celler og APC bør være forberedt på kulture fra trinn 1.3. - Legg marsvin komplement, inkuber, og skille cellene på en tetthet sentrifuge media gradient som før, i trinn 1.1.13-1.1.14.
- Resuspender cellene i 10 ml RPMI-10 og bestråle de APC ved å plassere cellene i et 50 ml sentrifugerør i en gammastråle for en lang tid som vil utsette cellene for å 25 Gy stråling. Denne tiden vil variere basert på stråle og må beregnes hver gang cellene er bestrålt.
- Tell cellene på et hemocytometer som før, i trinn 1.1.10, og justere APC cellene til en sluttkonsentrasjon på 2.4x10 6 celler / ml i RPMI-10.
- Stimulere celler og differensiere CD4 T-celler til Th1 en fenotype i en 5-dagers kultur.
MERK: Selv om vi presenterer her en protokoll for å forberede og bildebehandling Th1 effektorer generert fra naive CD4 T-celler, kan denne protokollen tilpasses for å skille de naive celler til en annen fenotype, eller to bruke andre celletyper, så som CD8 T-celler. Betingelser for priming og differensiering må bestemmes empirisk.- I hver brønn av en 24-brønners dyrkningsskål, kombiner 500 ul av de naive CD4 T-celler og 500 ul av de bestrålte APCer i hver brønn, for en total av 5 3x10 T-celler og APC 1.2x10 6 per brønn.
- Fremstille en oppløsning i RPMI-10 inneholdende 2 uM beslektet OVA peptidet, 20 U / ml rekombinant IL-2, 80 ug / ml anti-IL-4 (klon 11B11) og 40 ng / ml rekombinant IL-12 og filter ved anvendelse av en 0,2 mikrometer sprøyte filter. Legg 1 ml av denne oppløsningen til hver brønn av celler, for et totalt volum på 2 ml i hver brønn.
- Inkuber cellene i et 37 ° C inkubator ved 5% CO2 i 3 dager.
- På dag tre, dele kulturer ved forsiktig pipettering å resuspendere cellene og flytter 1 ml fra hver brønn inn i en ny kultur også. Bringe hver brønn til et sluttvolum på 2 ml ved tilsetning av 1 ml / brønn av RPMI-10 + 20 U / ml rekombinant IL-2. </ Li>
- Returnere platene til inkubatoren og tillate cellene å ekspandere inntil dag 5.
2. Overføring av celler og induksjon av Betennelse
NB: For optimale celletall for avbildning, bør 5x10 6 fluorescensmerkede Th1-celler overføres til hver mus i et totalvolum på 200 ul PBS. Celler som her er merket med det grønne fargestoff CFSE eller nær-rødt fargestoff CMTMR, selv om andre celleKurve for farvestoffer kan anvendes. CFSE og CMTMR-merkede celler kan være co-overført for å tillate sporing av to distinkte effektor CD4 populasjoner.
- Etikett effektor T-celler med CFSE
- Høste celler fra kulturskåler ved kraftig pipettering av cellene i hver brønn og overføring til et sterilt 50 ml sentrifugerør med en pipette. Tell cellene som i trinn 1.1.10, deretter sentrifuge og resuspender cellene 10 7 celler / ml i PBS + 5% NCS.
- Fortynn 5 mM stamløsning CFSE 1: 100 iPBS. Legg 110 mL CFSE løsning for hver 1 ml celler ved å plassere en dråpe av CFSE løsning på siden av røret og deretter hurtig gynge i røret og tilbake til grundig blanding.
- Cellene inkuberes i 5 min ved RT, og deretter slukke CFSE ved tilsetning av 5 ml kalvefosterserum (FCS) direkte til røret av celler. Bringe volumet til 50 ml med PBS + 5% norsk sokkel.
- Sentrifuger cellene og resuspender pelleten i 20 ml PBS + 5% NCS. Gjenta denne prosessen to ganger for å vaske cellene 3 ganger totalt. Tell cellene med et hemocytometer, som før, i trinn 1.1.10, og resuspender cellene i steril PBS ved 2,5 x 10 7 celler / ml for overføring til mus.
- Etikett effektor T-celler med CMTMR
- Høste cellene som ovenfor i trinn 2.1.1, og deretter telle, sentrifuger og resuspender cellene 10 7 celler / ml i RPMI-10.
- Tilsett 10 mM stamløsning CMTMR direkte til cellene i en sluttkonsentrasjon på 10 uM. Raskt pipette the celler til å grundig blande i CMTMR og hindre utfelling av fargestoffet.
- Inkuber 30 min i et 37 ° C vannbad. Vask cellene 3x i PBS + 5% NCS som før, i trinn 2.1.3-2.1.4. Telle og resuspender cellene i steril PBS ved 2.5x10 7 celler / ml for overføring til mus.
- Overføring av effektor T-celler til naiv 6-8 uker gamle BALB / c-mus.
- Tegn cellesuspensjonen (trinn 2.1.4 og 2.2.3) i en sprøyte, ta vare å fjerne alle bobler ved å holde sprøyten nålen side opp, forsiktig smekke på siden av sprøyten og beveger stempelet opp og ned, eventuelt .
- Plasser mus i et rent bur og varme forsiktig under en varmelampe inntil halevenen vises vasodilated. Plasser musen i en holdeanordning og tørk halen med en spritserviett. Sakte injisere 200 ul av cellesuspensjonen inn i den laterale halevenen. Det skal ikke være noen motstand mot injeksjon eller synlige bobler under huden.
- Fremkall dermal betennelse ved å immunisere med Complete Freund adjuvans (CFA)
MERK: I denne protokollen, er betennelse indusert ved intradermal injeksjon av CFA emulgert med enten beslektet eller ikke-beslektet antigen. Andre inflammatoriske modellene kan være substituert, selv om det antall celler som kreves for å overføre og tidspunktet for avbildning vil måtte justeres empirisk.- Forbered en 200 mM løsning av OVA peptid i steril PBS i en mikro tube. Pipetter en ekvivalent volum av CFA på toppen av peptidet løsning.
- Emulgere løsningen ved å trekke det inn i en 28 G1 / 2 insulinsprøyte og deretter stuper oppløsningen tilbake inn i mikrosentrifugerør, deretter gjenta denne handlingen omtrent 20 ganger. Når den er fullt emulgert, vil CFA og peptidet oppløsning danner en tykk og ugjennomsiktig blanding.
MERK: Det er viktig å bruke en fast nål insulinsprøyte for å danne emulsjon, som emulsjonen vil gå tapt i den døde plass i en ikke-fast needle sprøyte. - Test emulsjonen ved å slippe en liten mengde på vann plassert i en petriskål. Emulsjonen bør forbli intakt og ikke dispergere i vannet.
- Tegn emulsjon inn i en 300 mL 28 G1 / 2 insulinsprøyte og trykk ned kraftig i stempelet for å fjerne store luftbobler.
- Umiddelbart etter tilførsel av fluorescensmerkede effektor-T-celler, bedøve mus ved ip injeksjon av 2,2,2-tribromoethanol ved 240 mg / kg. Vurdere anestesi av en mild tå klype, administrere mer 2,2,2-tribromoethanol i trinn på 1 mg, om nødvendig.
MERK: andre godkjente anestetika kan erstatte 2,2,2-tribromoethanol. - Plasser et fingerbøll på venstre pekefinger og forsiktig ta tak i musen øre mellom venstre tommel og pekefinger med ventral øret vendt opp. Pass på å ikke øve for mye press på øret, som kan medføre mekanisk skade på huden.
- Skyv nålen som inneholder CFA emulsion inn i dermis, skrå siden opp, og sakte injisere 10 mL av emulsjonen inn i øret. Plassering av injeksjonen skal være i den ytre tredjedel av det ytre øret, litt ute av senter for å tillate optimal avbildning.
- Overvåk mus før bedøvelsen har slitt av og mus er i stand til å rette seg selv og er oppegående. Bilde mus 3 dager etter vaksinasjon, og gir tid for betennelse til å utvikle og de overførte T-celler til trafikk til øret dermis.
MERK: Mus kan ikke stå uten tilsyn mens under anestesi.
3. Klar Mouse for Imaging
- Forbered et kateter
- Fjern forsiktig metall nål fra en 30 G1 / 2 Tuberculin (TB) sprøytespissen med tang og rens av overflødig lim, ved hjelp av en dissekere omfang til å visualisere at limet er helt fjernet.
- Skjær tuppen av av en annen 30 G1 / 2 TB sprøyte nål, slik at den gjenværende kanyle er fortsatt patent ved visuell inspeksjon. Slip en 18 cm stykke av PE-10-slange for medisinsk bruk på trimmet nål, og forsiktig plassere metallet nålen omtrent 5 mm inn i den andre enden av slangen, noe som skaper et kateter.
- Skyll kateteret ved å fylle en 1 ml TB sprøyte med sterilt PBS, eventuelle luftbobler fjernes. Forsiktig kateteret på tuppen av sprøyten og skyver PBS forsiktig skjønt kateteret for å fjerne eventuelle bobler i produksjonsrøret.
MERK: når presser fluidum gjennom kateteret, er det viktig å holde kateteret på sprøyten for å forhindre fluidtrykk fra å skyve kateteret ut av sprøyten. - Plasser mus i et rent bur og varme forsiktig under en varmelampe inntil halevenen vises vasodilated. Anesthetize mus med en blanding av romluft og isofluran (5% induksjon, 1-2% vedlikehold, 2 l / min flow rate), levert gjennom nosecone forsamlingen som har blitt festet til isofluran vaporizer. Kontroller at musen er bedøvet with en mild tå klype. Trinnvis øke isofluran strømningsraten med 0,1% hvis bevegelse er observert. Dekk øynene med oftalmisk salve for å hindre uttørking og skader mens musen er bedøvet.
MERK: Det er viktig at mus aldri stå uten tilsyn mens bedøvet. Mus bør gjentas ofte for tilstrekkelig anestesi ved milde tå klype. - Immobilisere halen på basen med en pinsett, og tørk av halen med en spritserviett. Skyv kateter inn i laterale halevenen og sjekk åpenhet ved å trykke forsiktig på stempelet på sprøyten. Det skal ikke være noen motstand mot bevegelse, og ingen synlig bobling av PBS under huden hvis det er riktig plassert. Fest kateteret til halen ved å bruke 1-2 dråper cyanoacrylate vev lim på injeksjonsstedet og la tørke, ca 30 sek.
- trimme håret fra baksiden og sidene av øret med en saks nøye, tar seg ikke å skade ski. Trim værhår også. Ved hjelp av en bomullspinne, fukte innsiden av øret med PBS.
- Roter musen og øre på en 24 x 50 mm Antall 1,5 glass dekkglass. Ved hjelp av pinsett, forsiktig flate øret på dekkglass, å bevege musen om nødvendig for å sikre at øret er i flukt med glasset. Fjern overflødig PBS fra øret av blotting forsiktig med en vev tørk.
MERK: Pass på at du ikke trykker for hardt på øret, som den tynne huden kan lett bli ødelagt med overtrykk. - Ved hjelp av to par buede tang, gripe en ca 20 mm lange stykke stoff tape på langs på de øverste hjørnene. Plasser bunnen av båndet på dekkglass på toppen av musens øre og rulle båndet over resten av øret, presser overskudd hår ut av veien sammen med tang hvis det er nødvendig å feste den til øret dekkglass. Trykk forsiktig på båndet rundt øret med en tørr bomullspinne for å sikre en tett forsegling, tar seg ikke å trykke på øret selv.
- Fest bildebehandling plattformen til en 37 ° C varmeblokken med teip. Anvend vakuum fett på hver side av øret område på bildeplattformen. Roter musen til å plassere dekkglass på bildebehandling plattformen, ta vare å justere øret i sentrum av filten.
MERK: Unngå å få vakuum fett på tape, da dette vil føre til at det kommer løsrevet fra glass dekkglass. - Smekk isofluran nosecone inn i holderen på bilde plattform, slik at nosecone er sikker og helt dekker musens nesen. Spre vakuum fett under dekk av bestemt, men forsiktig trykke på dekkglass på bildebehandling plattformen med en ren, tørr bomullspinne.
- Feste dekkglass til plattformen med to 20 mm stykker av bånd og to lengre stykker av bånd viklet rundt det øvre parti av plattformen. Hvis noen luftbobler mellom øret og dekkglass, kan de forsiktig fjernes ved å trykke på øret nedenfra with et stykke brettet papir.
MERK: Det er viktig å ikke bruke papir som er for tykt eller trykke fast, da dette kan forårsake vev forvelling og skade, kompliserende resultater. - Flytt musen til mikroskopet scenen og sikre plattformen med teip. Pipe et dobbelt lag av vakuumfett på dekkglass rundt øret for å tjene som et reservoar for neddykking i vann objektiv.
- Pakk en vannfylt varmeteppe rundt musen gjennom bildebehandling plattformen. Fylle reservoaret med 37 ° C destillert vann. Sikre at alt er festet til stadiet med tape og at sprøyte av kateteret er lett tilgjengelig.
4. I Vivo Time-lapse Imaging og Intravenøs Antistoff Administration
MERK: Denne protokollen krever bruk av en multiphoton mikroskop utstyrt med et Ti: Sa lasersystem. Målet brukes er en 25x forstørrelse linse med 1,05 NA, festet med et objektive varmeapparat satt til 40 ° C. Den optimale temperatur for denne varmeapparatet ble bestemt empirisk for å være passende temperatur for å holde øret dermis ved 37 ° C, og kan måtte justeres for bruk i andre avbildningssystemer. Oppkjøpet Programvaren som brukes kan variere mellom instrumenter og justeringer i protokollen må kanskje gjøres for å jobbe på en annen måte konfigurerte systemer. Sørg for at bilder kan lagres i et format som er kompatibelt med alle ønskede analyseprogramvare.
- Lokal dermis gjennom okularene ved å plassere den objektive over midten av øret og senke målet like før den kommer i kontakt med overflaten av vannet i reservoaret. Ved hjelp av en ekstern lyskilde, se gjennom okularene og fortsetter å langsomt senke målet inntil overflaten av øret kommer i fokus. Senke den indre og ytre gardiner rundt mikroskop scenen.
- Bestem mikroskop innstillinger og finne et område for bildebehandling
- før Tenk degg, konfigurere laser for maksimal eksitasjon og deteksjon av de ønskede fluorophores ved å justere laser bølgelengde 900 nm i MP Laser Controller-vinduet, laser makt i Acquisition Innstilling: Laser vinduet, og PMT-spenninger i Image Acquisition kontrollvindu .
MERK: Denne fremgangsmåten bruker en eksitasjon bølgelengde på 900 nm med filtre for å oppdage andre harmoniske generasjon (420-460 nm), CFSE (495-540 nm), og CMTMR (575-630 nm). Andre konfigurasjoner kan anvendes for å detektere forskjellige fluoroforer som ønsket. - Sett mikroskop til 512 x 512 pikslers oppløsning, med en 2 usekunder / pixel holdetid i Acquisition Innstilling: Størrelse og Mode vinduer. Aktiver en live bildemodus for å la skanning gjennom vevet for et område av bildet ved å klikke på "XY repeat". Ideelt sett bør området være relativt ensartet, uten luftbobler, og unngå områder med tette hårsekker.
MERK: CFA emulsjon er sterkt autofluorescent i det grønne og near-rød kanaler og bør unngås. En optimal felt kan vanligvis finnes ca. 3 mm fra kanten av emulsjonen. Omtrent 10 - 100 celler som kan spores på et enkelt bilde. Hvis for mange celler er til stede, vil sporing vanligvis oppstår feil i forsøket på å skille tett plassert celler, noe som fører til kortere og / eller unøyaktige celle spor. - Når en passende bilde feltet er lokalisert, bestemme Z-regionen som vil bli fotografert ved å finne cellen "høyeste" i dermis, sette Z-posisjon til 0 ved å klikke på "Set 0" -knappen, og bla nedover i Z retning for å måle graden av celle dybde. Et avbildningsdybde på 35-75 um er typisk. Angi start- og sluttposisjonene i innstillingen Acquisition: Mikroskop vinduet. Juster instrument PMT-spenninger og lasereffekten i "lyse Z" vinduet for å optimalisere visualisering av cellene i hele dybden av bildefeltet.
MERK: Unngå å heve laser kraft over 25 mW ved prøven, kan så høye strømnivåer, føre til varmeskade og skade sterile til dermis. Den riktige maksimale effektnivået for hver av mikroskop vil variere og vil måtte bli målt. Det bør bemerkes at økende laser makt eller PMT-spenninger med vev dybde ikke tillater for kvantitativ sammenligning av bildets lysstyrke på forskjellige dybder i etteroppkjøpsanalyse. - Sjekk "Depth" og "Time" knappene under "Scan" -knappen i Image Acquisition kontrollvinduet. Still et Kalman filter for å skanne bildet 3 ganger per linje i Image Acquisition Control: Filtermodus vinduet og justere Z-slice dybde i Image Acquisition: Mikroskop vindu slik at det tar ca 1 min å fange en komplett stack, som nevnt i Timeview vinduet.
MERK: Intervallet mellom stabler bør ikke ta lenger enn ca 1 min, som lengre intervaller hindre sporing av raskt trekkende celler. Avhengig av the type celler som avbildes, kan dette intervallet må justeres for å tillate riktig celle sporing av analyse-programvare. Z-skiver bør ikke være mer enn 5 um. Vanligvis 15-18 Z-skiver mellom 2-5 mikrometer tykke er passende for en 1 min bildeintervall.
- før Tenk degg, konfigurere laser for maksimal eksitasjon og deteksjon av de ønskede fluorophores ved å justere laser bølgelengde 900 nm i MP Laser Controller-vinduet, laser makt i Acquisition Innstilling: Laser vinduet, og PMT-spenninger i Image Acquisition kontrollvindu .
- Fange en pre-antistoff time-lapse bilde
- Fange en 5 min time-lapse bilde av området for å vurdere stabiliteten av vev ved å sette antall repetisjoner til "5" i Acquisition Innstilling: Scan vinduet og klikke på "Scan" -knappen.
NB: Tissue "drift" kan være forårsaket ved å ikke tillate tilstrekkelig tid for øret å nå termisk likevekt, dårlig øre fremstillingen, eller kan være på grunn av lokal drift i en region av øret. Dersom 5 min bildet ikke er stabil, bilde en ny region i dermis. Hvis et annet bilde i en ny region er fortsatt ustabil, er det best å nøye gjenta øret forberedelse og bildebehandling fra trinn 3.6 med en frisk coverslip. - Hvis vevet er stabilt i 5 min image, samle en 30-45 min time-lapse bilde ved å sette antall repetisjoner til mellom 30 og 45 i Acquisition Innstilling: Timescan vindu, overvåking for eventuelle mindre vev drift som bildet er oppsamlet. Lagre filen i et format som er kompatibelt med analyseprogramvare som skal brukes.
MERK: På dette punktet i protokollen, trinn 4.2.2 - 4.3.2 kan gjentas til bilde flere steder i det samme øret. En enkelt muse bør ikke holdes bedøvet for lengre enn 4 timer, som døden er mer sannsynlig å skje.
- Fange en 5 min time-lapse bilde av området for å vurdere stabiliteten av vev ved å sette antall repetisjoner til "5" i Acquisition Innstilling: Scan vinduet og klikke på "Scan" -knappen.
- Injisere blokkerer antistoffer og ta en post-antistoff bilde.
- Tegn antistoff blandingen i en 1 ml TB sprøyte og ta ut nålen, og pass på å fjerne alle luftbobler. Trykk på stempelet, slik at antistoffløsning danner en "dråpe" i enden av sprøyten.
- Løft gardinene rundt scenen og finn kateteret. Fjern originalen PBS-Containing sprøyte fra kateteret. Uten å sette kateteret ned, nøye feste ny sprøyte som inneholder antistoffer. Hold enden av kateteret på sprøyten og injiser langsomt antistoffblandingen inn i kateteret. Pass på at det ikke er noen motstand mot injeksjon.
- Still kateteret ned og senke gardinene omgir mikroskop scenen. Merk injeksjonstidspunktet og umiddelbart begynne å samle en ny 20-40 min bildesekvens på samme sted med de samme instrumentinnstillinger som forhånds antistoff bilde. Lagrer filen i et egnet format for analyse programvare som skal brukes.
MERK: Mellom time-lapse bilder, observere musen for tilstrekkelig anestesi og pust. Det er ikke anbefalt å avbilde mer enn ett felt etter administrering av antistoffer, som det kan være variable priser klaring av antistoffet.
- Injisere fluorescens-merket dekstran å finne blodårer, vurdere kateter patency, og måle blood fartøy permeabilitet
- Forbered en 2 mg / ml løsning av fluorescens-konjugert dekstran (70000 MW) i 100 mL sterilt PBS og trekke i en sprøyte, fjerne eventuelle luftbobler.
- Ved bruk av samme teknikk som i trinn 4.4.1-4.4.2, plassere sprøyten på kateteret og injisere den dekstranoppløsningen intravenøst.
- Fang en enkelt stabel på 1024 x 1024 pikslers oppløsning ved å endre oppløsningen i innstillings Acquisition: Mode vinduet, med de samme PMT og laser innstillinger som for time-lapse bilder. Å samle bildet, fjern "Time" knappen under "Scan" -knappen, og deretter klikke på "Scan" -knappen. Denne 3D bildet vil tillate eksklusjons T-celler lokalisert i blodkar og vise at kateteret var patent og riktig satt inn. Spredningen av fluorescerende dekstran ut av skipene kan også brukes til å vurdere lokal vaskulær permeabilitet.
MERK: Denne høy oppløsning (1024 x 1024) statisk bilde blir brukt for presentation formål og kan i tillegg bli anvendt for analyse av vev arkitekturen i det samme område som de tidsintervall bilder. Alternativt kan en 512 x 512 bilde tas, noe som kan bli slått sammen med time-lapse bilder ved hjelp av bildeanalyse programvare. Tid lapse avbildning av dekstran administrering kan også være ønsket, avhengig av forsknings behovene til den enkelte laboratorier. I dette tilfelle, bør bildet settes opp som i trinn 4.2.3-4.3.2.
- Etter bildebehandling er ferdig, forsiktig fjerne mus fra under målet og pakke vannet teppe. Fjern dekkglass fra bilde plattformen ved å kutte båndet og forsiktig løfte glasset før det løsner. Mens musen er fortsatt bedøvet, løsner øret fra dekkglass. Hvis dette skal være en terminal prosedyre, avlive mus ved cervikal dislokasjon. Hvis du lagrer denne musen for gjentatt bildebehandling, returnere det til en ren bur atskilt fra andre mus og observere før musen kan rette seg selv og erambulerende. Når utvinnes fra anestesi, kan du bruke musen returneres til et bur med andre dyr.
- Importer bildefiler til et bilde analyseprogram og utføre ønskede korreksjoner. Unngåelse av ikke-lineære forbedringer og automatiserte glatte eller støyreduserende programmer og algoritmer anbefales. Vanligvis bilder trenger bare en mindre bakgrunnskorreksjon ved manuelt å øke den svarte punktet i bildet før analysen. Analyser imaging data ved hjelp av en automatisert celle-sporing program med manuell korreksjon, som i Overstreet, Gaylo et al 30.
MERK: Det er mange bildeanalyse suiter tilgjengelig, både proprietær og åpen kildekode, som kan brukes til å kvantifisere celle dynamikk fra multiphoton bildene stammer fra denne protokollen. Den nøyaktige fremgangsmåte for bildeanalyse og den optimale programvarepakker som skal brukes vil avhenge av de forsknings behovene til individuelle laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evnen til å studere immunresponser in situ uten å endre immun miljøet er viktig i å studere sanntids interaksjon av T-effektorceller med et betent vev. Avbildning av de intakte øret dermis til denne protokollen, skissert i figur 1A og B, gir mulighet for visualisering av overførte fluorescensmerkede T-effektorceller i dermal interstitium. Dette gjør både høy oppløsning (figur 1C) og time-lapse (figur 1D, Movie 1) bilder av effektor T-celle dynamikk i de betente dermis.
Figur 1. Høy oppløsning og 4D avbildning av T-effektorceller i intakt dermal interstitium. (A) Eksperimentell disposisjon. (B) Fotografi av en øre FORBEREDELSERed for bildebehandling med området av emulsjonen (svart stiplet linje) og optimal område for imaging (rød linje) angitt. (C) Maksimal 3D projeksjon av en høy oppløsning stack viser CFSE-merket Th1 celler (grønn), andre harmoniske signal fra fibrillar kollagen (blå) og Texas Red-dekstran merket blodkar (rød). Den hvite pilen indikerer ett av flere autofluorescent hårsekkene. Skala barer representerer 50 mikrometer (D) Trekk stier Th1-celler spores i 30 min i CFA-betent dermis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Denne avbildningsprotokollen krever bruk av en spesialisert bildeplattform som ble bygget i huset, samt en tilpasset nosecone for levering av inhalert anestesi under avbildning. Bildebehandling plattformen (figur 2A-B) består of en aluminiumbasisplate med et hevet midtparti. Dette reiste delen har en innfelt del foret med akryl følte for å gi støtte til øret uten å komprimere og potensielt skade den tynne vev. Geometrien av våre oppsett for bygging av en fleksibel og justerbar nosecone å levere inhalert anestesi under bildebehandling. Dette nosecone, som består av en modifisert mikrosentrifugerør koblet til en 50 mm seksjon av fleksibel slange (figur 2C), er festet på plass med en holder bestående av modifiserte mikrosentrifugerør (figur 2D) og festet til avbildnings plattformen via krok og løkke festeanordning . Bruken av krok og løkke festeanordning gjør det mulig for reposisjonering av nosecone sammenstillingen, slik at et av ørene av en mus kan avbildes, og kan være optimalt posisjonert for individuelle mus.
Figur 2. Equipment for intra bildebehandling. Custom-bygget bildebehandling plattformen i toppen (A) og side (B) visninger. Nosecone for isofluran administrasjon (C) og nosecone holderen (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Kateterisering av halevenen tillater kontinuerlig adgang til sirkulasjonen for å administrere antistoffer og andre små molekyler som kan diffundere ut av blodkar, eller større fluorescerende molekyler, slik som dekstran med høy molekylvekt til å merke blodkar. Etter administrering av 100 ug av anti-β 1 og anti-β 3 integrin blokkerende antistoffer gjennom kateteret, som tidligere bevegelige celler arrest i dermis (Film 2). Disse cellene har en redusert gjennomsnittlig hastighet etter antistoff administrasjon (figur 3A), samt en betydelig reduksjon i buktende indeks, forholdet mellom den totale forskyvning til den totale beltelengde (figur 3B).
Figur 3. Administrering av anti-β 1 og anti-β 3 antistoffer inhiberer Th1-celler migrasjon i CFA-betent hud. (A) Gjennomsnittlig hastighet av Th1-celler før og etter administrering av 100 pg anti-β 1 og anti-β 3 integrin blokkerende antistoffer. (B) Meandering indeks av Th1-celler før og etter antistoff blokade. Omtrent 100 celler belte er fra bildene før og etter antistoff blokkade fra en enkelt mus i en representativ eksperiment. Statistikk etter Mann Whitney.es / ftp_upload / 53585 / 53585fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fordi håret ikke er fjernet fra overflaten av øret, bildeartifakter fra håret er vanlig. Autofluorescence fra hårsekkene (Figur 4A) og skygging og autofluorescence fra overliggende hår (figur 4B) bør unngås der det er mulig som de kan skjule T-celler og forstyrre automatisert bildeanalyse programvare. Likeledes kan luftbobler som er fanget mellom øret flaten og dekkglass føre til bildeartifakter (figur 4C). Riktig fremstilling av øret skal minimere antallet og størrelsen på eventuelle gjenværende bobler.
Figur 4. Vanlige gjenstander fra hår autofluorescence og dårlig øre pregjøring. (A) autofluorescent hårsekker. (B) autofluorescent hår og hårsekker (grønn) og kollagen (hvit) med overliggende hår skygger, forårsaker mørke linjer i bildet. (C) Artifact fra en luftboble, viser kanten av ford, autofluorescent keratinized epidermis (stiplet linje). Skala barer representerer 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
I tillegg kan bruken av flere varmekilder føre til problemer med stabiliteten av vev på grunn av termisk utvidelse og sammentrekning. Feil termostatinnstillingene, for eksempel, kan føre til store svingninger i løpet av bildebehandling som kan gjøre tolkningen av resultatene vanskelig (Film 3). Det er viktig å finne de optimale innstillingene for ethvert system som gir en konstant temperatur og øker stabiliteten. UltimatEly, er en temperaturstyrt avbildnings kammer den beste måten å fjerne variasjon av endringer i temperatur.
Film 1. Th1-celler migrerer i CFA-betent dermis (Høyreklikk for å laste ned). 30 min time-lapse bilde som viser Th1-celler (grønn) migrerer i dermal kollagen nettverk (andre harmonisk generasjon, blå).
Movie 2. Th1 celler arrest ved blokade av β 1 og p 3 griner (høyreklikk for å laste ned). Cells (grønn) ble fotografert i 30 min før administrasjon av blokkerende antistoffer, og deretter avbildes i ytterligere 20 min på samme sted.
Movie 3. Svingninger fra en dårlig kontrollert varmeplate (Høyreklikk for å laste ned). 30 min time-lapse bilde av Th1 celler (grønn) og andre harmoniske generasjon (blå). Etter dette bildet ble oppsamlet, ble den varme plate som brukes funnet å ha en defekt termostat, forårsaker svingninger i temperaturen på bildeplattformen og påfølgende termisk utvidelse og sammentrekning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betydning
Her presenterer vi et komplett protokoll for 4D visualisering av overførte, antigenspesifikke effektorceller Th1-celler i de intakte museøre dermis. Denne fremgangsmåte gir fordeler i forhold til noen aktuelle bildediagnostikk av flere grunner. Av tenkelig ventrale øret dermis, er vi i stand til å gi slipp på hårfjerning som er nødvendig for bildebehandling protokoller som involverer andre hudområder. Selv om hårfjerning er vanligvis milde, de har vist seg å føre til avbrudd i hudbarrieren 42, en prosess som kan stimulere en immunrespons 43,44. Ved også å unngå invasive kirurgiske prosedyrer for å avsløre dermis eller hypodermis, hindrer denne protokollen skade-indusert betennelser og rask rekruttering av nøytrofile 37 og andre immunceller i dermis. Anvendelsen av et venekateter i dette systemet for å levere blokkerende antistoffer mot viktige molekyler som gjør det mulig for sanntids avlesning av de dynamic oppførsel av CD4 T-celler. Bruken av denne avbildning protokollen har avdekket kritiske krav for CD4 T-celle interstitiell motilitet 30 som ikke ble påvist i in vitro-systemene 8.
Kritiske trinn i prosedyren
Et viktig skritt i enhver tenkelig protokollen er å sikre en stabil vev forberedelse for bildebehandling. Det er viktig å sikre at det er nok PBS mellom øret og dekkglass på at det ikke er noen luftbobler og øret er i kontakt med glasset, men ikke så mye å bevirke at båndet blir de-klebet fra glasset. På samme måte unngår kontakt mellom båndet som holder dekkglass til plattformen, og en hvilken som helst vakuumfett vil hindre båndet fra å løsne over tid. Temperaturen må også holdes konstant for å unngå svingninger og drift av termisk sammentrekning eller utvidelse av plattform materialer.
Begrensninger og Modifikasjoner
45. Men, bosatt immun befolkningen i øret er forskjellig fra huden på flanken eller footpad 46 og musen øret har forskjellige vaskulære egenskaper sammenlignet med andre steder 47. Således, for noen anvendelser, sammenligning av øret avbildningsdata til andre hudområder kan være vanskelig.
Denne protokollen krever også den effektive overføringen av overførte T effektorceller ut av blodet og inn i dermis. Dette begrenser muligheten til å bruke celler som har feil i homing eller bloduttredelse som de ikke vil være i stand til å gå inn i mellomrommet. bloduttredelsekan omgås ved å injisere celler direkte inn i øret dermis 37,48, selv om dette vil føre til noen mekanisk skade og levering av celler på denne måten kan ikke rekapitulere lokalisering eller oppførsel av celler som gjennomgår in vivo bloduttredelse.
Det er også viktig å vurdere ved hjelp av ikke-pigmenterte resipientmus for bildebehandling eksperimenter, slik som BALB / c-stamme anvendt her eller Albino C57BL / 6- Tyr c-2J-mus. Melanin i pigmenterte mus, i tillegg til å være meget autofluorescent, varmes opp under til og med forholdsvis lav effekt eksitasjon fra en laser 37 multiphoton. Dette kan forårsake termisk skade på hud og påfølgende inflammasjon 36 eller fluoriserende speckling 31, noe som kompliserer resultater. Dette kan begrense fluoroforer som kan brukes i en multi-parameter avbildning eksperiment. Men kan noen svært lyse eller høyt uttrykte fluorescerende molekyler være effektivt spent på lav laser makt, allgrunn for effektiv visualisering i pigmenterte mus.
fremtidige søknader
Fordi dette er en ikke-invasiv prosedyre, kan det være lett tilpasses for longitudinelle studier på mus med seriebilde over lengre tidsperioder. Mens fluorescerende merking som beskrevet her vil falme over tidsperioder større enn 3-4 dager, bruk av endogent fluorescerende celler eller fluorescerende reporter celler eliminerer dette problemet. Faktisk har vi tidligere brukt denne protokollen til å spore i vivo- generert antigen-spesifikke effektorer peiling cytokin reportere, inkludert IFNy reporter Yeti 30,49 og IL-4 reporter 4get 50. Vi har i tillegg visualisert endogene CD4-celler i CD4-Cre ROSA26-stop-floxed EYFP fluorescerende reporter mus 30. Når de fluorescerende egenskapene til EYFP og andre fluorescerende proteiner skiller seg fra kjemiske fargestoffer som for eksempel CFSE, kan modifikasjoner av de bildedannende parametrene være behovfor effektiv visualisering. Endringer som øker pixel holdetid kan forbedre fluorescerende signal fra noen dim fluoroforer, og redusere lengden av tids lapse bilder kan redusere eventuelle fotobleking som kan observeres. 900 nm eksitasjon, har vi ikke tidligere observert betydelig fotobleking av CFSE, CMTMR, eller EYFP over korte bilde intervaller.
Selv om denne fremgangsmåten fokuserer på å måle dynamikken i CD4 effektor T-celle motilitet, er den ikke begrenset til denne anvendelse. Det arbeides for tiden pågår for å måle det dynamiske interaksjoner av effektor T-celler med antigenpresenterende celler gjennom bruken av fluorescerende reporter mus og injeksjon av fluorescently konjugerte antistoffer inn i dermis å merke celler eller vev strukturer før bildebehandling 51,52. I tillegg, mens denne protokollen viser bruken av kateteret for å levere blokkerende antistoffer mens avbildning, andre forbindelser, inkludert lavmolekylære inhibitorer, kanskal administreres. Til syvende og sist, gir denne protokollen en fleksibelt plattform for å måle immun dynamikk over tid, in vivo, i en ikke-invasiv måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker University of Rochester multiphoton mikroskop kjernefasilitet for å få hjelp med levende avbildning. Støttet av NIH AI072690 og AI02851 til DJF; AI114036 til AG og AI089079 til MGO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mice | Jackson Laboratories | 000651 | Mice used were bred in-house |
| DO11.10 mice | Jackson Laboratories | 003303 | Mice used were bred in-house |
| HBSS | Fisher | 10-013-CV | Multiple Equivalent |
| Newborn Calf Serum (NCS) | Thermo/HyClone | SH30118.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes |
| Guinea Pig Complement | Cedarlane | CL-5000 | |
| anti-CD8 antibody | ATCC | 3.155 (ATCC TIB-211) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-MHC Class II antibody | ATCC | M5/114.15.2 (ATCC TIB-120) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-CD24 antibody | ATCC | J11d.2 (ATCC TIB-183) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-Thy1.2 antibody | ATCC | J1j.10 (ATCC TIB-184) | Antibodies derived from this hybridoma |
| Ficoll (Fico/Lite-LM) | Atlanta Biologicals | I40650 | |
| PBS | Fisher | 21-040-CV | Multiple Equivalent |
| EDTA | Fisher | 15323591 | |
| biotinylated anti-CD62L antibody (clone MEL-14) | BD | 553149 | |
| streptavidin magnetic separation beads | Miltenyi | 130-048-101 | |
| MACS LS Separation Column | Miltenyi | 130-042-401 | |
| recombinant human IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| recombinant mouse IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| recombinant mouse IL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| anti-IFNg antibody (clone XMG 1.2) | eBioscience | 16-7311-85 | |
| anti-IL-4 antibody (clone 11b11) | eBioscience | 16-7041-85 | |
| RPMI | VWR | 45000-412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | 15303641 | |
| L-glutamine | Fisher | 15323671 | |
| 2-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| ovalbumin peptide | Biopeptide | ISQAVHAAHAEINEAGR-OH peptide | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo/HyClone | SV30014.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes |
| 24-well culture plate | LPS | 3526 | Multiple Equivalent |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | |
| CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| 28 G1/2 insulin syringes, 1ml | BD | 329420 | |
| 28 G1/2 insulin syringes, 300μl | BD | 309301 | |
| 27 G1/2 TB syringes, 1ml | BD | 309623 | |
| 30 G1/2 needles | BD | 305106 | |
| PE-10 medical tubing | BD | 427400 | |
| cyanoacrylate veterinary adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| heating plate | WPI | 61830 | |
| Heating plate controller | WPI | ATC-2000 | |
| Water blanket controller | Gaymar | TP500 | No longer in production, newer equivalent available |
| water blanket | Kent Scientific | TP3E | |
| Isoflurane vaporizer | LEI Medical | Isotec 4 | No longer in production, newer equivalent available |
| isoflurane | Henry Schein | Ordered through Veterinary staff | |
| microcentrifuge tubes | VWR | 20170-038 | Multiple Equivalent |
| medical tape | 3M | 1538-0 | |
| isoflurane nosecone | Built In-house, see Fig 2 | ||
| imaging platform | Built In-house, see Fig 2 | ||
| curved forceps | WPI | 15915-G | Multiple Equivalent |
| scissors | Roboz | RS-6802 | Multiple Equivalent |
| glass coverslips | VWR | Multiple Equivalent | |
| high vacuum grease | Fisher | 146355D | |
| cotton swabs | Multiple Equivalent | ||
| delicate task wipes | Fisher | 34155 | Multiple Equivalent |
| Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM upright microscope with Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser | Olympus | call for quote | |
| optical table with vibration control | Newport | call for quote | |
| 25x NA 1.05 water immersion objective for multiphoton imaging | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| objective heater | Bioptechs | PN 150815 | |
| Detection filter cube | Olympus | FV10-MRVGR/XR | Proprietary cube, can be approximated from individual filters/dichroics |
| anti-integrin β1 antibody (clone hMb1-1) | eBioscience | 16-0291-85 | Azide free, low endotoxin |
| anti-integrin β3 antibody (clone 2C9.G3) | eBioscience | 16-0611-82 | Azide free, low endotoxin |
| Texas Red Dextran (70,000 MW) | Life Technologies | D-1830 |
References
- Denucci, C. C., Mitchell, J. S., Shimizu, Y. Integrin function in T-cell homing to lymphoid and nonlymphoid sites: getting there and staying there. Critical reviews in immunology. 29 (2), 87-109 (2009).
- Gehad, A., et al. Differing requirements for CCR4, E-selectin, and alpha4beta1 for the migration of memory CD4 and activated T cells to dermal inflammation. Journal of immunology. 189 (1), 337-346 (2012).
- Park, E. J., et al. Distinct roles for LFA-1 affinity regulation during T-cell adhesion, diapedesis, and interstitial migration in lymph nodes. Blood. 115 (8), 1572-1581 (2010).
- Masopust, D., Schenkel, J. M. The integration of T cell migration, differentiation and function. Nature reviews. Immunology. 13 (5), 309-320 (2013).
- Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical journal. 104 (2), 322-331 (2013).
- Schon, M. P., Ludwig, R. J. Lymphocyte trafficking to inflamed skin--molecular mechanisms and implications for therapeutic target molecules. Expert opinion on therapeutic targets. 9 (2), 225-243 (2005).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Friedl, P., Entschladen, F., Conrad, C., Niggemann, B., Zanker, K. S. CD4+ T lymphocytes migrating in three-dimensional collagen lattices lack focal adhesions and utilize beta1 integrin-independent strategies for polarization, interaction with collagen fibers and locomotion. European journal of immunology. 28 (8), 2331-2343 (1998).
- Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases. Blood. 102 (9), 3262-3269 (2003).
- Lammermann, T., et al. Cdc42-dependent leading edge coordination is essential for interstitial dendritic cell migration. Blood. 113 (23), 5703-5710 (2009).
- Jacobelli, J., et al. Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions. Nature immunology. 11 (10), 953-961 (2010).
- Jacobelli, J., Bennett, F. C., Pandurangi, P., Tooley, A. J., Krummel, M. F. Myosin-IIA and ICAM-1 regulate the interchange between two distinct modes of T cell migration. Journal of immunology. 182 (4), 2041-2050 (2009).
- von Andrian, U. H. Immunology. T cell activation in six dimensions. Science. 296 (5574), 1815-1817 (2002).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296 (5574), 1876-1880 (2002).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (5574), 1869-1873 (2002).
- Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M., Germain, R. N. Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes. Science. 296 (5574), 1873-1876 (2002).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2604-2609 (2003).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427 (6970), 154-159 (2004).
- Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
- Bousso, P., Robey, E. Dynamics of CD8+ T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes. Nature immunology. 4 (6), 579-585 (2003).
- Henrickson, S. E., et al. T cell sensing of antigen dose governs interactive behavior with dendritic cells and sets a threshold for T cell activation. Nature immunology. 9 (3), 282-291 (2008).
- Bajenoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).
- Kawakami, N., Flugel, A. Knocking at the brain's door: intravital two-photon imaging of autoreactive T cell interactions with CNS structures. Seminars in immunopathology. 32 (3), 275-287 (2010).
- Wilson, E. H., et al. Behavior of parasite-specific effector CD8+ T cells in the brain and visualization of a kinesis-associated system of reticular fibers. Immunity. 30 (2), 300-311 (2009).
- Schaeffer, M., et al. Dynamic imaging of T cell-parasite interactions in the brains of mice chronically infected with Toxoplasma gondii. Journal of immunology. 182 (10), 6379-6393 (2009).
- Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nature medicine. 17 (6), 744-749 (2011).
- Matheu, M. P., et al. Imaging of effector memory T cells during a delayed-type hypersensitivity reaction and suppression by Kv1.3 channel block. Immunity. 29 (4), 602-614 (2008).
- Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
- Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nature protocols. 7 (2), 221-234 (2012).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Teijeira, A., et al. Lymphatic endothelium forms integrin-engaging 3D structures during DC transit across inflamed lymphatic vessels. The Journal of investigative dermatology. 133 (9), 2276-2285 (2013).
- Sen, D., Forrest, L., Kepler, T. B., Parker, I., Cahalan, M. D. Selective and site-specific mobilization of dermal dendritic cells and Langerhans cells by Th1- and Th2-polarizing adjuvants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8334-8339 (2010).
- Gray, E. E., Suzuki, K., Cyster, J. G. Cutting edge: Identification of a motile IL-17-producing gammadelta T cell population in the dermis. Journal of immunology. 186 (11), 6091-6095 (2011).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. The Journal of investigative dermatology. 131 (10), 2058-2068 (2011).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PloS one. 8 (2), 57135 (2013).
- Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).
- Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477 (7363), 216-219 (2011).
- Tozer, G. M., et al. Intravital imaging of tumour vascular networks using multi-photon fluorescence microscopy. Advanced drug delivery reviews. 57 (1), 135-152 (2005).
- Lee, J. N., et al. The effects of depilatory agents as penetration enhancers on human stratum corneum structures. The Journal of investigative dermatology. 128 (9), 2240-2247 (2008).
- Brandt, E. B., Sivaprasad, U. Th2 Cytokines and Atopic Dermatitis. Journal of clinical & cellular immunology. 2 (3), (2011).
- Strid, J., Hourihane, J., Kimber, I., Callard, R., Strobel, S. Disruption of the stratum corneum allows potent epicutaneous immunization with protein antigens resulting in a dominant systemic Th2 response. European journal of immunology. 34 (8), 2100-2109 (2004).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular research. 19 (3), 374-379 (1980).
- Tong, P. L., et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. The Journal of investigative dermatology. 135 (1), 84-93 (2015).
- Barker, J. H., et al. The hairless mouse ear for in vivo studies of skin microcirculation. Plastic and reconstructive surgery. 83 (6), 948-959 (1989).
- Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5307-5312 (2014).
- Stetson, D. B., et al. Constitutive cytokine mRNAs mark natural killer (NK) and NK T cells poised for rapid effector function. The Journal of experimental medicine. 198 (7), 1069-1076 (2003).
- Mohrs, M., Shinkai, K., Mohrs, K., Locksley, R. M. Analysis of type 2 immunity in vivo with a bicistronic IL-4 reporter. Immunity. 15 (2), 303-311 (2001).
- Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
- Cummings, R. J., Mitra, S., Lord, E. M., Foster, T. H. Antibody-labeled fluorescence imaging of dendritic cell populations in vivo. Journal of biomedical optics. 13 (4), 044041 (2008).
