Summary
We presenteren een protocol over hoe om high-throughput cryo-electron tomography gebruiken om hoge resolutie in situ structuren van moleculaire machines te bepalen. Het protocol maakt grote hoeveelheden gegevens te verwerken, vermijdt gemeenschappelijke resource bottlenecks en vermindert stilstand, zodat de gebruiker zich concentreren op belangrijke biologische vragen.
Introduction
Type III secretie systeem (T3SS) zijn essentiële virulentie determinanten voor vele Gram-negatieve pathogenen. De injectisome, ook bekend als de naald complex, is de centrale T3SS machine vereist voor directe translocatie van effector eiwitten van de bacterie in eukaryote gastheercellen 1, 2. De injectisome omvat een extracellulair naald, een basale lichaamstemperatuur, en een cytoplasmatisch complex ook bekende als sorteren complex 3. Eerdere studies hebben opgehelderd 3-D structuur van gezuiverd injectisomes van Salmonella en Shigella, evenals de atomaire structuur van grote basale lichaamseiwitten 4, 5. Recente in situ structuren van injectisomes van Salmonella, Shigella en Yersinia werden onthuld door cryo-ET 6 , 7. De cytoplasmatische complex, essentieel voor effector selectie en naaldsamenstel, is niet zichtbaar in deze structuren.
Cryo-ET is het most geschikte techniek voor beeldvorming van moleculaire machines in nanometer resolutie in zijn geboorteland cellulaire context (in situ). Toch is de haalbare resolutie van cryo-ET beperkt door de dikte van het monster. Om het nadeel te overwinnen, we afgebeeld intact injectisomes in een virulente Shigella flexneri stam die genetisch gemodificeerd om minicellen dun genoeg voor cryo-ET produceren. Een andere beperking van cryo-ET is de gevoeligheid van het monster om de straling geïnduceerd door de elektronenbundel, die zeer snel vernietigt de hoge-resolutie-informatie in het monster. Hierdoor zijn zeer lage doses voor individuele tilt-beelden, zodat een geschikte dosis kan worden verdeeld over de volledige tilt-series. Dit vermindert sterk de signaal-ruisverhouding (SNR) in het uiteindelijke reconstructie, wat het moeilijk maakt de structurele kenmerken van het onderwerp van de grote hoeveelheid ruis in het tomogram differentiëren en beperkt de resolutie die kan worden bereikt door cryo- ET. Conventional beeldverwerking zoals Fourier en real-space filters en downsampling kan worden gebruikt om het contrast te verhogen, maar ten koste van het uitfilteren van veel van de hoge-resolutie gegevens. Onlangs heeft sub-tomogram middeling het mogelijk om sterk toenemen van de SNR en vervolgens de uiteindelijke resolutie in sommige gevallen sub-nanometer niveau 8, 9. Een meer gedetailleerde analyse van de complexen mogelijk door computationeel extraheren duizenden sub-tomogram bevattende de aandachtsgebieden van de oorspronkelijke tomogram en vervolgens uitlijnen en het gemiddelde van de sub-tomogram te bepalen in situ complexe structuren met een hogere SNR en een hogere resolutie. Deze werkwijzen kunnen worden geïntegreerd met genetische benaderingen nog meer inzicht verschaffen in macromoleculaire samenstellingen en hun dynamische conformaties in de natieve cellulaire context.
In het algemeen tientallen of zelfs honderden duizenden sub-tomogram moeten worden gemiddeld om vast te stellen high-Resolutie structuren in situ. De overname van een voldoende aantal van de tilt-serie die nodig zijn om de productie van dit grote aantal sub-tomogram wordt al snel een bottleneck. De resulterende tilt-serie wordt vaak beïnvloed door-beam geïnduceerde verschuiving, stadium terugslag, alsmede vergroting, rotatie en scheve gebreken, die moeten worden opgelost om de tilt-serie in lijn voorafgaand aan de reconstructie brengen. De tilt-serie wordt meestal uitgelijnd door het bijhouden van goud de vaste markers, die traditioneel met de hand door middel van controle van de tilt-serie zijn geselecteerd, waardoor nog een ander knelpunt. Veel software pakketten zijn ontwikkeld voor geautomatiseerde tilt-serie overname door de computer gestuurde elektronenmicroscopen 10, 11, 12, tilt-serie uitlijning en wederopbouw 13, 14 en sub-tomogram gemiddeld 15-18. Aangezien deze pakketten verwerken discrete activiteiten in de werkstroom van cryo-ET het gewenst wordt om een hoger abstractieniveau bouwen in het proces systematisch stroomlijnen van de gehele regeling in één pijplijn. Daarom hebben we een software wrapper library "tomoauto" bedoeld om een aantal van deze verpakkingen te ordenen in een semi-automatische eenheid, waardoor de gebruiker eenvoudige bediening met behoud van volledige configuratie van elke component op een gecentraliseerde wijze. De bibliotheek is open-source, goed gedocumenteerd, voortdurend ontwikkeld en vrij beschikbaar voor gebruik, op maat ontwikkeling of verdere integratie door middel van een online remote source code repository (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).
Deze high-throughput cryo-ET pipeline is gebruikt om intact injectisomes in S. visualiseren flexneri minicellen. Een totaal 1.917 tomogram werden gegenereerd met behulp van deze methode, onthullen een hoge resolutie in situ structuur van de intacte machine waaronder het cytoplasmatische sortering platform bepaald door sub-tomogram gemiddeld 19. Samen met moleculaire modellering van wildtype en mutant machines, onze high-throughput pijplijn biedt een nieuwe weg voor de structuur en functie van het intacte injectisome begrijpen de natieve cellulaire context.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Minicel Voorbereiding
- S. maken flexneri minicellen, transformeren 1 pl plasmide pBS58, die constitutief uitdrukt Escherichia coli celdeling genen FtsQ, ftsA en ftsZ van een low-copy spectinomycine-resistente plasmide in 5 ul elektrocompetente streptomycine resistente serotype 5a (M90T-Sm) cellen door elektroporatie op 2,5 kV voor 5 msec bij 1 mm cuvettes.
- WINKEL minicel monsters bij -80 ° C in 15% glycerol in 1,5 ml microbuisjes cryogeen. Wanneer klaar voor gebruik, schraap ongeveer 5 ul van cellen uit het ontdooid microbuisjes met een pipet tip en schorten de cellen in 4 ml tryptische soja bouillon met spectinomycine toegevoegd aan 100 ug / ml concentratie. Grow O / N bij 37 ° C.
- Pipetteer 2 ml van de kweek van 1,2 in 200 ml tryptische soja bouillon met spectinomycine opnieuw toegevoegd aan 100 ug / ml concentraties. Groeien bij 37 ° C tot de late log-fase.
- Om minicellen, centrifuge verrijken200 ml van de kweek van 1,3 bij 1000 g gedurende 5 min. Giet het supernatans fractie in een nieuwe centrifugebuis en centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 10 min. Giet uit en de supernatantfractie ontdoen en meng de pellet met de resterende vloeistof met een pipetpunt en breng circa 100 ul van het mengsel tot pellets een 1,5 ml microcentrifugebuis.
2. EM Grid Voorbereiding
- Plaats een R2 / 2 essen carbon film 200-mesh koperen rooster koolstof side up op een glasplaatje.
Opmerking: A R2 / 2 200-rooster wordt geselecteerd om het aantal tilt-serie die kan worden ingesteld op verkrijgen in een vierkant rooster terwijl ondersteuning van het monster en het de rand van de koolstoffilm op het gebied van de camera te maximaliseren de gewenste vergroting. Fijnmaziger rasters en kleinere essen koolstoffilms zoals R1.2 / 1,3 400-mesh kan worden gebruikt voor monsters afgebeeld bij een grotere vergroting; grotere essen carbon films zoals R3.5 / 1 200-mesh kan gebruik wordend voor monsters afgebeeld in kleinere vergroting of de microfoto geen koolstof rand en essen koolstoffilms grotere afstand als R1 moet bevatten / 4 200 mesh kan worden gebruikt om te helpen bij het uitlijnen van de fase op het interessegebied en beschermen areas over-exposure in het richten en het bijhouden van routines. - Plaats de dia op het platform in een glimontlading apparaat.
OPMERKING: We gebruiken een interne inrichting waarin een anode en platform is machinaal in een vacuümexsiccator en wordt aangedreven door een hoogfrequent generator. Nadat vacuüm, sluit de hoogfrequent generator sonde naar de anode en zet de sonde gedurende 1 min glimontlading het raster. De tijd die nodig is om kwijting het net kan variëren van een paar seconden tot een minuut gloeien. Het variëren van de glimontlading tijd kan worden gebruikt om problemen met het monster concentratie en rasters die droog verschijnen zonder glasvocht ijs diagnosticeren. - Verwijder het rooster met een set van een tang, en sluit de tang afgesloten met een elastische ben.
- Voeg 100 ul van 10 nm colloïdaal goud oplossing voor de microcentrifugebuis met bereid 1,4 minicellen en meng door voorzichtig tikken de buis met een vinger. Met een nieuwe pipet plaats 4 pi van het mengsel op het rooster opgesteld 2,2.
OPMERKING: Colloïdaal goud is verkrijgbaar in diverse afmetingen en zorg moet worden genomen dat de grootte van het goud is groter dan 5 pixels gezien de pixelgrootte van de microfoto van het verkregen vergroting te verwerken, terwijl niet te groot om onduidelijke functies interessant. - Bereid de duik-vries apparatuur; Vul de buitenste bevriezing container met vloeibare stikstof en vul dan de binnenste kamer met vloeibaar ethaan. Bevestig de tang met het raster om de zuigerstang en vergrendel de zuigerstang in de hoge stand.
OPMERKING: Zie Iancu et al 20 voor een protocol beschrijft het gebruik van een commercieel duik-vries apparatuur.. - Dep het rooster door voorzichtig aanraken van een stuk filtreerpapier tHij vallen van het monster totdat de meniscus tussen het net en filterpapier scheidt en de wicking op het filter papier stopt, dan onmiddellijk de zuigerstang los, het bevriezen van de grid. Haal de tang van de zuigerstang en plaats het rooster in een houder net.
- Bereid de cryo-EM overslagstation door het invullen van de laadruimte en absorptie pomp container met vloeibare stikstof. Zodra de laadruimte is op vloeibare stikstof temperatuur plaats de houder net en een microscoop exemplaar cartridge in de laadruimte.
- Verwijder de borgring, die ofwel een kleine schroefdraad borgring op eerdere Polara microscopen of een C-stijl clip ring op latere modellen zorgvuldig; Plaats de EM rooster in de cartridge met behulp van een tang en dan zachtjes plaats de borgring terug op de cartridge het veiligstellen van de grid.
- Verwijder de meerdere specimen houder van de microscoop en bevestig deze aan het overslagstation. Plaats het monster cartridge in de houder met behulp van een tang een cartridged trekken de houder van de laadruimte en de overdracht van de verschillende monster houder terug naar de microscoop.
OPMERKING: Zie Chen et al 21 voor een visuele protocol detaillering 2,1-2,9..
3. High-throughput Geautomatiseerde Tilt-serie Collection
- Verzameling van Low-vergroting Maps
- Open een nieuw venster Navigator door te klikken op 'Open' in de 'Navigator' menu van SerialEM 10 (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
- Zoek rooster vierkanten die aanvaardbaar beeldvorming voorwaarden bevatten (dat wil zeggen, dun ijs, geen vervuiling, onderwerp van belang) met behulp van de tl-scherm bij lage vergroting (~ 2,300X voor minicel specimen).
OPMERKING: [Optioneel:. Deze stap kan worden geautomatiseerd met SerialEM door montaging het hele net, maar het kan sneller zijn om gewoon handmatig een paar gebieden] - Stel het podium om eucentrische hoogte door het kantelen van het monster houder tot 50 ° dan passende z-hoogte tot de xy vertaling van het podium is minimaal tussen de gekantelde en untilted uitzicht.
- Verplaatsen naar het midden van het plein rooster en klik op 'toevoegen Stage Pos' knop in het venster Navigator om de huidige fase positie op te slaan.
- Blijven stappen 3.1.1-4 boven totdat alle acceptabele raster pleinen podium posities zijn opgeslagen.
- Open een nieuwe montage MRC bestand door te klikken op 'Nieuwe montage' in het menu 'Bestand'. In de Montage Setup dialoogvenster dat opent, selecteer een aantal stukken in de X en Y dat de hele rooster plein (bijvoorbeeld 10 x 10 voor een standaard 200 rooster) zal verwerven. Gebruik een hoge binning zoals 8 en selecteer de 'Move Stage plaats van Shifting Beeld' en 'Ga correlaties gebruikt om stukken af te stemmen' radio knoppen.
- In het venster Navigator klikt u op de eerste fase positie en zet deze om te worden overgenomen door het controleren van de checkbox 'Acquire'. Herhaal dit voor elke fase positie in het venster Navigator.
- Open de Navigator Acquire Dialog door te klikken op 'Acquire op Points' in de 'Navigator' menu. Controleer de 'Acquire image map' en checkbox 'Rough eucentricity' en zorg ervoor dat alle andere selectievakjes zijn uitgeschakeld. Klik op 'Doorgaan' om een montage in elk stadium plaats te verzamelen.
- Tilt-serie Acquisition
- In het venster Navigator selecteert u een van de verworven kaarten en klik op de 'Load kaart' te klikken.
- In het venster Navigator klikt u op de 'Add Points' en selecteer de punten in de kaart waarop een tilt-serie te verwerven. Klik vervolgens op de 'Stop Points toevoegen' te klikken. Herhaal dit voor elke kaart verzameld.
- In het Camera menu 'Parameters' en definieer de parameters voor de Focus, Trial en Record modes. [Optioneel:. Dosis-gefractioneerde gegevens kunnen in de parameters voor de opnamemodus worden gespecificeerd]
- Selecteer een punt in het venster Navigator en controleer de 'Tilt-Series9; vakje. In het dialoogvenster Tilt-serie geopende venster selecteert u de gewenste parameters voor de tilt-serie collectie. Herhaal dit voor de rest van de geselecteerde punten in het venster Navigator, maar de kaarten niet selecteren.
- In het Navigator menu opnieuw selecteren van de 'Acquire op Points'. In de Navigator Acquire dialoogvenster kies 'Lijn punt', Autofocus 'en' Rough eucentricity 'als voorbereidende taken, en selecteer' Acquire tilt serie 'als de primaire taak, en selecteer' Sluiten kolom kleppen aan het einde 'van de kolom te sluiten wanneer alle van de punten zijn verzameld. Na te gaan van een tilt-serie zal worden verzameld op elk punt in elke kaart.
4. High-throughput Geautomatiseerde Tilt-serie Verwerking en Wederopbouw behulp Tomoauto
- Correctie van Beam-geïnduceerde Motion in Dose-gefractioneerde gegevens [optioneel]
OPMERKING: Tomoauto gebruikt MOTIONCORR 22 (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html) tot-beam veroorzaakte bewegingen verwijderen uit dosis gefractioneerde microfoto. NOTIONCORR 16 moeten op het systeem worden geïnstalleerd.- Met de originele tilt-serie, de output logboek van SerialEM 10 en de individuele dosis-gefractioneerde beelden allen in de huidige directory, in een terminal het commando:
dose_fractioned_to_stack <filename.st>
<Filename.st> is de naam van de tilt-serie te verwerken.
- Met de originele tilt-serie, de output logboek van SerialEM 10 en de individuele dosis-gefractioneerde beelden allen in de huidige directory, in een terminal het commando:
- Uitlijning en Reconstructie van Tilt-serie
OPMERKING: Tomoauto standaard gebruikt IMOD 13 (http://bio3d.colorado.edu/imod/) naar tilt-serie geautomatiseerde de vaste model generatie, uitlijning, de bepaling van het contrast transfer functie (CTF), CTF-correctie 23, behandelen en wederopbouw. Als alternatief hebben gebruikers de mogelijkheid om in tomoauto RAPTOR 24 te gebruiken (inbegrepen in IMOD) voor geautomatiseerde de vaste model generatie, CTFFIND4 25 (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) aan de CTF bepalen en tomo3d 26 (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) voor de wederopbouw of in combinatie van softwarepakketten door een configuratie. Deze configuratie alsook de parameters in elk pakket behandeld door een globale configuratie bestand dat kan worden bewerkt om de waarden het meest gebruikt in een laboratorium te passen terwijl de lokale configuratiebestanden kunnen ook worden gemaakt voor detail parameters voor een specifiek monster, inzameling instellen of individuele tilt-serie. Alle pakketten die willen gebruiken moeten op het systeem worden geïnstalleerd.- Met de tilt-serie in de huidige directory, in een terminal het commando
tomoauto --CTF --mode align = <filename.st> <fid_diam>
<Filename.st> is de tilt-serie worden verwerkt en <fid_diam> de Diameter van de vaste markers in nanometer. Dit commando zal lijn en schat de CTF van de tilt-serie automatisch. Het is mogelijk om CTF verwerking overslaan door het verwijderen van de --CTF optie uit de opdracht. - Inspecteer de uitgelijnde tilt-serie visueel te flagrante fouten in de uitlijning verwerking en inspecteer de geschatte CTF door het uitvoeren van de commando's:
3dmod <filename> .ali
submfg <filename> _ctfplotter.com
respectievelijk, waarbij <bestandsnaam> de naam van de tilt-serie zonder suffix. Controleer ook de uitgang van de tomoauto commando om de gemiddelde resterende fouten gegenereerd door de uitlijning, die kwantitatief statistiek van aanpassing kwaliteit te zien. - Gegeven een acceptabele uitlijning te gaan verwerken door het uitvoeren van de opdracht:
tomoauom --CTF --mode = reconstrueren <filename.st> <fid_diam>
met dezelfde gebruiker vervangingen als in 4.2.1. Dit commando zal de CTF corrigeren, wist de vaste markers van de tilt-serie en bereken de wederopbouw. Weer CTF verwerking kan worden overgeslagen als in 4.2.1. - [optioneel] Voor de visuele inspectie stap overslaan en volledig automatiseren van de verwerking en de wederopbouw van de opdracht uit te voeren
tomoauto --CTF <filename.st> <fid_diam> - [optioneel] Als u een specifieke lokale configuratie te gebruiken, raadpleegt u de tomoauto documentatie over hoe een lokaal configuratiebestand te genereren, en dan is het commando
tomoauto [opties] -L <local_config> <filename.st> <fid_diam>
waarbij <local_config> is de naam van de lokale configuration bestand.
- Met de tilt-serie in de huidige directory, in een terminal het commando
5. Sub-tomogram Middelingstijd
LET OP: We gebruiken de i3 pakket 15 (http://www.electrontomography.org/) om sub-tomogram middeling experimenten te verwerken, maar het protocol beschreven geldt in het algemeen voor de meeste beschikbare sub-tomogram middeling software packages16to proces sub-tomogram middeling experimenten, maar het protocol beschreven geldt in het algemeen voor de meeste beschikbare sub-tomogram middeling softwarepakketten 16-18.
- Met de gereconstrueerde tomogram in de huidige directory het openstellen van de tomogram voor deeltjesfysica plukken door het uitvoeren van de opdracht:
tomopick <filename> .rec
waarbij <bestandsnaam> is als in 4.2.2. In het venster dat opent met de linker muisknop te klikken op de eerste de basale lichaam en dan de naald om een injectisome selecteren en gebruik de pijlen omhoog en omlaag-toetsen om riff door het plakken van de tomogram. Selecteer alle zichtbare injectisomes op deze manier. Deze slaat de coördinaten in een tekstbestand waarin de lange as van de structuur en het schatten van twee van de drie Euler hoeken beschrijft de oriëntatie van de structuur. - Computationeel extract 400 3 voxel kubussen tomogram gecentreerd op het middelpunt van de gedefinieerde lengteas door het commando:
clip resize Cx <x> -CY <y> -CZ <z> -IX 400 -iy 400 -iz 400
<bestandsnaam> .rec <filename> _001.mrc
waarbij <x>, <y>, <z> zijn het middelpunt coördinaten van de structuur en <filename> is als in 4.2.2. De grootte van de geëxtraheerde kubus dient te variëren door de structuur en de vergroting gebruikt en groot genoeg om de structuur van belang, die dit monster 400 3 voxels afdoende omsluiten moeten zijn. - Down-monster (bin) de sub-tomogram met een factor vier tot de rekentijd voor de eerste lijn te verminderen door het uitvoeren van de opdracht:
binvol -b 4 <filename> _001.mrc <filename> _001.bin4.mrc
waarbij <bestandsnaam> is als in 5.2. - Breng de bepaald Euler hoeken om sub-tomogram en bereken het mondiale gemiddelde op de oorspronkelijke sjabloon te produceren door het uitvoeren van de opdracht.
I3totsum.sh - Af te stemmen en te classificeren down-bemonsterd sub-tomogram met een binaire indeling masker van het cytoplasmatische gebied. Het uitvoeren van sub-tomogram middeling in Fourier ruimte om de ontbrekende wig artefacten kenmerk van tomografie minimaliseren. Voor binning 4 data, gebruik dan SAMPFACT = "4 4 4".
i3mramsacls.sh - Herhaal stap 5.5 met behulp van sub-tomogram down-bemonsterd met een factor twee (SAMPFACT = &# 34; 2 2 2 ") en nogmaals met de originele data (SAMPFACT =" 1 1 1 ").
i3mramsacls.sh
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Monsters van minicellen S. flexneri werden ingezameld en verwerkt zoals getoond in de schematische figuur 1 via tomoauto na de pijpleiding gedetailleerd in figuur 2. Tilt-serie werden verzameld met behulp SerialEM 10, die zorgt voor high-throughput-tilt series verwerving punten door de gebruiker aangewezen lage vergroting montage maps (figuur 3). Microfoto's werden verzameld met behulp van dosis-fractionering mode op een direct-detectieapparaat camera-beam veroorzaakte bewegingen 22 (figuur 4) te beperken. Tomoauto coördineert motion correctie nemen van een verzameling van de dosis-gefractioneerde micrografen verwerken elk met MOTIONCORR 22 en assembleert de resultaten in een tilt-serie verder te worden verwerkt (Film 1).
De meest algemene toepassing van tomoauto is Automatiseringc uitlijning van een eerste tilt-serie. Tomoauto samenstelt sequentiële uitvoering van de noodzakelijke commando's IMOD 13 tot grof uitlijnen van de tilt-serie en een eerste referentiemerkteken model genereren volgen de colloïdale gouddeeltjes in het monster, die op hun beurt gebruikt om de uiteindelijke uitlijning genereren. De nauwkeurigheid van het referentiemerkteken model is essentieel voor de kwaliteit van de gereconstrueerde tomogram, en dus de gebruiker kan visueel de automatisch berekende referentiemerkteken model alvorens reconstructie of achteraf tilt-serie die handmatig moeten worden verwerkt identificeren. Figuur 5 toont twee tilt-serie grof uitgelijnd en vastberaden de vaste model zoals gegenereerd door tomoauto. Figuren 5A, C tonen de untilted afbeeldingen en in zowel de vaste juiste model met model punten gericht op de vaste markers is. De figuren 5B, D tonen de overeenkomstige kantel- series bij 50 graden en terwijl het model in figuur 5B figuur 5D zijn afgeweken van de overeenkomstige gold markers en het model is geschikt voor fijne instelling. Deze fout kan kwantitatief worden gemeten als het gemiddelde resterende fout tussen het midden van het model punt en de waarschijnlijke centrum van de goud marker en tomoauto kan worden geconfigureerd om de gebruiker te waarschuwen als de gemeten fout een door de gebruiker gedefinieerde drempel overschrijdt inspectie versnellen. Tilt-serie die onvoldoende automatisch afgestemd kan dan met de hand worden afgestemd. We vinden dat tomoauto succes in lijn ongeveer 80% -90% van onze verzamelde tilt-serie (Film 2).
Na een tilt-serie met succes is afgestemd, moet worden gereconstrueerd in de uiteindelijke tomogram. Tomoauto is zo ontworpen dat de gebruiker IMD 13 te gebruiken of tomo3d 26 de uiteindelijke reconstructie te genereren. Wij gebruiken momenteel tomo3d om te profiteren van de verschillende functies in de moderne multi-core computer processing units (CPU's) om sterk verminderen van de reconstructie tijd. De uiteindelijke tomogram zoals getoond in figuur 6 en film 3 is een 3-D volume van de afgebeelde monster die vervolgens kan worden gebruikt voor mobiele annotatie van segmentatie of sub-tomogram gemiddeld hogere informatie oplossing van de moleculaire machinerie in het monster te verkrijgen. Sub-tomogram middeling vergroot het SNR en vermindert de door de ontbrekende wig door het middelen van de hoge geluidsniveaus in individuele tomogram met gebruikmaking van het grote aantal sub-tomogram op een goed verdeelde reeks willekeurige oriëntaties met betrekking tot de kunstvoorwerpen ontbrekende wig artefacten te beperken en het verbeteren van de uiteindelijke resolutie. De 2.7nm sub-tomogram gemiddelde van de intacte S. flexneri T3SS wordt getoond in figuur 7 zoals gedeponeerd in de EMDB (EMD-2667), waarvan de grote verbetering kunnen met deze techniek co toontmpared de injectisome weergegeven in een tomogram in figuur 6B.
Figuur 1. Schematische weergave van high-throughput cryo-electron tomography. Een vloeibare suspensie wordt snel op EM rooster en een reeks tilt-series bevroren wordt opgevangen door een geautomatiseerd computergestuurde elektronenmicroscoop. De verkregen microfoto worden automatisch verwerkt met behulp tomoauto het tomogram te genereren. De laatste stap hier een gesegmenteerd S. flexneri minicel van een tomogram gegenereerd door dit protocol van Hu et al. 2015 15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Stroomschema van tomoauto proces. Een uitsplitsing van de tomoauto workflow laat zien hoe gegevens uit een verzameling van de dosis-gefractioneerde microfoto de hele weg naar een definitieve sub-tomogram gemiddelde wordt verwerkt. Deelproces symbolen detail de taken die coördinaten om input te verwerken door het uitvoeren van de geconfigureerde juiste software tomoauto. Datasymbolen tonen output doorgaans niet door de gebruiker, terwijl document en multi-document symbolen tonen de uitgang daadwerkelijk door de gebruiker gehanteerd. Eindelijk weer symbolen laten zien waar tussenkomst van de gebruiker optreedt in de workflow. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Batch tilt-serie overname met SerialEM Navigator. Posities van montage kaarten worden opgeslagen als podium posities (getoond selection) in de Navigator-venster lijst getoond aan de linkerkant van het scherm, en de op dat moment geladen kaart wordt weergegeven in de buffer venster, samen met de geselecteerde punten numeriek gelabeld met een rood kruis toegevoegd aan de kaart voor overname. Acquisitie punten worden vermeld door het etiket in het venster Navigator en kan worden ingesteld op het verwerven van het gebruik van de optie "Tilt-serie". Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Effect van motion-correctie-gefractioneerde dosis data. (A) toont een untilted en ongecorrigeerde micrograph, en de beweging gecorrigeerde beeld (verwerkt door MOTIONCORR) wordt getoond in (B), is het contrast iets verbeterd na correctie. Improvement Meer kennelijk te zien door te kijken naar de Fourier-transform van de microfoto voor (C) en na (D) bewegingscorrectie. Beelden EH tonen dezelfde informatie maar met een microfoto gekanteld 60 graden, waarbij het contrast wordt verminderd en Thon ringen zichtbaar in C en D niet meer zichtbaar bij hoge tilt. Schaalbalk 250 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Goede en slechte resultaten van tomoauto geautomatiseerde tilt-serie uitlijning. (A) Een untilted ruwweg in lijn micrograph en de vaste model geproduceerd automatisch met behulp tomoauto. (B) De vastgestelde de vaste model bij 50 graden kantelen. Het model past nog steeds goed en is gecentreerd op de juiste vertrouwensmerken. (C, D) (A, B) respectievelijk ingezoomd op de boxed gebied. Dit tilt-serie werd in lijn met een gemiddelde resterende fout van 1,06 pixels. (E) Een untilted microscoop en de vaste model van een ander tilt-serie en (F) de serie op 50 graden kantelen. Hier zien we dat model volgen verschillende vertrouwensmerken (getoond in rood) verloren en dit representeert een slechte geautomatiseerd tracking. (G, H) Toont het model (E, F) respectievelijk ingezoomd op het omkaderde gebied. Dit tilt-serie werd in lijn met een gemiddelde resterende fout van 3,51 pixels en moest worden verwerkt door handmatige uitlijning van de serie. (A) Schaal bar 500 nm (C) Schaal bar 50 nm. Klik hier om een grotere versie te bekijken dit cijfer.
![Figuur 6]("/files/ftp_upload/53608/53608fig6.jpg")
Figuur 6. Tomogram automatisch gegenereerd door tomoauto. (A) Dit toont een projectie van zeven segmenten van het centrum van de reconstructie van de tilt-serie weergegeven in figuur 4A. Schaalbalk 250 nm. (B) Een ingezoomd in het licht van de boxed gebied (A), het weergeven van een intact injectisome. Schaalbalk 100 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. Sub-tomogram gemiddelde van intacte S. flexneri type III secretie systeem. (A) centrale deel van de 2,7 nm sub-tomogram gemiddelde van de intacte S. flexneri T3SS van EMDB (EMD-2667). (B) Volledige projectie langsde X-as van het volume. (C) isosurface weergave van het volume bekeken met een contour drempel van 130 in IMOD. Schaal bar 5 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Film 1: Animatie van unaligned tilt-serie (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden). Deze animatie loopt door de tilt-serie zoals oorspronkelijk verzameld door SerialEM. Translationeel verschuivingen zijn gemakkelijk te herkennen door de grillige pad van de individuele ijkpuntmarkers van beeld tot beeld, en deze verschuivingen samen met minder opvallend gebreken moeten worden gecorrigeerd voordat de tilt-serie kan worden gereconstrueerd.
![Movie 2]("/files/ftp_upload/53608/53608Movie2.jpg")
Film 2: Animatie van uitgelijnde tilt-serie (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden). Deze animatie loopt door dezelfde microfoto weergegeven in film 1 na automatische uitlijning door tomoauto. De grillige paden van ijkpuntmarkers volgt nu een gladde baan door de tilt-serie en de tilt-as verticaal is uitgelijnd ten opzichte van de kijker.
Movie 3:. Animatie van gereconstrueerde tilt-serie (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden) Deze animatie loopt door het in figuur 6 gegenereerd nadat automatische reconstructie van de tilt-serie weergegeven in film 2 b tomogramy tomoauto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De high-throughput hier beschreven methode ons in staat om 1917 cryo tilt-serie te verwerken en produceren meer dan 4.500 sub-tomogram van de intacte S. flexneri injectisome 19. De verzamelde gegevens tot de gedetailleerde karakterisatie van in situ injectisome, waaronder het cytoplasmatische sorteren complex. De werkwijze werd eveneens toegepast om verschillende mutantcellen visualiseren specifieke deletie van vermoedelijke eiwitcomponenten, die hielp verhelderen de samenstelling van het sorteren van het platform injectisome. Onze werkwijze verschaft nieuwe wegen om de structuur-functie relatie van de injectisome onderzoeken. Dientengevolge werd de nieuwe geëffend voor verdere dissectie van de onderliggende mechanismen T3SS-gemedieerde secretie en pathogenese.
De hier gepresenteerde protocol beschrijft high-throughput cryo-ET van intacte S. flexneri, maar is toepasbaar op elk project geschikt voor cryo-ET. Deze werkwijze is gebruikt in de structural karakterisatie van de flagellaire motor van Borrelia burgdorferi 27, het infecteren van E. coli bacteriofaag T7 minicellen van 28 en chemoreceptor arrays in E. 29 coli. Door het verzamelen van grote datasets te vergemakkelijken, is het mogelijk om meerdere mutanten evenals een grote aantal voorwaarden gevolgtrekkingen van dynamische processen toe zoals machineassemblage 27 en de voortgang van faaginfectie 28 screenen. Door het verzamelen van meerdere softwarepakketten en het toestaan voor volledige controle over de uitvoering van de verwerking, kunnen gebruikers verschillende combinaties van pakketten aan te passen voor een optimaal resultaat. Chen et al. 21 eerder gepubliceerde een soortgelijk protocol beschrijft gegevens verzamelen met behulp van het softwarepakket Leginon 12 en automatiseren van tilt-serie verwerken met behulp IMOD 13 en RAPTOR 24. Het huidige protocol vult deze methode detaillering een alternatieve collecting en verwerken van gegevens, terwijl ook zien hoe veel van de technologie en de procedure heeft gevorderd, gedreven door de toegenomen aandacht voor een hoge resolutie door middel van sub-tomogram gemiddelde, met de dosis-gefractioneerde data, geautomatiseerde CTF schatting en correctie, en meer robuuste automatische uitlijning routines binnen IMOD 13. Terwijl het vorige protocol gaat in visuele detail met de nadruk op het verzamelen van gegevens, richt deze methode op de details van de verwerking van de verzamelde gegevens.
High-throughput methoden zorgen voor enorme collectie van gegevens die het gebruik van de microscoop en computer middelen te maximaliseren, terwijl het beperken van de hoeveelheid vervelende handleiding interventies die vertragen het project fungeren als een belangrijk knelpunt. The wrapper library tomoauto is ontworpen om volledige configuratie van alle parameters die in elk pakket op eenvoudige en gecentraliseerde wijze toestaan. Zodra een geschikte configuratie is vastgesteld, dan is het gemakkelijk om de instellingen op hele dataset. Een meerderheid van de tilt-serie kunnen worden verwerkt met aanvaardbare resultaten (Figuur 4A), terwijl een kleine deelverzameling moet handmatig verwerkt. Deze tilt-serie zijn meestal minder ideale overnames geplaagd door overmatige beeldverschuiving, slecht contrast, of een gebrek aan voldoende ijkpuntmarkers waarop de automatische volgen de vaste routine zorgt ervoor om te falen (Figuur 4B). Om de best mogelijke tomogram te verkrijgen, moet een uitgebreide zorg worden genomen bij elke cruciale stap van monstervoorbereiding, beeldacquisitie, beeldverwerking.
Verdere ontwikkelingen in high-throughput cryo-ET zoals geautomatiseerde sub-tomogram winning door template matching en de integratie van moderne sub-tomogram middeling softwarepakketten zoals Dynamo in bestaande workflow pijpleidingen als tomoauto worden nu onderzocht. De recente komst van nieuwe-generatie directe detectie apparaat camera's heeft belangrijke verbeteringen in het verhogen tilt-serie SNR en het mogelijk maken more consistente CTF bepalen vanwege de hogere efficiëntie van de detector. Het gebruik van nieuwe full goud raster-types kunnen tilt-serie collectie gebreken verminderen, het verbeteren van de slaagkans voor automatische tilt-serie verwerking en reconstructie met minder behoefte aan handmatige tussenkomst 30. Eindelijk met de nu alomtegenwoordige gebruik van de computer clusters en grafische verwerkingseenheden (GPU's) naar parallelliseren en te versnellen grote dataset verwerking, de ontwikkeling van pijpleidingen dat deze systemen gebruik kunnen maken wordt binnenkort hopelijk in staat zijn om uitvoering te verkorten van dagen tot uur, biedt gebruikers zelfs nog minder downtime tussen experiment design en zinvolle analyse van gegevens, terwijl nog steeds toe dataset grootte en het bereiken van hogere resoluties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij danken Dr. William Margolin voor commentaar. We zijn dankbaar voor de steun op SerialEM van Drs. David Mastronarde en Chen Xu. DM, BH en JL werden ondersteund door Grant R01AI087946 van het Nationaal Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekten, subsidies R01GM110243 en R01GM107629 van het National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) en Grant AU-1714 van de Welch Foundation. De directe elektron detector werd gefinancierd door de National Institutes of Health Award S10OD016279.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Tyrptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| Electroporation Apparatus | Bio-rad | 165-2100 | |
| 1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
| 1.5 ml Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) |
Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
| Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | Used in In-House Glow Discharge Device |
| High-Frequency Generator | Electro-Technic Products | BD-10A | Used in In-House Glow Discharge Device. CAUTION: This device generates high voltages. |
| Centrifuge | |||
| Forceps | Dumont (Electron Microscopy Sciences) |
72705-D | Style 5 Anti-magnetic |
| Colliodal Gold | Aurion | BSA 10nm | |
| Filter Paper | Whatman | #2 | |
| Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| Nitrogen | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| Plunger Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Cryogenic Grid Storage Box | Electron Microscopy Sciences | 71166-30 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) |
|
| Direct Detection Device Camera | Gatan | K2 Summit | |
| Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
| Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Alignment Software | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo | |
| Automatic Fiducial Marker Modelling Software | IMOD | Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto) |
|
| CTF Determination Software | IMOD | Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto) |
|
| Tilt-Series Reconstruction Software | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo | |
| Tilt-Series Automated Processing Software | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| Particle Picking Software | i3 | http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD | |
| Subvolume Averaging Software | i3 | Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org |
References
- Cornelis, G. R. The type III secretion injectisome. Nat. Rev. Microbiol. 4 (11), 811-825 (2006).
- Galan, J. E., Wolf-Watz, H. Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).
- Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
- Schraidt, O., Marlovits, T. C. Three-dimensional model of Salmonella's needle complex at subnanometer resolution. Science. 331 (6021), 1192-1195 (2011).
- Hodgkinson, J. L., et al. Three-dimensional reconstruction of the Shigella T3SS transmembrane regions reveals 12-fold symmetry and novel features throughout. Nat. Struct. Mol. Biol. 16 (5), 477-485 (2009).
- Kudryashev, M., et al. In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injectisome. eLife. 2, e00792 (2013).
- Kawamoto, A., et al. Common and distinct structural features of Salmonella injectisome and flagellar basal body. Scientific Reports. 3, 3369-3369 (2013).
- Briggs, J. A. Structural biology in situ-the potential of subtomogram averaging. Curr. Opin. Struct. Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
- Schur, F. K., Hagen, W. J., de Marco, A., Briggs, J. A. Determination of protein structure at 8.5Å resolution using cryo-electron tomography and sub-tomogram averaging. J. Struct. Biol. 184 (3), 394-400 (2013).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152 (1), 36-51 (2005).
- Zheng, S. Q., et al. UCSF tomography: an integrated software suite for real-time electron microscopic tomographic data collection, alignment and reconstruction. J. Struct. Biol. 157 (1), 138-147 (2007).
- Suloway, C., et al. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J. Struct. Biol. 167 (1), 11-18 (2009).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt-series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106 (3), 240-254 (2006).
- Winkler, H., Zhu, P., Liu, J., Ye, F., Roux, K. H., Taylor, K. A. Tomographic subvolume alignment and classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. J. Struct. Biol. 165 (2), 64-77 (2009).
- Nicastro, D., Schwartz, C. L., Pierson, J., Gaudette, R., Porter, M. E., McIntosh, J. R. The Molecular Architecture of Axonemes Revealed by Cryoelectron Tomography. Science. 313 (5789), 944-948 (2006).
- Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. J. Struct. Biol. 178 (2), 139-151 (2012).
- Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. J. Struct. Biol. 178 (2), 177-188 (2012).
- Hu, B., et al. Visualization of the type III secretion sorting platform of Shigella flexneri. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (4), 1047-1052 (2015).
- Iancu, C. V., et al. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat. Protoc. 1 (6), 2813-2819 (2007).
- Chen, S., et al. Electron Cryoelectrontomography of Bacterial Cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat. Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Xiong, Q., Morphew, M. K., Schwartz, C. L., Hoenger, A. H., Mastronarde, D. M. CTF determination and correction for low dose tomographic tilt series. J. Struct. Biol. 168 (3), 378-387 (2009).
- Amat, F., Moussavi, F., Comolli, L. R., Elidan, G., Downing, K. H., Horowitz, M. Markov random field based automatic image alignment for electron tomography. J. Struct. Biol. 161 (3), 260-275 (2008).
- Rouhou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. bioRxiv. , (2015).
- Agulleiro, J. I., Fernandez, J. J. Tomo3D 2.0 – Exploitation of Advanced Vector eXtensions (AVX) for 3D reconstruction. J. Struct. Biol. 189 (2), 147-152 (2015).
- Zhao, X., Zhang, K., Boquoi, T., Hu, B., Motaleb, M. A., Miller, K., James, M., Charon, N. W., Manon, M. D., Norris, S. J., Li, C., Liu, J. Cryo-Electron Tomography Reveals the Sequential Assembly of Bacterial Flagella in Borrelia burgdorferi. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14390-14395 (2013).
- Hu, B., Margolin, W., Molineux, I. J., Liu, J. The Bacteriophage T7 Virion Undergoes Extensive Structural Remodeling during infection. Science. 339 (6119), 576-579 (2013).
- Liu, J., Hu, B., Morado, D. R., Jani, S., Manson, M. D., Margolin, W. W: Molecular architecture of chemoreceptor arrays revealed by cryoelectron tomography of Escherichia coli minicells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (23), e1481-e1488 (2012).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346 (6215), 1377-1380 (2014).
