Abstract
Filamenteux protéine d'actine (actine F) joue un rôle majeur dans spinogenèse, la plasticité synaptique et la stabilité synaptique. L'évolution des structures riches dendritiques F-actine suggèrent des modifications dans l'intégrité synaptique et la connectivité. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la culture de rat primaires neurones corticaux, phalloïdine coloration pour puncta F-actine, et les techniques de quantification ultérieures. Tout d'abord, le cortex frontal des embryons de rat E18 sont dissociées dans une culture de cellules de faible densité, alors les neurones cultivés in vitro pendant au moins 12-14 jours. Après un traitement expérimental, les neurones corticaux sont colorées avec AlexaFluor 488 phalloïdine (pour marquer les points lacrymaux F-actine dendritique) et associée aux microtubules protein 2 (MAP2; pour valider les cellules neuronales et l'intégrité dendritique). Enfin, un logiciel spécialisé est utilisé pour analyser et quantifier les dendrites neuronales choisis au hasard. F-actine structures riches sont identifiés sur le deuxième ordre branches dendritiques (gamme 25-75 et de la longueur# 181; m) avec immunofluorescence MAP2 continue. Le protocole présenté ici sera une méthode utile pour étudier l'évolution des structures des synapses dendritiques subséquentes à des traitements expérimentaux.
Introduction
L'objectif principal de cette étude est de développer une méthode fiable de mesure (estimation) de l'intégrité synaptique du réseau dendritique neuronale. Nous décrivons ici la quantification des points lacrymaux F-actine dans rat primaire des neurones en culture en utilisant une combinaison de phalloïdine coloration et immunocytochimique (ICC) détection des dendrites avec une analyse ultérieure en utilisant (NIS-Elements) spécialisée logiciel.
Phallotoxins marquées ont une affinité similaire pour les grands et petits filaments (F-actine), mais ne se lient pas à monomère actine globulaire (G-actine), contrairement à certains anticorps d'actine 1. La liaison non spécifique de phalloïdine est négligeable, offrant ainsi fond minimal lors de l'imagerie cellulaire. Phalloïdine est beaucoup plus faible que les anticorps qui sont généralement utilisées pour marquer les protéines cellulaires par microscopie à fluorescence, ce qui permet beaucoup plus intense marquage de l'actine F par la phalloïdine. Ainsi, des images détaillées de localisation F-actine dans les neurones peuvent êtreobtenue grâce à l'utilisation de phalloïdine marquée.
Phalloïdine (F-actine) coloration des dendrites neuronales génère discrets "points chauds" ou brillant "puncta», qui représentent une variété de structures dendritiques, y compris les épines matures, synapses non épineuses 2 et épines immatures. Épines immatures comprennent filopodes minces et certaines formes de correctif morphologie, et peuvent représenter l'ouverture d'spinogenèse 3. Épines immatures et des correctifs non-épineux manquent PSD95 4. Evolution de la production de plomb F-actine des variations ultérieures non seulement épines mais aussi des structures dendritiques supplémentaires, faisant ainsi phalloïdine un outil important pour étudier l'intégrité synaptodendritic 5-7. En général, le nombre de phalloïdine-positive (F-actine) puncta reflètent un équilibre entre les synapses actives (excitateurs et inhibiteurs), dynamique de l'actine et de la stabilité de la synapse 8.
Bien qu'il soit important d'étudier spécifique types de synapses (c.-à épines excitateurs), lorsque la cible d'un traitement est inconnue, il faut d'abord évaluer l'intégrité générale d'une variété de structures dendritiques. Depuis F-actine est une composante majeure des épines dendritiques et d'autres structures, y compris les synapses inhibitrices, un nombre altéré de puncta F-actine peut indiquer un synaptopathy. Cette synaptopathy peut alors être étudiée plus pour des modifications plus spécifiques. Notre méthode de quantification pour détecter plusieurs types synaptiques / structures donne une estimation globale des modifications synaptiques dendritiques (augmentations et diminutions) suivantes divers traitements expérimentaux.
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Protocol
Tous les protocoles d'animaux ont été examinés et approuvés par le soin et l'utilisation Comité animale de l'Université de la Caroline du Sud (numéro d'assurance: A3049-01).
1. basse densité neuronale embryonnaire Culture
- Préparation pour la culture de neurones corticaux primaires
- Solutions:
- Préparer Poly-L-lysine solution mère en dissolvant 5 mg de poly-L-lysine dans 10 ml de tampon borate.
- Préparer la solution de travail en diluant 1 ml Poly-L-lysine Stock dans 49 ml Tampon borate.
- Préparer un tampon de borate, pH 8,4 en commençant par 395 DH 2 O, puis en ajoutant tous les ingrédients (1,24 g d'acide borique + 1,9 g de borax). Ajuster le pH à 8,4 par 1 M NaOH. Ajuster à 400 ml et on filtre avec 0,2 um filtre à membrane en nylon sous le capot.
- Préparer la solution HBSS, pH 7,2 en commençant par 445 DH 2 O et en ajoutant tous les autres ingrédients (50 ml 10X HBSS Stock + 1,2 g HEPES). Ajuster le pH à 7,2 par du HCl 1 N, bring à 500 ml et d'un filtre de 0,2 um filtre à membrane en nylon sous le capot.
- Préparer le milieu de placage: DMEM / F12 avec du sérum de veau fœtal à 10%. Filtre à 0,2 um filtre à membrane en nylon sous le capot.
- Préparer un milieu de croissance complet: A 50 ml de milieu Neurobasal, ajouter les suppléments (500 ul Glutamax (100X) + 500 ul de glucose + 1 ml de B-27 (50X) + 500 pi de solution antibiotique-antimycotique (100X) + 100 ul de 7,5% bicarbonate de sodium. filtre à 0,2 um filtre à membrane en nylon sous le capot.
- Deux jours avant la culture:
- Manteau de douze 35 mm plats à fond de verre avec 2 ml de solution de travail Poly-L-lysine, et garder sous le capot O / N.
- Un jour avant la culture:
- Agent d'enrobage vide de la vaisselle et rincer à l'ddH 2 O. Autoriser les plats à sécher pendant une heure sous une hotte.
- Préparer le milieu placage (DMEM / F12 avec 10% de sérum de veau fœtal (10% de la solution totale). La pipette 2 ml de milieu danschaque plat, et incuber O / N à 37 ° C, 5% de CO 2.
Note: Il est important d'éviter les boîtes de culture en plastique lors de la culture. L'utilisation de plats à fond de verre (pour microscopes inversés) ou des lamelles de verre (pour microscopes droits) donne des images nettes et claires. Par rapport à un plat en plastique à fond, le plat à fond de verre évite teintes indésirables ou l'éblouissement pendant la microscopie à fluorescence.
- Solutions:
- Protocole de culture cellulaire:
- Mettez au réfrigérateur tampon HBSS (100-150 ml), 100 mm boîtes de Petri, des pinces, des ciseaux, tubes de 50 ml et 15 ml tubes sous lumière UV dans la hotte.
- Euthanasier rat enceinte de l'inhalation létale de 5% sévoflurane sous le capot extérieur de la salle de culture.
- Stériliser avec EtOH à 70%, tente la peau de l'abdomen inférieur à l'aide des pinces pendant la coupe de la queue au milieu de l'abdomen cavity.Open l'utérus en utilisant des ciseaux pour exposer le placenta.
- Retirer 8-10 fœtus E18. PlaCE 8-10 fœtus dans des boîtes de Pétri contenant une solution HBSS.
- Maintenez l'arrière de la tête du fœtus avec une pince, puis utilisez des ciseaux pour couper la tête du corps. Placez-le dans une autre boîte de Pétri remplie de 5-7 ml de HBSS. Transfert plat à capuche.
- Remplir deux boîte de Pétri de 100 mm supplémentaire avec HBSS froid.
- Peel crâne de côté, et Scoop cerveau dans une nouvelle boîte de Pétri remplie de HBSS.
- Utilisez une pince tranchants courbes, le cervelet et séparée du tronc cérébral du cerveau, puis transférer cerveau à une nouvelle boîte de Pétri avec HBSS froid en elle.
- Utilisez des pinces pour fixer, séparer les hémisphères avec une pince courbes. Retirer méninges; isoler cortex frontal et des morceaux de transfert dans des tubes de 15 ml à centrifuger marqués.
- Remplir le tube de 15 ml avec des produits frais 2 ml de HBSS et ajouter 20 ul de trypsine EDTA (10x mélange concentré avec 0,5% de trypsine et mM EDTA 5.3.) À chaque tube de 15 ml.
- Incuber 10-15 min à température ambiante. Agitez doucement le tube toutes les quelques minutes, ne permettent pas de régler.
- Un Fter 10-15 min, l'utilisation pipette en verre pour enlever la vieille HBSS et rincer deux fois avec HBSS nouvelle.
- Plongez dans l'inhibiteur de trypsine (ml, inhibiteur de la trypsine 1 mg / 2 mg dans 2 ml de HBSS), bien mélanger et laisser reposer 5 min. Laver deux fois avec HBSS frais.
- En utilisant une pipette en verre avec poire en caoutchouc, des morceaux de cerveau Broyez 10-15 fois très lentement afin d'éviter bubbles.Triturate nouveau à l'aide d'une pipette calibrée et une pointe stérile avec un diamètre de pointe réduite très lentement jusqu'à homogénéité.
- Transfert dissocié les cellules à une densité désirée pour boîtes recouvertes culture (50 cellules / mm2) préparé au préalable. Incuber O / N à 37 ° C, 5% de CO2.
- Après 24 heures, remplacer le milieu DMEM / F12 avec fraîchement préparé milieu Neurobasal de croissance complet sans sérum.
- Maintenir les cellules à tout moment dans un CO 2/95% d'air ambiante incubateur humidifié à 5% pendant au moins 12-14 jours avant l'expérimentation. Compléter les cellules tous les 5-6 jours avec un milieu Neurobasal frais remplacer environ 50% de l'ancien milieu.
2. Marquage fluorescent et Immunocytochimie
Remarque: Le marquage par immunofluorescence des cultures de cellules corticales primaires a été effectuée en 35 mm du fond des boîtes de culture cellulaire de verre avec un volume utile de 1 ml.
- Laver le plat à fond de verre à deux reprises avec un tampon phosphate salin pH 7,4 (PBS).
- Fixer les cellules avec du paraformaldéhyde 4% pendant 15 min à température ambiante.
- Laver les cellules deux fois avec du PBS et perméabiliser avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 5 min.
- Traiter les cellules pendant 20 min à température ambiante avec un colorant spécifique F-actine, AlexaFluor 488 phalloïdine (1h40, à 25 pi de phalloïdine dans 1 ml de PBS).
- Rincer les cellules deux fois avec du PBS et bloquer avec 10% de sérum de chèvre normal à température ambiante pendant 1-2 heures.
- Diluer l'anticorps polyclonal de poulet anti-MAP2 (1: 2500) dans du PBS avec 2% de sérum de chèvre normal et incuber O / N à 4 ° C
- Après l'incubation, rincer deux fois dans PBS.
- Diluer l'anticorps secondaire (Alexa Red 594 chèvre conjugué IgG anti-poulet (1: 500) avec 2% de sérum de chèvre normal et incuber pendant 2 heures à température ambiante.
- Rincer avec du PBS et ajouter 10 ul / plat du colorant Hoescht.
- Incuber 3 min à température ambiante et laver avec du PBS deux fois.
Remarque: Les cellules marquées maintenant prêt pour l'étape 3 (de comptage de points lacrymaux F-actine). - Préserver échantillon de cellules avec 100 ul de antifade réactif comme agent de lamelles et de garder à 4 ° C dans l'obscurité pendant le stockage à long terme.
Remarque: phalloïdine est relativement stable dans du PBS à 4 ° C dans l'obscurité pendant 1 semaine et la fluorescence peut être conservé avec Antifade réactifs de lamelles. Cependant, les images optimaux sont obtenus à partir de 1-3 jours après coloration depuis phalloïdine peut commencer à diffuser à l'extérieur avec un stockage prolongé.
3. F-actine punctas comptage
- Allumez microscope à fluorescence et de passer à 20 × objectif. logiciel de microscope ouverte, et mis en place le programme de 1280 × 960 pixels taille de l'image, et de 0,17 um / pixel de résolution d'image à 1 × zoom.
- Acquérir des images de co-marqué F-actine / neurones MAP2 sous le drapeau vert (495 nm) / rouge (613 nm) canaux fluorescents.
- Choisissez 5 Green (F-actine) / Rouge (MAP2) immuno / Bleu (Hoescht) images fluorescentes de neurone individuel avec arbres dendritiques clairement définis.
- Identifier les structures riches F-actine dans second ordre segments dendritiques (plage de longueur 25-75 um) avec immunofluorescence MAP2 continue.
- Tournez la région sélectionnée d'images à un niveau horizontal. Copier et coller comme une nouvelle image.
- Soustraire l'arrière-plan des images, en utilisant une cohérentes ajustements pour chaque plat.
- Comptez le vert F-actine puncta lumineux et tracer la longueur du segment dendritique sélectionné manuellement par des observateurs indépendants formés. Exporter les données vers un fichier tableur.
- Calculer la masse volumique en divisant F-actine marqué puncta totale (N) par la longueur (L) de la MAP2 marqué dendrites. Data Express que le nombre de F-acétain puncta par 10 um de Dendrite
Remarque: punctas (taille ≤1.5 um) de la fluorescence F-actine avec une intensité de pic d'au moins 50% au-dessus de l'intensité moyenne de la coloration de l'arbre dendritique ont été inclus dans chaque segment sélectionné dendritique.
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Representative Results
Dans les présentes méthodes, nous avons d'abord rat de culture de neurones corticaux à faible densité dans les plats à fond de verre de 35 mm, ce qui nous permet d'identifier les dendrites des neurones individuels. Sur la figure 1, le contraste interférentiel différentiel (DIC) images montrent les changements morphologiques dans le développement foetal neurones corticaux de rat aux jours 4, 6, 10, 14, 21 et 27 in vitro. A noter que la longueur et le nombre de dendrites augmente avec la maturation des neurones primaires de rat en culture. Les neurones sont utilisés dans des expériences seulement après 14 jours de maturation.
Pour détecter les changements dendritiques et synaptiques, nous combinons l'étiquetage phalloïdine F-actine avec la détection des anticorps de MAP2 de dendrites. Etant donné que l'étiquetage phalloïdine de F-actine est très rapide (de 20 à 30 min), il est possible d'évaluer visuellement l'intégrité du réseau synaptodendritic avant de procéder au marquage des anticorps de la CCI (figure 2
Ensuite, nous acquérons des images haute résolution de phalloïdine co-marqué (F-actine) / MAP2 neurones et analysé neurones choisis au hasard. Filopodia bien, saillies de la colonne vertébrale, et des correctifs F-actine ont été considérés comme des structures riches F-actine et ont été inclus dans nos études (Figure 3). Les seconds segments de dendrites de commande (MAP2 positifs) ont été sélectionnés pour l'analyse de la densité des points lacrymaux F-actine. coloration positive MAP2 est utilisé pour confirmer la localisation neuronale du puncta F-actine. la détection assistée par ordinateur et le comptage des phalloïdine (F-actine) marqué (canal de fluorescence verte) puncta synaptique a été réalisée par l'utilisation d'un logiciel spécialisé. Il est une étape par étape détaillé protocole à la figure 4 2 = 0,97).
Auparavant, nous avons utilisé la quantification des points lacrymaux F-actine pour évaluer le dommage synaptodendritic induite par le VIH-1 Tat 9 et la récupération de synaptopathy VIH-1 Tat induit 10. Sur la figure 5, les neurones corticaux de rat ont été co-marquées avec un anticorps phalloïdine MAP2 et après 50 nM de traitement du VIH-1 Tat. MAP2 coloration a révélé moins de branches dendritiques et diminuée F-actine suivante VIH-1 Tat-traitement.
Nous avons constaté que puncta F-actine peut augmenter ou diminuer en réponse à des traitements expérimentaux. Sur la figure 6, les neurones en culture ont été traitées avec ee NMDA non compétitif antagoniste du récepteur de la mémantine, augmentant significativement puncta positif F-actine. En revanche, le traitement avec une combinaison de méthamphétamine + Tat du VIH-1 a entraîné une perte significative de puncta F-actine.
Figure 1. fœtales de rat de neurones corticaux en culture de cellules dérivées d'images de contraste d'interférence (DIC) de rat foetal neurones corticaux entre 4 -. 27 jours in vitro (20X). Neurones apparaissent matures à 14 jours in vitro. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. phalloïdine / MAP2 co-étiquetage dans les neurones corticaux de rat. Des neurones en culture étiquetés avec le PAM2 anticorps (rouge) et phalloïdine (vert). Images fusionnées permettent de déterminer que la coloration phalloïdine est localisée à dendrites neuronales (20x). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. F-actine structures synaptiques de neurones corticaux de rat. (A) à gauche - structures positives F-actine marqués avec phalloïdine (60X). Les flèches indiquent les structures marquées F-actine comprennent épines de champignons (violet), patch-morphologie (bleu) et à long filopodia (orange). Moyen - image fusionnée démonstration de ces structures de F-actine sont localisés à dendrites (20x). Droite - Box en bas à droite indique la branche dendritique second ordre choisi pour l'analyse (20X) (B) segments dendritiques de phalloïdine (F-actine) (Vert) / MAP2. (Rouge) neurones corticaux co-marqué (20X) sont utilisés pour vérifier l'origine neuronale puncta de F-actine. La seule image verte (phalloïdine / F-actine) est en outre images (C) phalloïdine / F-actine (vert) de trois segments dendritiques sélectionnés pour puncta comptage traité.. Les densités sont déterminées en divisant N / L. N = nombre de points lacrymaux, L = longueur du segment dendritique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Démonstration de logiciel:. Étape par étape les instructions S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 5. Tat du VIH-1 médiée synaptodendritic blessures dans les neurones corticaux de rat. Les cultures de cellules ont été colorées pour co-F-actine et MAP2 après le traitement de la protéine Tat du VIH-1 (50 nM). Upper Panels- neurones non traités montrant robuste F-actine, les schémas de branchement complexes, et de vastes processus neuronaux fines. panneaux inférieurs - protéines du VIH-1 Tat neurones traités avec une diminution de F-actine et une diminution de la ramification dendritique. (20X) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. puncta F-actine dans les neurones corticaux de rat:. Différents effets produits par la mémantine vs traitement méthamphétamine + Tat Images (20x) de neurones en culture non traités, les neurones traités avec la mémantine (10 M), et les neurones traités avec MethamphEtamine (20 M) 10 nM de Tat (10 nM). la mémantine a augmenté la coloration F-actine, tandis que le traitement méthamphétamine + VIH-1 Tat diminué coloration F-actine et une diminution de la ramification dendritique. traitement de la mémantine a augmenté de manière significative la densité de points lacrymaux F-actine, par rapport à des cultures témoins non traitées. En revanche, les traitements méthamphétamine + Tat du VIH-1 a diminué de manière significative la densité de points lacrymaux F-actine, par rapport à des cultures témoins non traitées. Moyenne + SEM, * p <0,05. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons la culture de neurones corticaux de rat à faible densité dans les plats à fond de verre de 35 mm, qui nous permet d'identifier les dendrites des neurones individuels. Ensuite, nous utilisons phalloïdine et MAP2 coloration pour détecter les changements dendritiques. Ensuite, nous avons utilisé un logiciel spécialisé pour quantifier les changements dans puncta F-actine.
Pour déterminer les changements dans puncta F-actine l'ensemble du réseau neuronal d'un neurone individuel doit être clairement visible, ce qui permet la sélection de second ordre segments dendritiques appropriées à partir d'un seul neurone. placage à faible densité est essentielle afin de visualiser à la fois les neurones individuels ainsi que pour réduire au minimum la présence de cellules gliales. Astrocytes contiennent également F-actine et sans marqueur neuronal, pourraient confondre l'analyse des points lacrymaux positif F-actine. les cultures à faible densité et l'utilisation de milieu Neurobasal sont utiles pour diminuer la prolifération astrocytaire dans les cultures cellulaires. Toutefois, étant donné l'avertissement que la protéine F-actine estpas spécifique aux neurones, des marqueurs de protéines neuronales spécifiques, tels que MAP2, devrait être utilisé conjointement avec phalloïdine. D'autres anticorps de protéines peuvent également être utilisés en conjonction avec phalloïdine, comme TH (tyrosine hydroxylase) pour l'identification des populations neuronales spécifiques dans la culture.
Une technique générale pour étudier les synapses et la morphologie synaptique est immunocytochimie (ICC). ICC est populaire depuis de nombreux anticorps pour des protéines synaptiques sont facilement disponibles, y compris PSD 95, NMDAR (post-synaptique) ainsi que la synaptophysine, basson et synapsine I (pré-synaptique) 11. Cependant, certaines structures ne peut pas être détecté par la CCI (comme filopodia mince), mais une combinaison de F-actine étiquetage phalloïdine avec détection d'anticorps (ou un double marquage avec deux anticorps différents) peuvent permettre une enquête spécifique et complexe de sous-populations synaptiques et les réponses différentielles à des traitements expérimentaux.
puncta F-actine peut être particticulièrement sensibles aux traitements expérimentaux. Nous avons récemment rapporté que le traitement avec le VIH-1 protéine Tat induit une diminution de puncta F-actine (24 heures) avant toute preuve de la mort neuronale manifeste (48 h) 10. Il est à noter que les traitements expérimentaux peuvent soit augmenter (mémantine) ou diminuer (méthamphétamine + VIH-1 Tat) F-actine lacrymaux. Nous avons également constaté que la F-actine perte de points lacrymaux est une réponse réversibles après traitements expérimentaux spécifiques 10. En tant que tel, la F-actine puncta quantification est un outil précieux pour surveiller non seulement synaptopathy aiguë, mais aussi pour l'étude de la récupération synaptique et processus de neurorestoration expérimentales.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Normal horse serum | Life Technologies | 26050-070 | |
| Chicken polyclonal anti-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| NIS-Elements software package | Nikon Instruments | ||
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope | Nikon Instruments | ||
| 0.2 μm Nalgene nylon membrane filter | Fishersci | 151-4020 |
References
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