A actina filamentosa (F-actina) desempenha um papel importante na espinogênese, plasticidade sináptica e estabilidade sináptica. A quantificação de pontos de F-actina é, portanto, uma ferramenta útil para estudar a integridade das estruturas sinápticas. Este protocolo descreve os procedimentos de quantificação de pontos de F-actina marcados com faloidina em culturas neuronais corticais primárias de baixa densidade.
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Artigo de método
Quantificação de filamentosas actina (F-actina) puncta no Rat neurônios corticais
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
proteína actina filamentosa (F-actina) desempenha um papel importante na spinogenesis, plasticidade sináptica, e estabilidade sináptica. Mudanças nas estruturas ricas F-actina dendríticas sugerem alterações na integridade sináptica e conectividade. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a cultura de rato primária neurônios corticais, coloração faloidina para puncta F-actina, e técnicas de quantificação subsequentes. Em primeiro lugar, o córtex frontal de embriões de rato E18 são dissociados em cultura celular de baixa densidade, em seguida, os neurónios cultivados in vitro durante pelo menos 12-14 dias. Após o tratamento experimental, os neurônios corticais estão manchadas com AlexaFluor 488 faloidina (para rotular o puncta F-actina dendrítica) e proteína associada a microtúbulos 2 (MAP2; para validar as células neuronais e integridade dendrítica). Finalmente, software especializado é usado para analisar e quantificar dendrites neuronais selecionados aleatoriamente. F-actina estruturas ricas são identificados na segunda ordem ramos dendríticas (variação de comprimento 25-75 &# 181; m) com imunofluorescência MAP2 contínua. O protocolo apresentado aqui vai ser um método útil para investigar mudanças nas estruturas sinapse dendríticas subsequentes aos tratamentos experimentais.
Introdução
O principal objetivo deste estudo é desenvolver um método fiável de medição (estimativa) de integridade sináptica da rede dendrítica neuronal. Aqui nós descrevemos quantificação de puncta F-actina em ratos primário neurônios cultivados usando uma combinação de coloração faloidina e detecção imunocitoquímica (ICC) de dendrites com posterior análise usando software especializado (NIS-Elements).
Falotoxina rotulados têm afinidade semelhante tanto para grandes e pequenos filamentos (F-actina), mas não se ligam a monomérica actina globular (G-actina), ao contrário de alguns anticorpos de actina 1. A ligação não específica de faloidi....
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Protocolo
Todos os protocolos de animais foram revistos e aprovados pela Comissão de animal Cuidado e Uso da Universidade da Carolina do Sul (número de garantia: A3049-01).
1. baixa densidade Embryonic Neuronal Cultura
- Preparação para a primária neurônio cultura cortical
- soluções:
- Preparar a solução da poli-L-lisina por dissolução de 5 mg de poli-L-lisina em 10 ml de tampão de borato.
- Preparar uma solução de trabalho por diluição de 1 ml de poli-L-lisina em 49 ml da tampão de Borato.
- Preparar tampão de borato, pH 8,4, iniciando com 395 ml de dH 2 O e em seguida a adição de....
- soluções:
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Resultados
Nos presentes métodos, primeiro cultura rato neurônios corticais em baixa densidade em pratos com fundo de vidro de 35 mm, o que nos permite identificar os dendritos de neurônios individuais. Na Figura 1, o contraste interferência diferencial (DIC) imagens mostram as alterações morfológicas no desenvolvimento de rato fetal neurônios corticais nos dias 4, 6, 10, 14, 21 e 27 in vitro. Note-se que o comprimento e o número de dendritos aumentar com a maturação de ne.......
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Discussão
Neste protocolo, descrevemos a cultura de neurônios corticais de rato em baixa densidade em pratos com fundo de vidro de 35 mm, o que nos permite identificar dendritos de neurônios individuais. Em seguida, usamos faloidina e coloração MAP2 para detectar alterações dendríticas. Em seguida, foi utilizado um software especializado para quantificar mudanças na puncta F-actina.
Para determinar mudanças na puncta F-actina toda a rede neuronal de um neurônio individual deve ser claramente visível, .......
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Divulgações
Nenhum dos autores tem conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por doações do NIH DA013137, DA031604 e HD043680. O apoio parcial foi fornecido por uma bolsa de treinamento NIH T32 em ciências biomédicas-comportamentais.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Pratos com Fundo de Vidro de 35 mm No. 1.5 lamínula | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Tripsina-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Poli-L-Lisina | Sigma | P9155 | |
| Ácido bórico | Sigma | B0252 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| Glicose | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Meio neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| Suplemento B-27 | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Antibiótico-Antimicótico solução | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Bicarbonato de Sódio | Life Technologies | 25080 | |
| Vannas Tesoura | World Precision Instruments | 500086 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Dumont #5 Fórceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldeído | Sigma | P6148 | |
| Vidro de cobertura | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Faloidina | Life Technologies | A12379 | |
| Soro de cavalo normal | Life Technologies | 26050-070 | |
| Frango policlonal anti-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-conjugado cabra anti-frango IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Coloração de células vivas ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| NIS-Elements pacote de software | Nikon Instruments | ||
| Nikon Eclipse TE2000-E microscópio fluorescente invertido controlado por computador | Nikon Instruments | ||
| 0.2 μ m Filtro de membrana de nylon | Nalgene Fishersci | 151-4020 |
Referências
- Heller, E. A., et al. The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses. PLoS One. 7, e39572(2012).
- Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. Selective clustering of glutamate and gamma-a....
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Reimpressões e permissões
