Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

בגישת ההדמיה התפקודי של מוח Vivo בהתבסס על סידן Bioluminescent המחוון GFP-aequorin

Published: January 8, 2016 doi: 10.3791/53705
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1
1Equipe: Imagerie Cérébrale Fonctionnelle et Comportements (ICFC), Institut des Neurosciences Paris-Saclay (Nero-PSI), UMR-9197, CNRS/Université Paris Sud, 2Interdisciplinary Program in Neuroscience, Graduate College, University of Iowa, 3Department of Anesthesia, Carver College of Medicine, University of Iowa

Summary

כאן אנו מציגים רומן Ca 2 + גישת -imaging באמצעות כתב bioluminescent. גישה זו משתמשת בGFP-aequorin מבנה התמזגה אשר נקשר Ca 2 + ופולט אור, ומבטל את הצורך בעירור אור. באופן משמעותי בשיטה זו מאפשרת הדמיה ארוכה רציפה, גישה למבני מוח עמוקים ורזולוציה גבוהה זמנית.

Abstract

פונקציונלי in vivo ההדמיה הפכה לגישה רבת עוצמה כדי לחקור את הפונקציה ופיזיולוגיה של תאי מוח ומבנים של עניין. לאחרונה שיטה חדשה של Ca 2 + -imaging באמצעות GFP-aequorin כתב bioluminescent (GA) פותחה. טכניקה חדשה זו מסתמכת על השילוב של גני GFP וaequorin, ייצור מסוגל מחייב סידן ומולקולה - בתוספת coelenterazine cofactor - פולטות אור בהיר שיכול להיות במעקב באמצעות אספן פוטון. קווים מהונדסים נושאים את גן GFP-aequorin כבר נוצרו עבור שני עכברים ודרוזופילה. בדרוזופילה, גן GFP-aequorin הושם תחת השליטה של מערכת הביטוי בינארי GAL4 / כטב"מ המאפשרת ביטוי ממוקד והדמיה בתוך המוח. שיטה זו לאחר מכן הוצגה להיות מסוגלת לזהות שני פנימה Ca 2 + -transients וCa 2 + -released מחנויות פנימיות. והכי חשוב זה מאפשר לזמן רב יותר בהקלטה רציפה, הדמיה בעומקים גדולים יותר במוח, והקלטה ברזולוציות גבוהות זמניות (עד 8.3 אלפיות שני). כאן אנו מציגים שיטה הבסיסית לשימוש בהדמית bioluminescent להקליט ולנתח Ca 2 + -activity בתוך גופי פטריות, מבנה מרכזי ללמידה וזיכרון במוח הזבוב.

Introduction

הדפוסים והתפקוד של פעילות במוח והמבנים הדיסקרטיים הבסיסיים כבר זמן רב על שטח של מחקר אינטנסיבי בתחום מדעי המוח. אולי חלק מהגישות המוצלחות המוקדמות נהגו לטפל בבעיה זו היו מדידה פיזיולוגית ישירה של השינוי בפעילות חשמלית - שיטות חלופיות עם זאת, המאפשרות הדמיה חיה של שינויים בריכוזי מתח, pH או סידן (כמו פרוקסי לפעילות) הביאה יכולות נוספות ל המחקר של פעילות עצבית 1. טכניקות הדמיה לבצע מגוון רחב של יתרונות כגון הפולשנות מופחתת ואת היכולת לעקוב אחר פעילות בתוך מבני מוח כולו. יתר על כן בבעלי חיים עם גנטיקה צייתנית כוללים זבוב הפירות דרוזופילה, פיתוח של אינדיקטורים סידן מקודדים גנטיים, כגון Cameleon, GCaMPs ואחרים 1 איפשר לחוקרים לעקוב אחר תאי עצב בודדים, אוכלוסיות נוירונים וכל מוחמבנים. בעוד שיטות ניאון מסורתיות יותר סידן הדמיה באמצעות GCaMPs (GFP התמזג calmodulin) או סריג (CFP ו YFP התמזג calmodulin) הוכיח להיות טכניקות שימושיות מתן החלטת מרחב ובזמן טוב, התהליך הבסיסי של עירור אור מוליד כמה מגבלות עליה ניסיוני יישומים. בשל האופי של עירור אור, autofluorescence, צילום הלבנת, וphototoxicity מיוצרים באופן בלתי נמנע, שכתוצאה מכך מגביל את העומק של המבנים שניתן הדמיה, משך ההקלטות כמו גם המשכיות בזמן אמת של הקלטה. במילים אחרות, הקלטות חייבות לעתים קרובות נעשות לסירוגין, כדי למנוע תופעות לוואי בלתי רצויים אלה.

בגלל אתגרים אלה, שיטות חלופיות נוספות של הדמיה סידן פותחו. אחת השיטות המבטיחות ביותר הוא הדמיה bioluminescent, אשר מסתמכת על אור מופק באמצעות תגובה האנזימטית לאחר סידן מחייב. Bioluminescenהדמיה לא אינה דורשת עירור אור וכתוצאה מכך אינו חווה אותם הקשיים כמו סידן הדמיה קונבנציונלית. כתב bioluminescent Aequorin - מבודד מויקטוריה Aequorea, אותו המדוזות שממנו GFP גם isolated- נקשר סידן באמצעות שלושה מבני יד EF ועובר שינוי קונפורמציה, מוביל לחמצון של coelenterazine cofactor ואת שחרורו של אור הכחול (λ = 469 ננומטר) 2,3. יש Aequorin זיקה נמוכה מאוד ל( ד K = 10 מיקרומטר) סידן שהופך אותו אידיאלי עבור ניטור ארעיים סידן משום שהיא מייצרת רעש רקע מעט מאוד ולא מפריעה למערכת אגירת סידן תוך תאי 4. למרות aequorin כבר השתמש בעבר כדי לפקח על התהליך של אינדוקציה עצבית בביצה הצפרדעים 5 האור המיוצר הוא עמום מדי לשימוש עבור הדמיה בזמן אמת של פעילות עצבית. במאמץ להתמודד עם אתגר זה, פיליפ Br ו# 251; בואו ועמיתיו במכון פסטר נוצרו מבנה גנטי פיוזינג GFP וaequorin גנים, מחקה את המדינה האם של המדוזה בתוך 4. מוצר גן היתוך זה נקשר סידן שוב באמצעות שלושת מבני EF היד של aequorin, שעובר שינוי קונפורמציה המוביל לחמצון של coelenterazine, המעביר אנרגיה שאינה radiatively לGFP. תוצאות זה העברת אנרגיה בשחרורו של אור ירוק (λ = 509 ננומטר) מGFP, במקום אור הכחול מaequorin. ההיתוך של ה- GFP וaequorin גם מקנה יציבות חלבון גדולה יותר עוזרת אור תוצרת חלבון היתוך 19-65 פעמים בהירות יותר aequorin לבד 4. שימוש בגישה bioluminescent בתוך המוח מרחיבה את היישום הניסיוני הנוכחי של סידן הדמיה הן מבחינת משך ההקלטה רציפה ומספר המבנים במוח שיכול להיות מוקלט. באופן כללי בהקשר של עבודה קודמת זה אומר ששניהם גלובלי וגדול יותרמגוון של "פעילות" regionalized של המוח יכול להיות במעקב (באמצעות פרוקסי של ארעיים סידן). יותר מכך פעילות יכולה להיות במעקב למשך זמן ארוכה יותר, בזמן אמת ובסיס מתמשך, אשר משאיל את עצמו בקלות למרדף של הבנה מלאה של תפקוד בסיסי במוח.

בשנים האחרונות, המעבדה ואחרים שלנו פיתחו זבובים מהונדסים המבטאים את ה- GFP-aequorin תחת השליטה של מערכת הביטוי בינארי (GAL4 / כטב"מ-GFP-aequorin) 5,6. השתמשנו פליטת אור GFP-aequorin לפעילות שיא המיוצרת על ידי גירויים טבעיים כגון ריח 7,8, כמו גם המרכיבים התאיים למדו ויסות -activity Ca 2 + בגופי הפטרייה בעקבות גירוי קולטן האצטילכולין ידי יישום ניקוטינית ישיר 9. בנוסף, יש לנו גם משמש GFP-aequorin להתייחס מספר השאלות ניסיוניות שלא היו מסוגל לטפל בעבר, כמו לטווח ארוךהדמיה של ארעיים סידן ספונטני והדמיה של מבני מוח עמוקים יותר 10. לאחרונה, השתמשנו במערכת / כטב"מ GAL4 להביע קולט ATP היונקים P2X 2 11 ערוץ קטיון, בנוירונים ההקרנה (PNS) והשתמשתי במערכת LexA להביע GFP-aequorin בגופי הפטריות (MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (באדיבות ב פייפר, Janelia Farm, ארה"ב). זה אפשר לנו להפעיל את PNS על ידי יישום של ה- ATP, אשר בתורו מפעיל את גוף הפטרייה (יעד במורד הזרם של PNS), מחקה יותר תנאים טבעיים, כגון התגובה לגירוי ריח. בסך הכל טכניקה זו משלבת P2X 2 וה- GFP-aequorin מרחיבה את האפשרויות הניסיוניות. באופן כללי היא מציעה את ההזדמנות כדי להבין טוב יותר את דפוסי הפעילות במוח, ייזום מחקרים חדשים על איך גירויים והפרעות שונים יכולים לשנות את הדפוסים הבסיסיים של פעילות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת דוגמאות

  1. הכנה של פתרונות ולהגדיר
    1. לשמור את כל קווי תסיסנית melanogaster ב 24 מעלות צלזיוס במדיום מזון סטנדרטי. אחורי ולשמור אותם בצפיפות נמוכה בבקבוקון כדי ליצור גודל סטנדרטי ומשקל של זבובים.
      1. הוסף 10 נקבות הבתולה עם 10 גברים בבקבוקון, לתת להם להזדווג ולהעביר אותם כל 2 ימים לבקבוקון טרי. אז 10 ימים לאחר מכן, כאשר הזבובים מתחילים eclose, לקצור את הזבובים בכל יום. שמור תיעוד מדויק של גיל הזבובים ולשמור אותם במצב טוב.
      2. ביום 3, להפריד את הזכרים מהנקבות ולשמור על הנקבות 20 זבובים בכל בקבוקון. רשום את הזבובים בשעה 4 או 5 ימים-ישן.
    2. הכן את הפתרון של רינגר עם הריכוזים הבאים: 130 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 2 מ"מ MgCl 2, 2 סוכרוז מ"מ CaCl 2, 5 מ"מ HEPES, ו -36 מ"מ ולהתאים את ה- pH של התמיסה לבדיוק 7.3. הכן את פתרונות זלוף של 25 μ; ניקוטין M ו- 100 מ"מ KCl בפתרון של רינגר.
    3. הכן 1,000 קצה פיפטה μl: באמצעות קצה צורת סכין גילוח לשיפוע (כ -35 מעלות מקצה של קצה) ולהסיר בסיס עודף מעבר ½ 1 סנטימטר מקצה.
    4. תיבה לאחסון (23 סנטימטרים X 17 סנטימטרים X 8.5 סנטימטרים) של מדגם להכין במהלך דגירה. מניחים שני ספוגים (12 סנטימטרים X 8 סנטימטרים X 3 סנטימטרים) רוויים במים בתחתית [כדי למנוע התייבשות מדגם] להלן מנגנון מדף קטן למקום דגימות כהכנה שלהם הושלמה.
    5. הכן דגימות זבובים כך שהם מכילים לפחות עותק 1 של כטב"מ-GFP-aequorin ועותק אחד של קו Gal4 לנהוג ביטוי של ה- GFP-aequorin. קו OK107 Gal4 (ביטוי קו נהיגה בעיקר בגופי הפטריות) הוא חצה עם כטב"מ-GFP-aequorin בהכנה זו.
      הערה: בתוך הקופסה חייב להיות עמיד למים ומחוץ חייב לחסום אור מתיבת הכניסה כדי למנוע השפלה של coelenterazine במהלך דגירה.
  2. Preparation של דגימות
    1. קרח להרדים תסיסנית על ידי העברתו לבקבוקון זכוכית ולשמור על קרח למשך 2 דקות לפני שעברתי לצלחת פטרי הצונן למיצוב בקצה פיפטה. הכן טיפים פיפטה על נייר סינון לח מעט ב100 מיליליטר צלחת פטרי על קרח תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
    2. בעדינות עם מקום מלקחיים לטוס בתוך קצה פיפטה.
    3. בעזרת מברשת בעדינות לדחוף וליישר לטוס כך שהראש הוא לגמרי מעבר לקצה של קצה ואזור הגב חשוף בחלקו על ידי הסעיף הוסר במהלך עיצוב קצה (איור 2).
    4. לשלב מנות קטנות (כ 3-4 μl) של שני רכיבים של דבק השיניים. החל הדבק בזהירות סביב הקדמי ואחורי ראש וצוואר ומטה ולמסביב לקצה קצה pipet - הימנעות הכתר של הראש. בואו דבק יבש למשך 2 דקות.
    5. טיפ פיפטה מקום עם זבוב מודבק דרך חור בתא הקלטה (איור 2 ד) ודורtly לחץ כדי לאבטח במקום.
    6. לשלב את שני רכיבים של דבק סיליקון (כ 3-4 μl). החל דבק בצד השטוח של תא לאורך הקצה שבו התא ונפגש קצה פיפטה כדי למנוע דליפה של הפתרון של רינגר. בואו דבק יבש למשך 2 דקות.
  3. נתיחה
    1. להדביק סרט על ערוץ זלוף, קצה קצר והארכת לחלק האחורי של החדר.
    2. הנח קאמרי עם זבוב על בלוק נתיחה תחת מיקרוסקופ תור במנורת פלורסנט. מיליליטר pipet 1 של הפתרון של רינגר לתא.
    3. השתמש בסכין כירורגית עדין להסרת ציפורן. ודא חתכים מקבילים מהחלק האחורי של הראש לאזור מחושים. ואז לחתוך לאורך הקצה של העין אז לעשות חתך בניצב מעל אנטנת חיבור החתכים הקודמים. הפוך מקביל חתך סופי שבחלק האחורי של הראש. השתמש במלקחיים החדים בסדר להסיר ציפורן (איור 2 ג).
    4. שימוש במלקחיים חדים בסדר לתפוס בעדינותד שם ברור נחשף רקמת נשימה עד המוח וגוף פטרייה [fluorescing] בבירור דמיינו.
    5. שימוש במלקחי אולטרה חד לתפוס בזהירות ולצבוט רקמת neuroepithelial מכסה מוח כדי לאפשר חלחול של coelenterazine.
      הערה: לחלופין פפאין יכול לשמש כדי permeabilize neuroepithelia 9.
    6. באמצעות pipet, לשטוף את פעמיים עם הפתרון של רינגר כדי להסיר את כל פסולת מן הנתיחה ומדגם מקום בתיבה הכהה.
    7. מיליליטר pipet 1 של הפתרון של רינגר המכיל 5 מיקרומטר נזיל-coelenterazine לתוך התא. סגור את התיבה ולאפשר דגירה עם coelenterazine ב RT עבור מינימום של 2 שעות.

2. הדמיה

  1. להכין
    1. התחל מערכת הקלטה: להפעיל מערכת ניקוז מיקרוסקופ, מחשב, מצלמה וחדר קבע בקרות סביבתיות עד 25 מעלות צלזיוס.
    2. מדידה פתוחה ותכנית האוטומציה Explorer במחשב. לחץ על “ מכשירים וממשקים ", לאחר מכן לחץ פעמיים על" מכשירי תנועת NI "ולבסוף לחץ לחיצה ימנית על" PCI-7334 "ובחר" לאתחל את המכשיר ".
    3. פתח פוטון Imager. צור תיקייה חדשה וקובץ הקלטה הראשון שם. מצלמה חייבת להגיע -80 ° C לפני שהמערכת תתפקד.
    4. מערכת זלוף להגדיר - להוסיף KCl, ניקוטין, והפתרון של רינגר למאגרים ולהתאים כך כל פריקות פתרון של 2 מיליליטר / דקה. לשטוף עם הפתרון של רינגר לפני תחילת ניסוי.
  2. הכן מדגם
    1. הדמיה מקום הר צלחת בלוק על הר תחת מיקרוסקופ בהגדלה 5X ולהכניס צינור טפטוף לתוך ערוץ דרך נקב.
    2. מיקרוסקופ המוגדר למצב ניאון אז מרכז ולהביא את הגוף פטרייה (MBS) אל מוקד. התאם ל20X ומחדש מרכז ומיקוד.
    3. מנגנון ניקוז עמדה מעל בריכת ניקוז, להתאים את הגובה של מחלף הניקוז כך הקצה הוא רק abovבריכה האלקטרוני, ולהפעיל הפתרון של רינגר למשך 30 שניות כדי להבטיח ניקוז הולם.
    4. ניתץ מגן לאטום את המנגנון מהאור. שימוש במערכת האוטומטית בתרמי פוטון לבצע התאמות עדינות למוקד ולקחת תמונת ניאון התייחסות של MBS.
  3. הַקלָטָה
    1. התאם את מהירות פוטון למהירות הקלטה רצויה (בין 50 אלפיות השניים עד 1 שניות או יותר). מצב בחר פוטון ותריס פתוח. שיא גנוטיפ, מין, גיל, ומספר מדגם בערכי יומן. התאם תיבות ROI עמדה על גביע וגופי תא (CCB) ואונות המדיאלי על ידי לחיצה על תיבות החזר על ההשקעה וגרירה תוך החזקת שליטה.
    2. שיא בסיס לכ -5 עד 10 דקות (כרצוי).
    3. החל ניקוטין דקות 1. הערה להתחיל / לעצור ביומן. לשטוף עם הפתרון של רינגר במשך 5 דקות.
    4. חכה 5 דקות להתאוששות ולהכין KCl רישום ביומן וטיימר.
    5. החל KCl דקות 1. הערה להתחיל / לעצור ביומן. לשטוף עם הפתרון של רינגר דקות 1.
    6. מֶתֶגלמצב ניאון, לקחת תמונת ניאון סופית, ולכבות את הפתרון של רינגר.
    7. לחץ על "עצור". תיבת הדו-שיח תבקש לכבות את המערכת. בחר "לא" כדי להמשיך את הקלטה.
    8. מגן פתוח, מערכת ניקוז מהלך, מטרת עדשת מתג ל5X, להסיר צינור זלוף. הסר מדגם / צלחת הקלטה מבמה, לנקות את עדשת 20X על ידי שטיפה וניגוב העדשה פעמיים עם מים.
    9. לחץ על לחצן הפעלה הלבן בחלק העליון של חלון התכנית ליזום ההקלטה הבאה.

3. ניתוח ויצירת וידאו

  1. לחלץ ערכי פוטון
    1. פתח את תכנית ניתוח הפוטון (למשל, הפוטון Viewer) ומדגם הראשון קובץ גיליון אלקטרוני פתוח.
    2. בחר בכרטיסייה בקרת תצוגה. בחר את ההחזר על ההשקעה על ידי לחיצה על האזור תוך החזקת שליטה. להתאים את הגודל, כיוון וצורה של אזורים של עניין להקיף CCB המואר GFP ואונות המדיאלי.
    3. להוסיף בנוסףאל ROI על ידי לחיצה על "הגדר החזר על השקעה" ולחיצה וגרירה על מסך כדי ליצור את ההחזר על ההשקעה החדשה.
    4. בחר בכרטיסייה "הסרט" לשחק וידאו פוטון. התאם "רוחב שניות" ו- "צעדי שניות" כרצוי. כוון מיקום ROI צורך.
    5. בחר תמונות מסך נציג של הקרינה GFP, תגובת ניקוטין ותגובת KCl. צילומי מסך יבול ותמונה להדביק לתוך שקופיות מצגת לניתוח והשוואה מאוחר יותר.
    6. התאם שני "רוחב שניות" ו- "צעד שניות" למהירות ההקלטה בשניות. בחר אורך של ניתוח על ידי הזזת סמנים אפורים על פנל העליון לאזור הסוגר לפני תחילת גירוי ורק לאחר סיום תגובה.
    7. בחר "להשעות צפיות בעת ששחקה" עיתונות "<< REW" ו" PLAY> "עיתונות. בחר בכרטיסייה "רוזן תרשים דרג" ולהתאים את היחידות כרצויות וצבעי קו כדי להתאים צבע החזר על השקעה.
    8. כאשר הניתוח נגמר, לחץ על "יצוא רוזן קצב נתונים". צילומי מסך בחירה של CCB הקלטות משולבים ואזור אונה המדיאלי של עניין מכל צד. צילומי מסך יבול ותמונה להדביק לתוך שקופיות עם תמונות תגובה. שקופית זו תהיה מאוחר יותר השתמשה בניתוח סופי.
  2. דוגמא ניתוח: שיטה אחת לניתוח של נתונים פוטון שחולצו מפורטים
    1. פתח את קבצי הגיליון האלקטרוני בתיקייה "רוזן יצוא דרג".
    2. לאתחל מחדש את התאים זמן העמודה שכותרתה הראשון כדי להציג את הזמן בשעה ודקות.
    3. התייחסות לשקופית המתאימה למדגם. הסר את כל הערכים מלבד הטורים בפעם והנציג ROIs שני.
    4. לקבוע שעת התחלת גירוי ניקוטין - זמין בקובץ רישום ביומן בעיקרי folder- להסיר נתונים נוספים לפני תחילה או ערך גולת כותרת.
    5. מצא את הערך הגבוה ביותר / שיא עבור שני CCB ואונה המדיאלי וסימן / גולת כותרת.
    6. לקבוע התחלת תגובה וזמן סיום עבור שניCCB ואונה המדיאלי על ידי יצירת הערכה באמצעות נקודת זמן ממקביל בגרף תגובה בשקופית ובחרו ערך בפועל על ידי שינוי בערכים בסמוך לנקודות אלה. הדגש את האזור שבין הנקודות הללו בשני CCB ואונות המדיאלי. לחלופין, להשתמש במאקרו 9.
    7. מערבבים את כל הדגימות של קבוצה אחת ניסיונית בגיליון אלקטרוני חדש.
    8. יישר בשיא על ידי קביעת ערך השורה הוא עבור כל ערך שיא CCB. הפחת את הערכים נמוכים יותר מהערך הגבוה ביותר בשורה לקביעת שווי שורה המשוערת שבו שנתוני המדגם חייבים להיות recopied ל. ודא שכל ערכי השיא מיושרים.
    9. העתק את גיליון פעמיים ולמחוק או עמודות אונה המדיאלי או עמודות CCB יצירת דפים של CCB בלבד או ערכי אונה המדיאלי.
    10. הסר נתונים לאחר כל תגובות CCB הסתיימו. ליצור ארבע שורות כותרת סה"כ פוטונים, אורך תגובה (משך), שיא משרעת, ותגובת חביון. להעתיק ולהדביק שוב זה מתחת למקור.
    11. השתמש בפונקצית SUM כדי לקבוע פוטונים כולל במהלך תגובה. השתמש בפונקצית COUNT כדי לקבוע אורך של תגובה. העתק ולקשר תא הערך הגבוה ביותר לקביעת שווי משרעת שיא. השתמש בפונקצית COUNT - בחר מההתחלה של טפטוף של ניקוטין לתחילת התגובה - כדי לקבוע תגובת חביון.
    12. ערכי העתקה על ידי שימוש בפונקציה המקשרת ולהכפיל (כולם מלבד משרעת שיא) על ידי הקלטת מהירות בשניות.
    13. גרפים בר / תיבה עשויים להיווצר לפרמטרים מחושבים כגון סה"כ פוטונים, שיא משרעת, ואורך תגובה, אם כך רצויים (לשעבר .: איור 5, C, D).
    14. בעמודה לאחר תגובת פוטון נתונים הגולמית, בממוצע נקודות נתונים הגולמיים לכל נקודת זמן באמצעות פונקציה ממוצעת. אם מעקב רצוי עם טור קביעת שגיאת התקן של הממוצע (SEM), עבור כל אחד מערכי הפוטון בממוצע בנקודת זמן.
    15. השתמש בעמודה הממוצעת לבניית Profil תגובה ממוצעתדואר [גרף] לקבוצת מדגם CCB. כדי לעשות זאת בחר בעמודה המפרטת את הזמן כערכי ציר X והטור של ערכי פוטון הממוצע כציר y ולבסוף בחר בכלי יצירת גרף scatterplot.
    16. חזור על תהליך ניתוח זה עם נתונים מהאונות המדיאלי.
  3. יצירת תמונות לוידאו
    1. הצופה פוטון פתוח.
    2. כרטיסיית בקרת תצוגה בחר. לחץ על החזר על השקעה תוך החזקת שליטה כדי לבחור, להסיר ו / או למזער אותו.
    3. לשנות "רוחב שניות" (זמן הצטברות) כרצוי כדי לקבוע את התוכן של כל מסגרת.
    4. לשנות "צעד שניות" כדי להגדיר את החפיפה של כל מסגרת.
    5. בחר "נופי יצוא בעת ששחק" העיתונות "<< REW" ואז "PLAY>". התמונות לווידאו ניתן לייצא לתיקייה "יצוא מבט" כסדרה של קבצי .png.
  4. באמצעות דאב וירטואלי לעשות וידאו: שיטה אחת לוידאו גreation מפורט
    1. צור תיקייה חדשה בשם "resultats" הבמכילה תמונות תיקיית יצוא נוף.
    2. להביא תסריט (renommer.VBS) לתוך התיקייה של תמונות.
    3. לחץ לחיצה כפולה על renommer.VBS לרוץ.
    4. תמונות באופן אוטומטי לשנות את שמם מבחינה מספרית והעתיקו לתיקייה "resultats".
    5. VirtualDub.exe הפתוח.
    6. בחר קובץ וידאו פתוח - בחר תמונה ראשונה (תמונות שלאחר מכן באופן אוטומטי לטעון).
    7. וידאו בחר - במסגרת שיעור בחר להתאים כרצונכם.
    8. וידאו בחר - דחיסה בחר לבחור Cinepak Codec ידי רדיוס.
    9. בקובץ בחר שמירה כAVI הווידאו ייווצר באופן אוטומטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ההיתוך של ה- GFP לaequorin מאפשר לנו לדמיין האזור של עניין לפני ההדמיה bioluminescent דרך עירור של ה- GFP במצב ניאון על המיקרוסקופ (איור 3 א, 4 א, ​​א 6, 6-ה). אחת הדרכים הפשוטות ביותר כדי לעורר את גוף הפטרייה הוא באמצעות הפעלה של קולטני אצטילכולין ניקוטינית ionotropic. למרות אצטילכולין הוא יגנד אנדוגני של קולטן זה מצאנו כי ניקוטין מייצר תגובות לשחזור יותר בגופי הפטריות. זה בין שאר משום שהם במיוחד להביע קולטני אצטילכולין ניקוטינית, ובכך באמצעות ניקוטין אנו יכולים למנוע את ההפעלה של קולטני אצטילכולין muscarinic הביעו במקום אחר במוח. יתר על כן, הניקוטין הוא יציב יותר מאצטילכולין, ובכך מאפשר שליטה טובה יותר ואמינה יותר גירוי. תגובה אופיינית מתחילה עם ההפעלה מהירה של שני גביע, תא-הגוף (CCB) ואונות המדיאלי (ML) (ראה איור 4לתמונת כותרת). בדרך כלל תגובת CCB נמשכת זמן רב יותר ותערוכות תגובת bioluminescent גדולה מהאונות כפי שמוצגת בלוחות רציפים של התגובה (איור 3 ג-ח). איור 4 מראה הצטברות 10 שניות של פוטונים שנרשמו בהחלטה זמנית של 100 אלפיות שניים (10 הרץ) בתקופת השיא של תגובה לזלוף דקות 1 של 25 מיקרומטר ניקוטין. לאחר תקופה סחף והתאוששות של 10 דקות גירוי שני של זלוף 1 דקות של 100 מ"מ KCl הוא יזם (4C דמויות, E) אשר מאפשרת לנו לאשר את הכדאיות של המדגם שלנו. התגובות כמותי יכולות להיות מנותחות על ידי בחירת החזר על השקעה במהלך ניתוח בצופת פוטון. ריצת הניתוח בצופת פוטון מייצרת שני הגרפים המציגים את מספר הפוטונים הנפלטים בהחזר על השקעה נבחרת לאורך זמן (איור 4D ו- E), כמו גם גיליונות אלקטרוניים ליצוא של ערכים אלה. איור 4D הוא example של הגרפים המיוצרים על ידי צופה פוטון זומם הפוטונים נפלטים בהחזר על השקעת 2 [הירוק] (מימין CCB) והחזר על השקעת 4 [כחול] (אונות המדיאלי תקין). נתונים דומים לתגובת KCl המיוצגת באיור 4E. הנתונים המיוצאים ניתן להשתמש כדי לשחזר את העקומה של התגובה (איור 5 א), כמו גם כדי לחלץ נתונים נוספים על פרמטרים שונים, כגון משך, משרעת שיא, ותגובה כוללת (איור 5-D). לאחרונה באמצעות מערכות Gal4-כטב"מ וLexA שפתחנו שיטה לעורר תגובה טבעית יותר. בקצרה, ערוץ קטיון P2X 2 מגודר-ATP בא לידי ביטוי בנוירונים ההקרנה (PNS) וה- GFP-aequorin (GA) בא לידי ביטוי בגוף הפטרייה - יעד של PNS; זה מאפשר לנו לרגש באופן סלקטיבי PNS אם כי היישום של ה- ATP, אשר יכולה בתורו, לייצר תגובה בגוף פטרייה (איור 6).

איור 1 1. מאפייני דמותו של Bioluminescent עיתונאים (GFP-aequorin). () סכמטי של GFP וגן היתוך aequorin עם רצף הפעלה במעלה הזרם. דגם (B) של פליטת אור הכחולה על ידי aequorin בתגובה לרמות גבוהות של Ca 2 +. דגם (C) של פליטת אור ירוקה על ידי ה- GFP-aequorin בתגובה לרמות גבוהות של Ca 2 +. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. ניסיוני להגדיר. () לטוס ממוקמים בקצה pipet. (ב) איור של טכניקת הדבקה נאותה לייצוב הראש ואיטום באזור שבין גוף הזבוב וקצה pipet. (ג) סכמטי של נתיחה כדי לפתוח כמוסת ראש. 1 מיליליטר קאמרי במחזיק בלוק עם צינור זלוף המוכנס (ד '). ממדים כולל קאמריים: אורך: 7.4 סנטימטר, רוחב: 2.7 סנטימטר, גובה: 0.55 סנטימטר. ממדים פנימיים תא: אורך: 1.7 סנטימטר, רוחב: 1.4 סנטימטר, גובה: 0.35 סנטימטר, ואת הרדיוס של חדר חור: 0.1 סנטימטר. צפה ב( ה) של ראש הזבוב מראה אות GFP החיובי במ"ב: אור עמום נמוך עם הקרינה נובעת מGFP-aequorin OK107 מונע לאחר הסרת הציפורן. מיקרוסקופ (F) עם מערכת טפטוף מצלמה ופוטון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. תגובת נציג 25 מיקרומטר ניקוטין בגוף פטרייה. (א) תמונה של פלורסנטהביטוי של GFP-aequorin בגופי הפטריות בGA2 / +; OK107 / + (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר) מוח זבוב שליטה. תגובת bioluminescent שיא בגופי הפטריות (B). (ג) לפני הגירוי. (ד) תחילת התגובה. תגובת שיא (E). (F) תגובת CCB המשך. תגובת CCB נפילה (G). (H) סוף התגובה (BH: סרגל קנה מידה = 33 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. ניתוח נציג של הקלטת מדגם (א) תמונת פלורסנט של גוף הפטרייה של GA2 / +;. OK107 / + שליטה לטוס עם ארבעה שנבחרו על אונות CCB והמדיאלי (BA בקנה מידה של החזר על ההשקעהr = 50 מיקרומטר). תגובת פוטון נרשמה ב 100 אלפיות שניים - צבירת 10 שניות של תגובת bioluminescent לניקוטין 25 מיקרומטר (ב '). הצטברות 10 שניות של תגובת bioluminescent 100 מ"מ KCl נרשמה ב 100 אלפיות שניים (C). גרף (D) של מספר המוקלט של פוטונים הנפלטים במהלך תגובת ניקוטין בתוך ROI של 2 ו -4 מכסים את CCB תקין ואונות המדיאלי בהתאמה. גרף (E) של מספר המוקלט של פוטונים הנפלטים במהלך תגובת KCl בתוך של 2 ROI ו -4 מכסים את אונות CCB והמדיאלי תקין, בהתאמה. בD ו- E, ציר Y עזב תואם את המספר הכולל של פוטונים בתוך כל שדה הראייה, בעוד שציר Y תקין תואם את הפוטונים בהחזר על ההשקעה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"איור ניתוח איור 5. פרמטרים נציג של הקלטת מדגם ניתוח הנציג Excel של תגובת bioluminescent להפעלה ניקוטינית של גוף הפטרייה בGA2 / +;. OK107 / + זבוב שליטה. תגובה () פוטון לאורך הזמן בCCB ואונות המדיאלי. משך (B) של תגובות בCCB ואונות המדיאלי. הערך הגבוה ביותר פוטון (משרעת מרבי) בתגובה בתוך CCB והאונות המדיאלי (C). (ד) סך כל פוטונים בתוך CCB ואונות המדיאלי של כל תגובה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. שתי תגובה שונה בגוף פטרייה לאחר הגירוי של PNS thrATP ough וP2X 2. לטוס לדוגמא 1 להביע P2X 2 בPNS וה- GFP-aequorin בגוף פטרייה (GH146 / +; P2X 2 / MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP (מודעה) (א) תמונה של פלורסנט גופי פטריות עם של החזר על ההשקעה (בסולם. בר = 50 מיקרומטר) (תמונה. B) Bioluminescent של תגובת השיא בגופי פטריות לאחר הפעלה של PNS ידי P2X 2 מגורה עם 500 מיקרומטר ATP, שנצפה בעיקר באונות המדיאלי. (תמונת Bioluminescent תגובת KCl שיא C). (ד ) כמובן זמן של פליטת פוטון באזורי החזר על השקעה, בכל התגובה לדוגמא 2 זבוב להביע P2X 2 בPNS וה- GFP-aequorin בגוף פטרייה (GH146 / +;. P2X 2 / MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP (אה ). (ה) תמונת פלורסנט עם (בר של ההחזר על ההשקעה בקנה מידה = 50 מיקרומטר). (תמונת Bioluminescent של התגובה המושרית בגוף הפטרייה הבאה F)ctivation של PNS ידי P2X 2 מגורה עם 1 המ"מ ATP, בשתי אונות וCCB. (G) תמונת Bioluminescent תגובת KCl שיא. כמובן זמן (H) של פליטת פוטון באזורי החזר על השקעה, בכל התגובה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

גישת GFP-aequorin פותחה לאחרונה מבוסס bioluminescent מוצגת כאן מאפשרת הקלטה פונקציונלית vivo של -activity Ca 2 + בתאי עצב שונים, כמו גם אם ארצה בכך, בסוג של תאים כמו תאי stellate כליות אחרים כפי שדווחה באל Cabrero et. 2013 5.

שינויים, ירי צרות, רכיבים נוספים, ושלבים קריטיים

תסיסנית בעלי

transgene GFP-aequorin (pG5A) 4 הוכנס לתוך וקטור pUAST ליצור שלושה קווי transformant עצמאיים 6. כל הקווים נבדקו לפליטת האור שלהם, וכולם היו מסוגל להגיב לin vivo Ca 2 + -activity 6. עם זאת הניסויים האחרונים יותר ציינו כי קו GA2 הוכנס על כרומוזום השלישי מייצר אות חזקה יותר מאשר o קו GA1 המוכנסn כרומוזום השני. הנה, נציגי התוצאות התקבלו על ידי שימוש בכטב"מ-GA2 חצה עם OK107 קו MB-ספציפי. יתר על כן, לאחרונה ב פייפר יצר מבנה GFP-aequorin תחת השליטה של ​​20XUAS אלמנט רגולציה (20X-G5A-2) ומבנה זה אומת במעבדה שלנו. בקצרה, זה נותן איתות חזקה מאוד, חזקה יותר מGA2 הרגיל שלנו, שלכן צריך להיות יותר יעילים ושימושי כדי לפקח על -activity Ca 2 + במבנים עמוקים יותר של המוח, כגון אליפסואיד-גוף נוסף. בנוסף, זה יכול להיות גם שימושי עבור הדמיה כמויות קטנות של תאי עצב או בסופי האקסון (קשרים סינפטיים).

הכנות להדמיה

למרות הזבוב יש קרח בהרדמה במהלך מיצוב והדבקה, חשוב לצמצם את הזמן על קרח. זבובים יש להעביר לבקבוקון זכוכית ושמרו על קרח למשך 2 דקות לפני שעברו לצלחת פטרי המצונןלמיצוב בקצה פיפטה. יש לנו לב שפרק זמן ממושך של הרדמה מפחית את הכדאיות של המדגם ועלול להחליש את התגובה. בצורה אופטימלית, אנחנו שומרים את הזמן של הרדמה קרח מתחת 5-10 דקות.

מקליטה והדבקה הן צעדים קריטיים. זה חיוני כדי להבטיח את הראש לטוס במקום לנתיחה והדמיה, כמו גם כדי למנוע דליפה של הפתרון של רינגר לקצה pipet ו / או מחוץ לתא ההקלטה. דבק שיניים (ובמידה פחותה דבק סיליקון) יהפוך דביק ולאחר מכן מתחיל להתייבש בהקדם שני הרכיבים משולבים. לכן זה קריטי כדי להחיל את הדבק בהקדם, כדי למנוע הדבקה והתקבצות של הדבק חלשים. בחלק מהמקרים יש לנו לב שסוגים חלופיים של קלטת ודבק, כאשר במגע עם הפתרון של רינגר, עשוי לשחרר מזהמים לפתרון של רינגר שיכול להשפיע על הזבוב והתגובה שלה, במיוחד כך לניסויים מוקדשים לtהוא לומד במערכת חוש הריח, באמצעות ריחות שונים. כתוצאה מכך, לנקוט זהירות כאן אם החלפת חומרים (ראה חומרים לזנים ספציפיים שאנחנו משתמשים).

צורות שונות של coelenterazine פותחו על מנת לייעל את פעילותה כגון המהירות של פליטת אור, -affinity Ca 2 + (רגישות), או את עוצמת פליטת אור 12. לדוגמא, coelenterazine הילידים הוא יציב יותר, וכך מתאים יותר של הדמיה לטווח ארוכה כמספר שעות, ואילו בנזיל-coelenterazine (גם בשם H-coelenterazine) תוצאות בפליטת אור גבוהה יותר מהר יותר ועם זמן מחצית חיים קצרים יותר. לקבלת מידע נוסף על צורות שונות של coelenterazine, לראות את כתובת האינטרנט ברשימת חומרים.

הַדמָיָה

יכולים להיות במעקב אותות פליטת אור עם מצלמת CCD מכפיל אלקטרונים (EM-CCD, מקורר ל -80 מעלות צלזיוס) מצוידים על מיקרוסקופ. התקנה זו חייבת bדואר שוכנו בתוך קופסא כהה הדוקה כדי למנוע זיהום לא רצוי (סביבה) אור. ההתקנה המתוארת בכתב היד הזה משתמשת בעדשת 20X טבילה-אובייקטיבית המאפשרת שדה הראייה של 400 x 400 מיקרומטר (512 x 512 פיקסלים). כדי לשפר את יחס האות לרעש, נתונים נרכשו עם זמן 0.100 שניות אינטגרציה (10 הרץ), ו -2 x 2 binning שימש (1 פיקסל = 1.2 x 1.2 מיקרומטר). x לרכוש ולאחסן נתונים, כל פוטון זוהה הוטל, y-קואורדינטות ונקודת זמן. בין 500 ל 600 ננומטר אורך גל, המצלמה EM-CCD (ראה תיאור מדויק בחומרי רשימה) יש יעילות הקוונטית של 96%.

אחד הפרמטרים החשובים ביותר להדמיה התפקודית של מוח in vivo הוא הפתרון הזמני. עד עכשיו, רוב טכניקת -imaging מבוססת הקרינה Ca 2 + כגון GCaMP וCameleon מספק פתרון זמני של כ -4 הרץ (250 אלפיות שני / מסגרת). לאחרונה, עם GFP-aequorin מבוסס פליטת אור הצלחנו לראיסדואר זמן הרכישה עד 100 אלפיות שני / מסגרת עם המצלמה EMCCD ואפילו עד 120 מסגרות / שנייה (8.3 msec / מסגרת) עם המצלמה ICDD מכפיל אלקטרונים 10. בהחלטה זמנית זה מתקרב לזה של טכניקות אלקטרו (בטווח של כ 1 אלפיות שני). בעוד רזולוציה גבוהה זמנית היא גם אינפורמטיבי וחיוני ללימודים מוקדשים לשידור סינפטי ופעילות גירוי מושרה, הוארך איטי עדיין חיוני Ca 2 + -kinetics גם מתרחש בתוך תאי עצב, למשל שחרור Ca 2 + מCa 2 + -stores תאית (לסקירה: Berridge et al, 2003 13.). לסוג השני זה, החלטה זמנית איטי היא עדיין מקובלת, בעוד הפוך, הם בדרך כלל דורשים Ca 2 + -affinity טוב יותר מהחיישן כדי להתגלות. דרישה זו הושגה עם GFP-Aequorin לזהות את שחרורו של 2 + Ca -stores תאיים במסוף האקסון של recept חוש הריחנוירונים ORS 7,8. לחלופין, בהתאם לתנאי הניסוי הרצויים, יכול לשמש זמן רכישה איטי יותר. לדוגמא, בO הארוך / הקלטות N, השתמשנו אינטגרציה 2 שניות פעמים בשל המספר הגדול של נקודות נתונים שנאספו (Minocci et al., 2013). בקיצור, תכונה מעשית אחד עם פליטת אור היא שההחלטה הזמנית יכולה להיות מותאמת בקלות על פי תנאי ניסוי הרצויים.

תאים חלופיים (ההתקנה של הזבוב) פותחו כדי להקל על המטרות של הניסוי. לדוגמא, למחקרים מבוססים על גירוי ריח טבעי, האנטנה חייבת להיות נקיה, ולכן גישה כמו זו שפותחה על ידי א Fiala 14 היא מתאימה ביותר (השתמשנו בגישה דומה לMurmu et al. 2010). בקצרה, בגישה זו, הזבוב הוא קשור (מודבק) על סיכת minutien בצוואר, אשר מודבק להחליק את מכסה פלסטיק המכיל חור קטן. חותם נוצרסביב החלק העליון של הראש של הזבוב. לאחר מכן, ירידה של צלצול מופקדת על הראש, ואת הקפסולה הראש היא גזור. באופן כזה, האנטנות נשמרות חופשיות וזמינים לחוש ריחות. באופן דומה, להקלטה לטווח הארוכה, כמו O / אפילו כמה ימים 10 הזבוב צריך N או להיות כל הזמן חופשי לאילוץ ככל האפשר, ובמקרים מסוימים האכילו (לדוגמא: עם נייר הספוג בנימי גלוקוז 5% פִּתָרוֹן). בנסיבות אלה הגישה של Fiala היא גם יותר מתאימה מאשר הגישה בקצה pipet הכחול (שיטת שנירקול).

ניתן לשלוט בכל יישומי התרופה חיצוני באמצעות מערכת זלוף כובד רב סתום 6 דרך. הזרימה יכולה להיות נשלטה באמצעות רגולטורי זלוף נפח מכוילים לפני כל פגישת הקלטה לזרימה של 2 מיליליטר / דקה. מנגנון ניקוז תמציות נוזלי בשיעור של 2 מיליליטר / דקה מתא ההקלטה באמצעות משאבת peristaltic מאפשר זרימה רציפה.

בכמה תנאים, בשל עלות יקרה של התרופה ו / או את כמות הסמים לשימוש, אחד הייתי רוצה להחיל רק כמויות קטנות של תרכובות. לפיכך, יש צורך להחיל אותו ישירות באמבטיה ולא דרך מערכת טפטוף. במקרה זה התריס חייב להיות סגור במהלך תהליך זה, כדי למנוע זיהום האור.

שיטות ניתוח

ספירות לשניות או ספירות לשניות לקואורדינטות שניהם נעשו שימוש על ידי הקבוצה שלנו לניתוח. ספירה לשנייה היא אולי מתאימה ביותר לתגובות בהירות במבנים שלמים ואילו ספירות לשניות ולתיאום (המייצג את נורמליזציה של התגובות לגודל של ההחזר על ההשקעה) הוא מתאים ביותר ומדויק לאוכלוסיות קטנות של תאים. שניהם ניתן לבחור בקלות בתוכנת הניתוח.

אחד היתרונות העיקריים של שימוש בגישת פליטת אור הוא הדרך שנרכשות ומאוחסנות נתונים (x, y, t פרמטרים שלכל נפלט פוטונים). ואכן, בזמן שכל שיטות הדמיה אחרות המשמשות במצב סטנדרטי כתמונה מלאה שנרכשה (בדרך כלל בפורמט TIFF), עם מערכת זו, אנו רוכש רק את האות הרלוונטית ומשמעותית על ידי אחסון רק קואורדינטות פיקסל אשר הופעלו על ידי האור ב משך מראש קצוב (אשר תואם את זמן רכישה או החלטה זמנית). כתוצאה מכך, האחסון של נתונים הוא באמת "אור" בהשוואה לאחסון תמונה מלאה, וכתוצאה מכך, עושה את זה קל יותר לנתח את הנתונים. לניתוח נתונים, אנו משתמשים בתוכנה נלוות (הצופה פוטון), המאפשרת הגדרה של זמן ההצטברות כרצויה. אז התצוגה של תמונה של האותות יכולה להיות מותאמת לפי צורך במטרה להציג באופן משכנע נתונים. במקביל התוצאות לכמת באותו הזמן ברזולוציה מ זמן רכישתם.

משמעות ויישומים ביולוגיים של הדמיה bioluminescent

כפי שצוין לעיל הדמיה סידן bioluminescent מציע שלושה יתרונות עיקריים לסידן שיטות הדמיה ניאון: (1) אזורים עמוקים יותר של המוח עשויים להיות צילם, (2) הדמיה יכולה להתרחש ברציפות במשך תקופות ארוכות כמספר שעות כO / N ואפילו בכמה מקרים עד יומיים, ו- (3) לאחרונה, עם רזולוציה של זמן גבוה יותר, עד 120 מסגרת / sec (8.3 אלפיות שני). המגבלה העיקרית של גישת bioluminescent בשל אי ההתאמה שלו עם תאורת confocal, שכתוצאה מכך אינו מאפשרת לנו לקבוע את העומק המדויק (Z-תכנית) של מבנים או נוירונים מופעלים.

היתרון הראשון של הדמיה bioluminescent, הדמיה של אזורי מוח העמוקים, הודגם בעבר בשנת 2007 על ידי ההדמיה של תגובה גבוהה אשלגן מושרה סידן בגוף אליפסואיד (EB), מבנה עמוק ממוקם באמצע של המוח, ללא לפני דיווחי אלקטרו או פונקציונליים 6 2 + -activity הספונטני בEB הבאה יישום של picrotoxin (חוסם של -receptors GABA) הוכחה כי הטבעת-נוירונים GABAergic של EB נוירונים אכן מעכבים (שתוארה ב :. חיתול ואח ', מאמר שהוגש).

היתרון השני, ארוך יותר וזמן ההקלטה רציפה, נוצל במספר מחקרים מהמעבדה שלנו. גירוי ריח נעשה שימוש כדי לבחון את הפעילות של תאי עצב במוח במחקרים קודמים 11,15,16. שימוש בהדמיה לטווח ארוך, עם זאת, המעבדה שלנו הייתה מסוגל להראות שינויים שלא דווחו בעבר בקינטיקה בתוך תאי העצב קולטני ריח לריחות. המחקר הראשון על ידי Murmu et al. (2010) הראה כי בעוד שגירויי ריח קצר (1-3 שניות) הציגו קינטיקה דומה והבדל מתון במשרעת, גירוי ריח ארוך יותר (5 שניות) גרם משרעת הרבה יותר גדול, כמו גם לשנות בקינטיקה / structיור של התגובה שיוחסה לחנויות סידן תוך תאי. מחקר שלאחר מכן הראה כי בעוד 5 יישומים רצופים של פולסים ריח 1 שניות ב 5 דקות במרווחים לא לשנות את התגובה שלהם סידן, להגדיל את האורך של הגירוי לשניות 5 הובילו להנחתה מתקדמת של התגובה, המצביע על תהליך הסתגלות. יתר על כן תופעת הסתגלות זה נראה שיזם רגולציה GABAergic חנויות סידן זוהו בעבר 8. חשוב לציין נתונים זה גם מוכיח ש, בתנאי ניסוי זה, -sensor Ca 2 + של ה- GFP-aequorin יכול לזהות ולעקוב אחרי סידן שוחרר מCa 2 + -stores תאית. מחקר ייחודי נוסף מהמעבדה שלנו משמש O ההדמיה bioluminescent / N להקליט פעילות בסיסית (ספונטנית) באוכלוסיות נוירונים וגליה כל במוח, כמו גם פעילות בגופי פטריות 10. הקלטות אלה חשפו פעילות ספונטנית מפתיעה בנמליםמרכז ennal mechanosensory והמוטורי (AMMC) ואונת מחושים. יתר על כן, פעילות אוטונומית בלתי צפוי בתא גליה המתרחשת לאורך כל הלילה. בתוך גוף הפטרייה המחקר זוהה שתי פעילות punctate ושתי פסגות ייחודיות, אחד קצר ואחד ארוך שכיחות שהשתנתה עם גיל 10.

במחקר האחרון במעבדה שלנו, השתמשנו הדמיה bioluminescent לבחון את ההשפעות של המניפולציה של מולקולות איתות המשניות מעורבות בזיכרון, וכיצד הם משפיעים על תגובת סידן בתוך גוף הפטרייה 9. ואכן, למרות שטמבל וכרוב זוהו לפני יותר מ -30 שנים וידועות להסדיר את הרמה של מחנה, ההשפעות שלהם in vivo על מנגנונים תאיים ופיסיולוגיים ובמיוחד על -response Ca 2 + עדיין יישארו במידה רבה לא ידועות. עם גישת GFP-aequorin, יש לנו כבר (structur הדנדריטים מסוגלים להקליט שני הגביע בו זמניתes) והתא-הגוף, כמו גם תחזיות axonal ברמה של האונות, ובכך מאפשרים לנו לתאם את הרמה והקינטית של התגובה בתאים השונים של מבנה מורכב מאוד זה.

היישום האחרון אנו מפתחים מחקה תגובה טבעית באמצעות אוכלוסיות עצביות מלאכותי הפעלת presynaptic למבנה של עניין. לשם כך אנו מבטאים את הקולטן P2X 2, ערוץ קטיון מגודרת ליגנד שהוא מגיב לATP, בנוירון presynaptic ולהביע GFP-aequorin באוכלוסייה העצבית פוסט-סינפטי. ההפרדה של שני האלמנטים הללו לאוכלוסיות עצביות שונות דורשת שתי מערכות נפרדות ביטוי. לשם כך LexA לבנות המכיל GFP-aequorin נוצר. בניסויים הראשוניים שלנו עם מערכת זו שהבענו P2X ​​2 בקבוצת משנה של PNS באמצעות Gal4-GH146 עם כטב"מ-P2X 2 וה- GFP-aequorin בגוף הפטרייהבאמצעות קו LexA MB247 בשילוב עם LexA-13x-GFP-aequorin. יש לנו בהצלחה נרשמו תגובות סידן בגוף הפטרייה עם גירויים של 1 מ"מ ATP לקולט P2X 2 בPNS (איור 6).

לסיכום, גישת GFP-aequorin פליטת אור הוכיחה להיות שימושי בהקלטת הגירוי הנגרם על Ca 2 + -activity, מקביל לCa 2 + -indicators האחר. אבל יותר חשוב, זה גם מאפשר זיהוי של Ca 2 + הספונטני -activity בתוך המוח. גישה זו פותחת אפשרויות עתידיות לניסויים לטווח ארוכים והדמיה המוח כולו שיכול להגדיל את עומק ההבנה של התופעות הפיזיולוגיות ודפוסי פעילות בתוך המוח שלנו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma-Aldrich S3014
CaCl2 Merck 1023911000
HEPES Sigma-Aldrich 7365-45-9
KCl prolabo 26 764.298 normapur
MgCl2 prolabo 25 108.295 normapur
sucrose Sigma-Aldrich S0389
Nicotine Sigma-Aldrich N3876
ATP Sigma-Aldrich A2383 Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate
benzyl-coelenterazine Prolume, nanolight  Cat #301 Coelenterazine h http://www.prolume.com/
dental glue 3M ESPE™ 46954 Protemp IV
silicon glue 3M ESPE™ 36958 Express 2 Regular Body Quick
tape 3M Scotch 122s 3M Scotch Magic Tape
pipette tips Corning Incorporated 4868 100-1,000 µl Univesal Pipette Tip
chamber and holder (stage) hand made
incubation box hand made
forceps (No. 5) Fine Science Tools 11252-00 Micro-dissecting forceps
curved forceps Sigma-Aldrich F4142 Micro-dissecting forceps
glue applicator  hand made 
knife Fine Science Tools 10316-14 5 mm Depth 15° stab
EM-CCD camera  Andor DU-897E-CS0-#BV iXon (cooled to -80 °C)
Microscope Nikon Eclipse-E800
immersion objective lens Nikon 20X Fluor .5w
dissection microscope with fluorescence Leica MZ Fl III leica dissection scope and florescent lamp
tight dark box Science Wares Custom built by Science Wares
peristaltic pump  Gilson Minipuls 2
tubing Fisher Scientific depends on thickness Tygon R3603, St-Gobain
perfusion system Warner 64-0135  (VC-66CS) Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel
perfusion regulators Leventon 201108 Dosi-flow 3
measurement and automation explorer Sciences Wares & National Instruments N/A software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon imager  Science Wares & National Instruments N/A software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon viewer Science Wares & National Instuments N/A software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Excel Microsoft N/A software https://www.microsoft.com
virtual dub open access  N/A software http://virtualdub.sourceforge.net/
UAS-GA2 Martin et al., 2007, Ref. 1  N/A No stocks {currently} publicly available 
pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP   B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA.  (STOCK #1117340) pfeifferb@janelia.hhmi.org
P2X2 Lima and Misenboeck, Ref. 11  N/A No stocks {currently} publicly available 
OK107 Bloomington stock center 854 http://flystocks.bio.indiana.edu/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martin, J. -R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
  2. Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).
  3. Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).
  4. Baubet, V., et al. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).
  5. Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells. Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943 (2013).
  6. Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos. J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).
  7. Martin, J. -R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brûlet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2 (3), e275 (2007).
  8. Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).
  9. Murmu, M. S., Stinnakre, J., Réal, E., Martin, J. -R. Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila. BMC Neurosci. 12, 105 (2011).
  10. Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -R. PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons. eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).
  11. Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -R. In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach. BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).
  12. Lima, S. Q., Miesenböck, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121 (1), 141-152 (2005).
  13. Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).
  14. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).
  15. Fiala, A., Spall, T. In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression. Sci STKE. 2003 (174), PL6 (2003).
  16. Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
  17. Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe. Science. 303 (5656), 366-370 (2004).

Tags

Neuroscience גיליון 107 Ca כתב bioluminescent GFP-Aequorin גוף פטרייה P2X תסיסנית פעילות ספונטנית
<em>בגישת</em> ההדמיה התפקודי של מוח <em>Vivo</em> בהתבסס על סידן Bioluminescent המחוון GFP-aequorin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lark, A. R., Kitamoto, T., Martin,… More

Lark, A. R., Kitamoto, T., Martin, J. R. In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin. J. Vis. Exp. (107), e53705, doi:10.3791/53705 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter