כאן אנו מציגים רומן Ca 2 + גישת -imaging באמצעות כתב bioluminescent. גישה זו משתמשת בGFP-aequorin מבנה התמזגה אשר נקשר Ca 2 + ופולט אור, ומבטל את הצורך בעירור אור. באופן משמעותי בשיטה זו מאפשרת הדמיה ארוכה רציפה, גישה למבני מוח עמוקים ורזולוציה גבוהה זמנית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בגישת ההדמיה התפקודי של מוח Vivo בהתבסס על סידן Bioluminescent המחוון GFP-aequorin
במאמר זה
סיכום
תקציר
פונקציונלי in vivo ההדמיה הפכה לגישה רבת עוצמה כדי לחקור את הפונקציה ופיזיולוגיה של תאי מוח ומבנים של עניין. לאחרונה שיטה חדשה של Ca 2 + -imaging באמצעות GFP-aequorin כתב bioluminescent (GA) פותחה. טכניקה חדשה זו מסתמכת על השילוב של גני GFP וaequorin, ייצור מסוגל מחייב סידן ומולקולה - בתוספת coelenterazine cofactor - פולטות אור בהיר שיכול להיות במעקב באמצעות אספן פוטון. קווים מהונדסים נושאים את גן GFP-aequorin כבר נוצרו עבור שני עכברים ודרוזופילה. בדרוזופילה, גן GFP-aequorin הושם תחת השליטה של מערכת הביטוי בינארי GAL4 / כטב"מ המאפשרת ביטוי ממוקד והדמיה בתוך המוח. שיטה זו לאחר מכן הוצגה להיות מסוגלת לזהות שני פנימה Ca 2 + -transients וCa 2 + -released מחנויות פנימיות. והכי חשוב זה מאפשר לזמן רב יותר בהקלטה רציפה, הדמיה בעומקים גדולים יותר במוח, והקלטה ברזולוציות גבוהות זמניות (עד 8.3 אלפיות שני). כאן אנו מציגים שיטה הבסיסית לשימוש בהדמית bioluminescent להקליט ולנתח Ca 2 + -activity בתוך גופי פטריות, מבנה מרכזי ללמידה וזיכרון במוח הזבוב.
מבוא
הדפוסים והתפקוד של פעילות במוח והמבנים הדיסקרטיים הבסיסיים כבר זמן רב על שטח של מחקר אינטנסיבי בתחום מדעי המוח. אולי חלק מהגישות המוצלחות המוקדמות נהגו לטפל בבעיה זו היו מדידה פיזיולוגית ישירה של השינוי בפעילות חשמלית - שיטות חלופיות עם זאת, המאפשרות הדמיה חיה של שינויים בריכוזי מתח, pH או סידן (כמו פרוקסי לפעילות) הביאה יכולות נוספות ל המחקר של פעילות עצבית 1. טכניקות הדמיה לבצע מגוון רחב של יתרונות כגון הפולשנות מופחתת ואת היכולת לעקוב אחר פעילות בתוך מבני מוח כולו. יתר על כן בבעלי חיים עם גנטיקה צייתנית כוללים זבוב הפירות דרוזופילה, פיתוח של אינדיקטורים סידן מקודדים גנטיים, כגון Cameleon, GCaMPs ואחרים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת דוגמאות
- הכנה של פתרונות ולהגדיר
- לשמור את כל קווי תסיסנית melanogaster ב 24 מעלות צלזיוס במדיום מזון סטנדרטי. אחורי ולשמור אותם בצפיפות נמוכה בבקבוקון כדי ליצור גודל סטנדרטי ומשקל של זבובים.
- הוסף 10 נקבות הבתולה עם 10 גברים בבקבוקון, לתת להם להזדווג ולהעביר אותם כל 2 ימים לבקבוקון טרי. אז 10 ימים לאחר מכן, כאשר הזבובים מתחילים eclose, לקצור את הזבו....
- לשמור את כל קווי תסיסנית melanogaster ב 24 מעלות צלזיוס במדיום מזון סטנדרטי. אחורי ולשמור אותם בצפיפות נמוכה בבקבוקון כדי ליצור גודל סטנדרטי ומשקל של זבובים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ההיתוך של ה- GFP לaequorin מאפשר לנו לדמיין האזור של עניין לפני ההדמיה bioluminescent דרך עירור של ה- GFP במצב ניאון על המיקרוסקופ (איור 3 א, 4 א, א 6, 6-ה). אחת הדרכים הפשוטות ביותר כדי לעורר את גוף הפטרייה הוא באמצעות הפעלה של קולטני אצטילכולין ניקוטינית ionotropic. למרות אצטילכולין הוא יגנד אנדוגני של קולטן זה מצאנו כי ניקוטין מייצר תגובות לשחזור יותר בגופי הפטריות. זה בין שאר משום שהם במיוחד להביע קולטני אצטילכולין ניקוטינית, ובכך באמצעות ניקוטין אנו יכולים .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
גישת GFP-aequorin פותחה לאחרונה מבוסס bioluminescent מוצגת כאן מאפשרת הקלטה פונקציונלית vivo של -activity Ca 2 + בתאי עצב שונים, כמו גם אם ארצה בכך, בסוג של תאים כמו תאי stellate כליות אחרים כפי שדווחה באל Cabrero et. 2013 5.
שינויים, ירי צרות, רכיבים נוספים, ושלבים קריטיים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
אנו אסירי תודה ל-E. Karplus, מ-Sciences Wares, ארה"ב, על עזרתו ועצותיו היקרות והשימושיות. אנו מודים ל-E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier ו-J. Stinnakre על תרומתם לפיתוח ושיפור הטכניקה הזו. אנו מודים גם ל- B. Pfeiffer ו- G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., אשבורן, ארה"ב, על קו pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP. עבודה זו נתמכה על ידי מלגת שאטובריאן, שגרירות צרפת, וושינגטון, ארה"ב ל- A. Lark, על ידי הקרן הלאומית למדע (IOS 1352882) ל- T. Kitamoto, ועל ידי ANRs הצרפתיים (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, ו- FlyBrainImaging, 2011), Conseil Régional Ile-de France (NeRF ו- DIM), IFR-144, תוכנית ממשק Physique-Chimie-Biologie של CNRS (2009). ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCl | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl2 | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| ניקוטין | סיגמא-אולדריץ' | N3876 | |
| ATP | סיגמא-אולדריץ' | A2383 | אדנוזין 5&פריים;-טריפוספט דיסודיום מלח הידרט |
| בנזיל-קולנטרזין | פרולום, ננו-לייט | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| דבק שיניים | 3M ESPE™ | 46954 | |
| דבק סיליקון | 3M ESPE™ | 36958 | אקספרס 2 רגיל גוף |
| מהיר קלטת | 3M סקוטש | 122s | 3M סקוטש קסם קלטת |
| פיפטה טיפים | קורנינג משולב | 4868 | 100-1,000 ומיקרו; l תא ומחזיק קצה פיפטה Univesal |
| (שלב) | |||
| קופסת | בעבודת יד | ||
| (מס' 5) | Fine Science | Tools 11252-00 | מלקחיים מעוקלים מיקרו-ניתוחים |
| Sigma-Aldrich | F4142 | מלקחיים מיקרו-ניתוח | |
| עבודת יד | |||
| סכין | Fine Science Tools | 10316-14 | 5 מ"מ עומק 15° דקירה |
| EM-CCD מצלמה | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (מקורר ל-80 מעלות; ג) |
| מיקרוסקופ | ניקון | Eclipse-E800 | |
| עדשת אובייקטיבית טבילה | ניקון | 20X פלואור .5w | |
| מיקרוסקופ דיסקציה עם פלואורסצנטי | Leica MZ Fl III | היקף דיסקציה ומנורת פלורסנט | |
| קופסה כהה הדוקה | Science Wares | נבנה בהתאמה אישית על ידי Science Wares | |
| משאבה פריסטלטית | Gilson | Minipuls 2 | |
| Fisher Scientific | תלוי בעובי | Tygon R3603, | |
| מערכת הזלוף | Warner | 64-0135 ( VC-66CS) | מערכת בקרת שסתומי זלוף, שלמה, עם שסתומי צביטה, |
| ווסתי זלוף | Leventon | 201108 | Dosi-flow |
| 3 מדידה ואוטומציה | Sciences Wares & National Instruments | N/A | תוכנה http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| הדמיית פוטון | סחורות מדעיות National Instruments | N/A | תוכנה http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| מציג פוטונים | Science Wares & National Instuments | N/A | תוכנה http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | תוכנת Microsoft | N/A | https://www.microsoft.com |
| דיבוב וירטואלי | גישה פתוחה | לא ישים | http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | לא ישים | : אין מניות {כרגע} זמינות לציבור |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | ב. פייפר, חוות ג'נליה, אשבורן ארה"ב. | (מלאי #1117340)pfeifferb@janelia.hhmi.org | |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | לא ישים | : אין מניות {כרגע} זמינות לציבור |
| OK107 | מרכז המניות בלומינגטון | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
מקורות
- Martin, J. -R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
