Abstract
近日， 果蝇产卵偏好已经成为一个听话的基因模型，研究简单的决策过程的神经基础。当选择的网站存入他们的蛋，雌蝇能居其选择的相对吸引力和选择的“较大的两种商品。”然而，如果一个人想采取系统的遗传筛选方法的搜索电路基础底层这个简单的决策过程，因为它们是基于人群的和费力的建立最产蛋偏好测定法是不实际的。为了增加单个雌性产卵偏好学习的吞吐量，我们开发了长达三十个人的每个可以同时测定产蛋偏好蝇以及确保每个女性具有高产蛋率的协议自定义腔室（使他们的偏好是容易辨别和更有说服力）。我们的方法是简单的执行并产生非常一致的结果。此外，这些室可以配备不同的附件，以允许视频记录产蛋动物，并为光遗传学研究提供光。本文提供了制造这些商会和程序准备在这些商会进行检测苍蝇的蓝图。
Protocol
1.准备苍蝇待测定
- 培养蝇在标准糖蜜/在培养箱玉米面媒体设定为25℃和65％的湿度。小心不要过度拥挤的小瓶。例如，将8名女性和男性6成窄食瓶。
注意：这里使用的“窄食小瓶”有2.3厘米内径。我们通常分配大约10毫升飞食品到每个小瓶中。我们用的飞食品配方说明如下：http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html。 - 2 - 3天后雌羽化， 如图1E制备用新鲜酵母膏小瓶中。通过混合6克活性酵母用10ml 0.5％丙酸使鲜酵母膏。用刮刀酵母膏施加到食品小瓶的侧壁。 20 35 eclosed女性在一起 - - 25雄性变成小瓶收集30。
- 一般情况下，收集来自那里的女性被收集在同一小瓶男性（以便节省时间和精力）。然而，如果有关于男性的生育能力的关注，使用WT男性代替。此外，酵母泥是刺激产蛋重要的，因此每日新鲜准备。
- 保持所收集的女性/男性在25℃，湿度65％，除非苍蝇温度敏感。
- 经过4〜 - 5天，检查瓶，看看女性是准备好产蛋实验。它们是准备当食物介质的表面是从幼虫在食品积极挖洞湿（ 见图1E - F）。
注：通常女性扣留产卵一次食品表面变湿和幼虫爬行。此步骤可确保女性都准备就绪时，他们遇到所需的纹理基板打好的鸡蛋（ 例如 ，〜1％琼脂糖）。
2.硐室施工，组装，实验设置
- 有一个加工车间建设丙烯酸产蛋室（ 网络连接古尔1A - D）。不同部分的工程制图示于图补充1 - 3高分辨率照片也可以在这里找到（http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf）。
- 插入塑料片成装载（顶部）片的腔室， 如图1C所示 。这可作为底面而载入飞入个人产蛋阿里纳斯。
- 麻醉于二氧化碳垫女性，单独加载它们到每个产蛋舞台。允许〜30分钟，苍蝇从二氧化碳中恢复，并成为适应新的环境。
- 准备琼脂糖基板。
- 为方便起见，继续融化的1％琼脂糖预制瓶在55℃水浴。
- 添加的库存蔗糖溶液（2M）的所需量到50毫升锥形管，并与琼脂糖适量混合。例如，以制备150mM的蔗糖基板，PLACE 2M的蔗糖溶液进入管750微升，然后用琼脂糖填充管10 ml刻度线。
- 制备中相同的方式在滑动基底但添加代替蔗糖溶液蒸馏水。
注意：在这个协议琼脂糖的最终浓度略小于1％。 1.1％，而在两个基板是相同的琼脂糖浓度 - 在我们的经验，琼脂糖的确切浓度不只要其被控制为〜0.9内无关紧要。
- 就拿基板（底）片室和吸管1000μl琼脂糖基板到每个槽， 如图1D所示。
- 允许琼脂糖巩固约30分钟。
- 一旦琼脂糖基板和苍蝇都准备好了，组装所有三块产蛋室，然后取出塑料片。
- 放置在室内飞孵化器。
注：产蛋实验长度可根据EXPE变化rimental需求。我们通常运行实验O / N（14 - 16小时）。此外，观察昼夜定时上产卵的喜好没有显著影响。 - 通过注入的 CO 2进入室麻醉雌性。拆卸腔，放弃麻醉苍蝇飞入太平间（ 即 ，一个空的咖啡能充满了一些玉米油）。就拿结果记录保存的照片（ 见图2）。
- 手动计数卵的数目，并计算偏好指数分析。计算偏好指数（N A - N B）/（N A + N B），其中N 一和N B上分别代表蛋的数量在现场与网站B，。
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Representative Results
产蛋室由几个部分组成：一基底（底）片，一个分频器（中间）片，装载（顶部）片，和2滑动门（ 图1A - D）。这些作品被用于前产蛋实验独立设置苍蝇和基板。 图1F显示了当雌性果蝇准备好产蛋瓶的外观。当苍蝇给出一个普通基材和含有蔗糖的衬底之间的选择，女性鲁棒优选平原基板产蛋如图2。
图1.产蛋钱伯斯和产蛋协议。（A）完全组装鸡蛋-laying室。 （ 二 ）反汇编作品。答：装件（上图），B：在除法器片（中），C：在基板（底）片。这些条的工程图纸示于补充图1 - 3（C）的装载件的腔室的。一个'：推拉门，一个“：导轨的塑料片被插入装载块以用作地板，以保持装载苍蝇代替我们通常把彩色磁带到塑料片材（红色箭头）的边缘。 （D）将基板（底部）和分频器（中）的腔室的部分。琼脂糖沉积到各个槽以用作产卵底物（箭头）。四边形概述了单个飞产蛋竞技场。（E ）收集女性/在一个yeasted小瓶男性0天（F）的第4天- 5收集女性/在一个yeasted小瓶的男性注意，幼虫和成年女性已经吃大部分酵母和食品的表面已成为幼虫占据。湿润的表面的食物的幼虫爬行防止女性在小瓶铺设更多的鸡蛋。 （G）示意图描绘了协议设置产蛋行为实验。 （请点击此处查看该图的放大版本）
图2.代表产蛋结果苍蝇蔗糖和平原基板之间选择。（A）野生型的产蛋结果侧视图苍蝇，当他们被给予蔗糖（150毫米）和滑动基板之间的选择。白盒概述了一只苍蝇一个鸡蛋铺设舞台。 （B）的产蛋结果的顶视图。白盒概述了一只苍蝇一个鸡蛋铺设舞台。 （C）偏好指数（当问及含有蔗糖基板和普通基材之间做出选择野生型PI）苍蝇。 - /总蛋号（在平原基板卵数蔗糖基板上的蛋的数目）：PI每个女性计算如下。错误条表示SEM。 （请点击此处查看该图的放大版本）
补充图S1 工程图纸的分频器和商会的衬底块。（A - A“）不同意见衬底片室的。（B - B'）的中间分隔片室的不同意见。D / 53716 / Supplemental1.jpg“的风格=”FONT-SIZE：14px的;行高：28px;“目标=”_空白“>（请点击此处下载该文件）
补充图S2 工程图纸商会的加载件。（A - A'）装载片室的上层不同的看法。 （B - B'）装载片室的底部层的不同意见（请点击此处下载该文件）
补充图S3。
补充图S4。配备了摄像头，录像产蛋钱伯斯配件和定制。（A）产蛋室期间产蛋实验13苍蝇。 Ctrax 14与扩展12用于跟踪苍蝇和定制MATLAB代码用于绘制轨迹。 （ 二 ）设置来照亮红色二极管灯产蛋基板吨。发光二极管（1）被连接到一个LED驱动器（2）。 LED强度是由微控制器控制（3）。关于相机跟踪动物异常照明条件下的更多信息，光传输系统，并见到朱等人 。和斯特恩等人 。 （C）红色发光二极管（灯灭）连接到的产蛋室顶部。 （ 四 ）红色发光二极管（光）连接到的产蛋室顶部。的红色LED的LED强度通常设置为大约10 - 10μW/毫米时CsChrimson 15被用来激活神经元。 （E）产蛋期间与红光（灯灭）的实验配备摄像头和LED视频记录苍蝇室。 （F）产蛋室期间与红光（指示灯亮）实验配备摄像头和LED视频记录苍蝇。 （T：28px;“目标=”_空白“>请点击这里下载此文件）
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Discussion
该商会在这里描述的协议具有比以前产蛋测定了一些改进。首先，它们提高显著测定单个动物的偏好的吞吐量。每个房间都可以分析30单身女性，它需要不到一个小时来设置。第二，它们增加超过以前的方法产蛋偏好的一致性。竞技场的尺寸的标准化，产蛋基板尺寸，和基片之间的距离可以更容易地不同实验天之间，并从不同的研究小组比较结果。第三，腔室可以配备附件以容纳更多的分析人想追求（ 补充 图4）。例如，对于行为分析，摄像机可以被附连到所述腔室的顶部，以记录苍蝇7,11-13。最重要的是，这种方法是可扩展的。这些腔室相对INEX沉思生产与加工车间的帮助。此外，它通常需要技术工人不到2小时，成立5室（150单身女性）值得产蛋化验。
其中一个研究单身女性的产卵偏好时的最关键因素是确保每一位女性被引打好的鸡蛋。 （“50对0蛋”的优先级高于“1对0蛋”的偏好更加有说服力）。该协议，妥善执行时，应该让普通野生型果蝇（广州S和w1118）每个女性O / N打下至少50粒/。几个因素导致了生产的女性具有较高的产蛋率。首先，我们应该照顾培养女性时，要分析不overpopulate小瓶/瓶。过度拥挤常常会产生较小的幼虫，它会发展成更小的女性，再就是减少鸡蛋。其次，应确保当混合在一起的智慧女性被检测有机会获得大量的酵母膏ħ男性在食品小瓶中。建议在0.5％的丙酸代替水被用于制备酵母膏因为丙酸不仅增加产卵，但也减少了在小瓶中的真菌感染。第三，应该不测定雌直到食物小瓶类似于图1F中所示的图像的幼虫/食品表面上;如果没有足够的产蛋剥夺，在室内检测时女性不会躺在尽可能多的鸡蛋。此外，请注意，这里使用的食品小瓶“窄瓶”。若用小瓶直径较大，需要增加被放置在小瓶女性/男性的数量，使得女性将准备在4待测定 - 第5天。
而这里具体描述的协议的重点检查女性的蔗糖和滑动基板之间的偏好，它可以适合于研究雌'在其它条件下的偏好。例如，这些室可以被用来阿萨较硬和较软琼脂糖之间选择ý果蝇的偏好时（ 例如 ，1％和1.5％的琼脂糖），以及在其他化学感受线索不同底物（ 例如 ，3％乙酸）。如果装配有盖即包含LED照亮的一个或两个衬底，腔室还可以提供一种有效的平台进行光遗传学研究（ 补充 图4）。
最后，值得注意的是，虽然此设置允许更高的吞吐量，用于分析果蝇的产蛋偏好，它有一些重要的限制。首先，腔室的固定尺寸限制了行为测定的灵活性。例如，一种需要，以测试如何其他参数（ 例如 ，基板之间的距离）可能影响蝇产卵偏好做出新的腔室。此外，该系统不捕获在野外复杂的环境中遇到果蝇。这是非常罕见的，苍蝇将有一个纯蔗糖基板与对大自然的产蛋一个纯色基板之间来决定。因此，虽然我们的分析是研究一个简单的决策任务的神经基础有效的，需要注意的具体“决定”使女性在我们商会可能不会ethologically有关。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Water bath | Fisher | 15-462-6Q | |
| LifeCam Cinema webcam | Microsoft | H5D-00013 | |
| Red LEDs | Cree | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| Egg-laying chambers | Custom Built | ||
| Camera holders | Custom Built | ||
| LED holders | Custom Built | ||
| Fly vials (narrow) | Genesee | 32-116BC |
References
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