Abstract
Nyligen har äggläggande föredrar Drosophila dykt upp som en genetiskt lätthanterlig modell för att studera neurala grunden för enkla beslutsprocesser. När du väljer platser för att deponera sina ägg, kvinnliga flugor är kapabla att rangordna den relativa attraktionskraft sina optioner och välja "större av två varor." De flesta äggläggande preferens analyser är inte praktiskt om man vill ta en systematisk genetisk screening för att söka efter krets grunden bakom denna enkla beslutsfattandet, eftersom de är populationsbaserad och mödosam att ställa upp. För att öka genomströmningen av att studera av äggläggande preferenser enstaka honor har vi utvecklat egna kammare som var och en kan samtidigt analys äggläggande preferenser upp till trettio enskilda flyger liksom ett protokoll som garanterar varje hona har en hög äggläggande hastighet (så att deras önskemål är lätt urskiljbar och mer övertygande). Vår strategi är enkel att utföraoch producerar mycket konsekventa resultat. Dessutom kan dessa kammare förses med olika tillbehör för att möjliggöra videoinspelning de äggläggande djur och leverera ljus för optogenetik studier. Den här artikeln innehåller ritningarna för att tillverka dessa kammare och förfarandet för framställning av flugorna som skall analyseras i dessa kammare.
Protocol
1. Preparering Flugor som skall analyseras
- Kultur flyger på standard melass / majsmjöl media på inkubator inställd på 25 ° C och 65% luftfuktighet. Var noga med att inte överbefolka flaskorna. Till exempel satte 8 kvinnor och 6 män i en smal mat flaska.
Obs! "Smal mat flaskan" som används här har en innerdiameter på 2,3 cm. Vi matas typiskt ca 10 ml flyga mat i varje flaska. Receptet flyga mat vi använde beskrivs här: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html. - 2 - 3 dagar efter honor eclosion, förbereda flaskor med färsk jäst pasta som visas i figur 1E. Gör färsk jäst pasta genom att blanda 6 g av aktiv jäst med 10 ml 0,5% proprionsyra syra. Använd en spatel för att tillämpa jäst pasta på sidoväggen av livsmedels ampuller. Samla 30 - 35 eclosed honor tillsammans med 20 - 25 män i flaskorna.
- I allmänhet samla hanar från samma flaskor där honorna samlas(För att spara tid och ansträngning). Men om det finns en oro fertiliteten hos män, använda WT hanar i stället. Dessutom är jäst pasta viktigt för att stimulera äggproduktionen därför förbereda den färska dagligen.
- Bibehålla de uppsamlade honor / hanar vid 25 ° C, 65% fuktighet, om inte flugorna är temperaturkänsliga.
- Efter ~ 4 - 5 dagar, kontrollera flaskorna för att se om honorna är redo för äggläggande experiment. De är redo när ytan av livsmedelsmediet är våt från larver aktivt gräva i mat (se figur 1E - F).
Obs: Kvinnor undanhålla normalt lägger ägg när maten ytan blir våt och genomsökning med larver. Detta steg säkerställer att kvinnor skulle vara redo att lägga många ägg när de stöter på substrat med önskad konsistens (t ex., ~ 1% agaros).
2. avdelningen Construction, Assembly, Assay Setup
- Har en mekanisk verkstad bygga akryl äggläggande kamrar (Figur 1A - D). Den tekniska ritning av olika delar visades i tilläggs Figur 1 -. 3 Högupplösta bilder kan också hittas här (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- Infoga plastark in loading (överst) bit av kammaren som visas i figur 1C. Detta fungerar som bottenytan under lastning flyger in individuella äggläggande arenor.
- Söva honor på en CO 2 pad och läsa dem individuellt i varje äggläggande arena. Tillåt ~ 30 min för flugor att återhämta sig från CO2 och att bli acklimatiserad till den nya miljön.
- Förbereda agarosen substrat.
- För enkelhetens skull hålla en färdiga flaska smält 1% agaros i en 55 ° C vattenbad.
- Lägga den önskade mängden av lager sackaroslösning (2 M) in i ett 50 ml koniskt rör och blanda det med lämplig mängd agaros. Till exempel, för att framställa 150 mM sackaros substrat, place fylla 750 ul av 2 M sackaroslösning in i röret och sedan röret med agaros till 10 ml-märket.
- Förbered plain substratet på samma sätt, men tillsätt destillerat vatten istället för sackaroslösning.
Obs: Den slutliga koncentrationen av agaros i detta protokoll är något mindre än 1%. I vår erfarenhet, inte den exakta koncentrationen av agaros ingen roll så länge den styrs till att vara inom ~ 0,9-1,1% och att de två substraten är av samma agaros koncentration.
- Ta substratet (botten) bit av kammaren och pipetten 1000 | il agaros substrat i varje tråg, såsom visas i figur 1D.
- Låt agaros stelna för ~ 30 min.
- När agarosen substrat och flugor är redo, samla alla tre delar av äggläggande kammaren och sedan ta ut plastarken.
- Placera kamrarna i flyga inkubatorer.
Obs: längd äggläggande experiment kan variera beroende på erfarenrimental behov. Vi kör typiskt experimentet O / N (14-16 h). Dessutom var ingen signifikant effekt av cirkadiska tids på äggläggande preferenser observerats. - Söva honor genom att injicera CO2 in i kammaren. Demontera kammaren, kasta sövda flugor i fluga bårhuset (dvs., Kan en tom kaffe fylld med några majsolja). Ta bilder av resultaten för bokföring (se figur 2).
- Räkna antalet ägg manuellt och beräkna preferensindex för analys. Beräkna preferens index (N a - N b) / (Na + Nb) där Na och Nb representerar antal ägg på plats en vs. plats B, respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De äggläggande kamrarna är sammansatta av flera delar: ett substrat (botten) stycke, en delare (mitten) stycke, en belastning (överst) stycke, och 2 skjutdörrar (Figur 1A - D). Dessa bitar används för att oberoende inställnings flugor och substrat före äggläggande experiment. Figur 1F visar hur flaskorna ska se ut när kvinnliga flugor är redo för äggläggning. När flugor ges möjligheten att välja mellan en vanlig substrat och en sackaros-innehållande substrat, kvinnor kraftigt föredrog vanligt substrat för äggläggning som visas i figur 2.
Figur 1. äggläggning Chambers och äggläggning protokoll. (A) Färdigmonterad ägg -laying kammaren. (B) demonterade bitar. a: lastningsstycket (överst), b: dendelningsstycke (mitten), c: substratet (botten) bit. Maskinritningar av dessa bitar är visade i Kompletterande Figur 1 -. 3 (C) Belastningen bit av kammaren. a ': skjutdörrar, A ":.. räls Plast ska infogas i laststycket att fungera som ett golv för att hålla de laddade flugorna på plats Vi sätter vanligtvis färg band på kanten av plastarken (röd pil). (D) substratet (botten) och avdelaren (mitten) bitar av kammaren. agaros är avsatt i enskilda tråg för att tjäna som äggläggande substrat (pilar). fyrsiding skisserar äggläggande arena för en enda fluga. (E ) Dag 0 insamlade kvinnor / män i en yeasted flaska (F) Dag 4 -.. 5 insamlade kvinnor / män i en yeasted flaska Observera att larver och vuxna kvinnor har ätit det mesta av jäst och ytan på maten har blivit upptas av larver. Den våta ytan mat kryper med larver hindrar kvinnor från att lägga fler ägg i flaskan. (G) Schematisk visar protokollet för att ställa upp äggläggande beteendeexperiment. (Klicka här för att se en större version av denna siffra)
Figur 2. Representant äggläggande Resultat för flugor Välja mellan sackaros och Plain substrat. (A) från sidan äggläggande resultat av vild typ flugor när de fick välja mellan sackaros (150 mM) och släta substrat. Vit ruta beskriver en äggläggande arena för en enda fluga. (B) Uppifrån av äggläggande resultat. Vit ruta beskriver en äggläggande arena för en enda fluga. (C) preferens index ( PI) av vild typ flugor när du ombeds att välja mellan en sackaros-innehållande substrat och en vanlig substrat. PI för varje hona beräknas enligt följande: (antal ägg på sackarossubstrat - antal ägg på de släta substraten) / totalt antal ägg. Felstapel visar SEM. (Klicka här för att se en större version av denna siffra)
Kompletterande Figur S1 Tekniska Ritningar för delaren och substrat Piece of kammaren.. (A - A ") Olika vyer av substrat bit av kammaren. (B - B) Olika vyer av mittdelnings bit av kammaren.d / 53716 / Supplemental1.jpg "style =" font-size: 14px; line-height: 28px; "target =" _ blank "> (Klicka här för att ladda ner filen)
Kompletterande Figur S2 Engineering Ritningar för lastning Piece of kammaren.. (A - A ') Olika vyer av det övre skiktet av last bit av kammaren. . (B - B) Olika vyer av bottenskiktet av last bit av kammaren (klicka gärna här för att ladda ner filen)
Kompletterande Figur S3.
Kompletterande Figur S4. Tillbehör och anpassning av äggläggande Chambers. (A) äggläggning kamrar utrustade med kameror till videoinspelning flyger under äggläggande experiment 13. Ctrax 14 med förlängningen 12 används för att spåra flugor och anpassade MATLAB koden används för att rita banor. (B) Setup för att belysa äggläggande substrat med röd ligh t. Lysdioderna (1) är anslutna till en LED-driv (2). LED intensitet styrs av mikrostyrenheten (3). För mer information om kameran, ljusleveranssystem och spårning av djur under onormala ljusförhållanden, se Zhu et al. och Stern et al. (C) Röda lysdioder (släckt) knutna till toppen av äggläggande kammare. (D) Röda lysdioder (ljus på) fäst vid toppen av äggläggande kammare. LED intensitet röda lysdioder är typiskt inställd på att vara runt 7-10 iW / mm när CsChrimson 15 används för att aktivera nervceller. (E) äggläggning kamrar utrustade med kameror och lysdioder för videoinspelning flugor under experiment med rött ljus (ljus av). (F) äggläggning kamrar utrustade med kameror och lysdioder för videoinspelning flugor under experiment med rött ljus (ljus på). (t: 28px; "target =" _ blank "> Klicka här för att ladda ner filen)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kamrarna och protokoll som beskrivs här har flera förbättringar jämfört med tidigare äggläggande analyser. Först, de ökar genomströmningen för analys av preferenser enstaka djur avsevärt. Varje kammare kan analysera 30 enstaka honor och det tar mindre än en timme att ställa upp. För det andra, de ökar konsistensen av äggläggande preferenser jämfört med tidigare metoder. Standardiseringen av dimensionerna hos arenan, storleken på äggläggande substrat, och avståndet mellan substrat gör det lättare att jämföra resultaten mellan olika experimentella dagar och från olika forskargrupper. För det tredje, kan kamrarna förses med bilagor för att rymma ytterligare analys man vill driva (Kompletterande Figur 4). Till exempel, för beteendeanalys, videokameror kan fästas på toppen av kammaren för att spela in flugorna 7,11-13. Viktigast av allt, är detta synsätt skalbar. Dessa kammare är relativt inextankfull för att framställa med hjälp av en mekanisk verkstad. Dessutom tar det normalt en fackman mindre än två timmar att sätta upp 5 kammare (150 enstaka honor) till ett värde av äggläggande analyser.
En av de mest kritiska faktorerna när studerar äggläggande föredrar enstaka honor är att se till att varje hona är trimmade för att lägga många ägg. (A föredrar "50 mot 0 ägg" är mycket mer övertygande än en preferens för "en vs. 0 ägg"). Detta protokoll, när de är korrekt genomförs, bör göra det möjligt regelbundna vildtyp flugor (Canton S och w1118) att lägga minst 50 ägg / per hona O / N. Flera faktorer bidrar till att producera honor med hög äggläggande takt. För det första bör en vara noga med att inte overpopulate ampullerna / flaskor vid odling honorna som skall analyseras. Överbeläggning ofta producerar mindre larver, som skulle växa till mindre honor som lägger färre ägg. För det andra bör man se till att kvinnor som skall analyseras har tillgång till massor av jäst pasta när de blandas samman with män i livsmedelsflaskor. Det rekommenderas att 0,5% proprionsyra syra i stället för vatten användas för framställning av jäst pasta eftersom proprionsyra syra inte bara ökar äggläggande men också minskar svampinfektion i flaskor. För det tredje bör man inte analysera honorna tills larverna / mat yta av maten flaskor ser ut på bilden som visas i figur 1F; om inte tillräckligt äggläggning berövas skulle honorna inte lägger så många ägg vid analys i kamrarna. Observera också att livsmedelsflaskor som används här är "smala flaskor". Om man använder flaskor med större diameter, måste man öka antalet honor / hanar att placeras i flaskan så att honorna skulle vara redo att analyseras i 4 - 5 dagar.
Medan det protokoll som beskrivs här är särskilt inriktad på att undersöka honor preferenser mellan sackaros och slätt underlag, kan den anpassas för att studera kvinnor preferens vid andra tillstånd. Till exempel kan dessa kammare användas för att assay flugor preferenser när man väljer mellan hårdare och mjukare agaros (t ex., 1% jämfört med 1,5% agaros), liksom substrat som skiljer sig i andra chemosensory ledtrådar (eg., 3% ättiksyra). Om utrustad med lock som innehåller LED för att belysa en eller båda substraten, kan kammaren också ge en effektiv plattform för att genomföra optogenetic studier (Kompletterande Figur 4).
Slutligen är det värt att notera att även om denna inställning tillåter högre genomströmning för att analysera äggläggande preferenser Drosophila, har det några viktiga begränsningar. Först den fasta dimensionen av kamrarna begränsar flexibiliteten i beteendeanalysen. Till exempel kommer man att behöva göra nya avdelningar för att testa hur andra parametrar (eg., Avståndet mellan substrat) kan påverka äggläggande preferenser flugor. Dessutom har detta system inte fånga den komplexa miljö Drosophila möter i naturen. Det är mycket sällsynt att flugor kommer att behöva välja mellan en ren sackaros substrat mot en ren vanligt substrat för äggläggning i naturen. Således medan vår analys är effektiv i att studera neurala grunden för ett enkelt beslut uppgift, måste man vara medveten om att de särskilda "beslut" honor gör i våra kammare kan inte vara etologiskt relevant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Water bath | Fisher | 15-462-6Q | |
| LifeCam Cinema webcam | Microsoft | H5D-00013 | |
| Red LEDs | Cree | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| Egg-laying chambers | Custom Built | ||
| Camera holders | Custom Built | ||
| LED holders | Custom Built | ||
| Fly vials (narrow) | Genesee | 32-116BC |
References
- Perisse, E., Burke, C., Huetteroth, W., Waddell, S. Shocking revelations and saccharin sweetness in the study of Drosophila olfactory memory. Curr. Biol. 23 (17), 752-763 (2013).
- Yamamoto, N. C., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat. Rev. Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
- Zwarts, L., Versteven, M., Callaerts, P. Genetics and neurobiology of aggression in Drosophila. Fly. 6 (1), 35-48 (2012).
- Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (27), 11352-11357 (2009).
- Miller, P. M., Saltz, J. B., Cochrane, V. A., Marcinkowski, C. M., Mobin, R., Turner, T. L. Natural variation in decision-making behavior in Drosophila melanogaster. PLoS One. 6 (1), 16436 (2011).
- Schwartz, N. U., Zhong, L., Bellemer, A., Tracey, W. D. Egg-laying decisions in Drosophila are consistent with foraging costs of larval progeny. PloS One. 7 (5), 37910 (2012).
- Yang, C. H., Belawat, P., Hafen, E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Drosophila egg-laying site selection a system to study simple decision-making processes. Science. 319 (5870), 1679-1683 (2008).
- Kacsoh, B. Z., Lynch, Z. R., Mortimer, N. T., Schlenke, T. A. Fruit flies medicate offspring after seeing parasites. Science. 339 (6122), 947-950 (2013).
- Wu, C. -L., Fu, T. -F., Chou, Y. -Y., Yeh, S. -R. A Single Pair of Neurons Modulates Egg-Laying Decisions in Drosophila. PloS one. 10 (3), e0121335 (2015).
- Yang, C. H., He, R., Stern, U. Behavioral and circuit basis of sucrose rejection by Drosophila females in a simple decision-making task. J. Neurosci. 35 (4), 1396-1410 (2015).
- Gou, B., Liu, Y., Guntur, A. R., Stern, U., Yang, C. H. Mechanosensitive neurons on the internal reproductive tract contribute to egg-laying induced acetic acid attraction in Drosophila. Cell Rep. 9 (2), 522-530 (2014).
- Stern, U., Zhu, E. Y., He, R., Yang, C. H. Long-duration animal tracking in difficult lighting conditions. Sci. Rep. 5, 10432 (2015).
- Zhu, E. Y., Guntur, A. R., He, R., Stern, U., Yang, C. H. Egg-laying demand induces aversion of UV light in Drosophila females. Curr. Biol. 24 (23), (2014).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat. Methods. 6, 451-457 (2009).
- Klatpoetke, N. C., et al. Independent Optical Excitation of Distinct Neural Populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
