Utilizando metodologías combinadas para definir el papel de la membrana plasmática de entrega Durante Axon ramas y morfogénesis neuronal

Cortney C. Winkle; Christopher C. Hanlin; Stephanie L. Gupton

doi:10.3791/53743

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Artículo de método

Utilizando metodologías combinadas para definir el papel de la membrana plasmática de entrega Durante Axon ramas y morfogénesis neuronal

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DOI:

10.3791/53743

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16 de marzo de 2016

Cortney C. Winkle¹ , Christopher C. Hanlin² , Stephanie L. Gupton¹^,²

¹Curriculum in Neurobiology, The University of North Carolina at Chapel Hill, ²Department of Cell Biology and Physiology, The University of North Carolina at Chapel Hill

En este artículo

Resumen

Las técnicas de microscopía óptica junto con ensayos bioquímicos dilucidan la implicación de la exocitosis mediada por SNARE en la ramificación de los axones dependiente de la netrina. Esta combinación de técnicas permite identificar los mecanismos moleculares que controlan la ramificación de los axones y el cambio de forma de las células.

Resumen

Durante el desarrollo neuronal, los axones en crecimiento se extienden a múltiples socios sinápticos mediante la elaboración de ramas axonales. La ramificación de los axones es promovida por señales de guía extracelular como la netrina-1 y da como resultado aumentos dramáticos en el área superficial de la membrana plasmática axonal. La ramificación del axón dependiente de la netrina-1 probablemente implica el control temporal y espacial de la expansión de la membrana plasmática, cuyos componentes se suministran a través de la fusión de vesículas exocíticas. Estos eventos de fusión están precedidos por la formación de complejos SNARE, que comprenden un v-SNARE, como VAMP2 (proteína de membrana asociada a vesículas 2) y t-SNAREs de membrana plasmática, sintaxina-1 y SNAP25 (proteína 25 asociada a sinaptosomasoma). En este trabajo se detalla un enfoque múltiple utilizado para examinar el papel de la exocitosis mediada por SNARE en la ramificación de los axones. La fortaleza del enfoque combinado es la adquisición de datos en un rango de resoluciones espaciales y temporales, que abarcan desde la dinámica de los eventos de fusión de vesículas individuales en neuronas individuales hasta la formación del complejo SNARE y la ramificación de axones en poblaciones de neuronas cultivadas. Este protocolo aprovecha los enfoques bioquímicos establecidos para analizar los niveles de complejos SNARE endógenos y la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) de neuronas corticales que expresan VAMP2 marcadas con una GFP sensible al pH (VAMP2-pHlourin) para identificar cambios dependientes de la netrina-1 en la actividad exocítica en neuronas individuales. Para dilucidar el momento de la ramificación dependiente de la netrina-1, se utiliza la microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) de lapso de tiempo de neuronas individuales del orden de horas. La inmunofluorescencia celular fija emparejada con neurotoxinas botulínicas que escinden la maquinaria SNARE y bloquean la exocitosis demuestra que la ramificación del axón dependiente de la netrina-1 requiere actividad exocítica mediada por SNARE.

Introducción

Estimaciones recientes sugieren que el cerebro humano contiene 10¹¹ neuronas con 10¹⁴ conexiones sinápticas¹, lo que destaca la importancia de la ramificación de los axones in vivo. Las señales de guía de los axones extracelulares, como la netrina-1, guían los axones a los socios sinápticos apropiados y estimulan la ramificación axonal, aumentando así la capacidad sináptica^2-5. La arborización axonal dependiente de netrina-1 implica una expansión sustancial de la membrana plasmática⁶, que hipotetizamos requiere la entrega de componentes adicionales de la membrana a través de la fusión de vesículas exocíti....