Actine corticale Débit en cellules T quantifiée par spatio-temporelle image spectroscopie par corrélation de Structured Illumination Microscopy données

George Ashdown; Elvis Pandžić; Andrew Cope; Paul Wiseman; Dylan Owen

doi:10.3791/53749

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Article de méthode

Actine corticale Débit en cellules T quantifiée par spatio-temporelle image spectroscopie par corrélation de Structured Illumination Microscopy données

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DOI :

10.3791/53749

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17 décembre 2015

George Ashdown¹ , Elvis Pandžić³ , Andrew Cope² , Paul Wiseman⁴ , Dylan Owen¹

¹Department of Physics and Randall Division of Cell and Molecular Biophysics, King's College London, ²Academic Department of Rheumatology, Centre for Molecular and Cellular Biology of Inflammation, Division of Immunology, Infection and Inflammatory Disease, King's College London, ³ARC Centre for Advanced Molecular Imaging, Australian Centre for NanoMedicine, University of New South Wales Australia, ⁴Departments of Chemistry and Physic, McGill University

Dans cet article

Résumé

Pour étudier les vitesses d’écoulement et la directionnalité de l’actine filamenteuse au niveau de la synapse immunologique des lymphocytes T, l’imagerie à super-résolution des cellules vivantes est combinée à la fluorescence par réflexion interne totale et quantifiée par spectroscopie de corrélation d’images spatio-temporelles.

Résumé

Filamenteuse-actine joue un rôle crucial dans la majorité des processus cellulaires, y compris la motilité et, dans les cellules immunitaires, la formation d'une interaction cellule-cellule clé connue sous le nom de la synapse immunologique. F-actine est également supposé jouer un rôle dans la régulation des distributions moléculaires à la membrane des cellules, y compris la dynamique de vésicules sous-membraneuse et le regroupement des protéines. Bien que les techniques de microscope optique standard permettent observations généralisées et limitée par la diffraction à faire, de nombreux événements cellulaires et moléculaires, y compris le regroupement et le flux moléculaire se produisent dans les populations à longueur des échelles bien en dessous du pouvoir de résolution de la microscopie optique standard. En combinant totale fluorescence par réflexion interne à la résolution d'imagerie procédé illumination structurée ultra microscopie, l'écoulement moléculaire à deux dimensions de la F-actine à la synapse immunitaire des cellules T a été notée. Spatio-temporelle spectroscopie de corrélation d'images (STICS) a ensuite été appliqué, ce qui génère resul quantifiablets sous la forme d'histogrammes de vitesse et des cartes vectorielles représentant directionnalité de l'écoulement et de l'ampleur. Ce protocole décrit la combinaison de l'imagerie et STICS techniques de super-résolution pour générer des vecteurs d'écoulement au niveau de détail sous-diffraction. Cette technique a été utilisée pour confirmer un flux d'actine qui est symétrique centripète rétrograde et tout au long de la périphérie des cellules T lors de la formation de la synapse.

Introduction

Le but de l'expérience est à l'image et de caractériser le flux moléculaire de filamentous- (F-) actine dans les cellules vivantes T, au-delà de la limite de diffraction afin d'établir le sens d'écoulement et de l'ampleur au cours synapse immunologique (IS) de la formation. Cette technique sera réalisée à l'aide d'un microscope à éclairage structurée (SIM) en mode fluorescence totale de réflexion interne (TIRF), l'imagerie de cellules T Jurkat qui font synapse artificielle sur l'activation des lamelles revêtues d'anticorps anti-CD28 et anti-CD3. Les formes se situe entre un lymphocyte T et sa cible; une cellule présentatrice d&....