Summary
Målet med denne protokollen er å vurdere spesifisiteten av kreftmedisiner in vitro ved bruk av blandede kulturer som inneholder både tumor og ikke-kreftceller.
Abstract
En fremgangsmåte for å vurdere spesifisiteten av anticancer legemidler in vitro ved bruk av kulturer inneholdende både tumor- og ikke-tumorceller er demonstrert. Det sentrale element er kvantitativ bestemmelse av en tumor-spesifikk genetisk endring i forhold til en universal-sekvens ved hjelp av en dobbel-sonde digital PCR-analyse, og den etterfølgende beregning av andelen av tumorceller. Analysen blir utført på en kultur inneholdende tumorceller fra en etablert linje og tilsatt-i ikke-tumorceller. Den blandete kultur behandles med et testmedikament i forskjellige konsentrasjoner. Etter behandlingen blir DNA fremstilles direkte fra overlevde klebende celler i brønnene av 96-brønners plater ved hjelp av en enkel og billig metode, og utsatt for en to-sonde digital-PCR-analyse for måling av en tumor-spesifikk genetisk endring, og en referanse universell sekvens . I den foreliggende demonstrasjonen er en heterozygot delesjon av NF1-genet anvendt som tumorspesifikke genetiske endring ogen RPP30 gen som referanse genet. Ved å bruke forholdet NF1 / RPP30, ble andelen av tumorceller beregnet. Siden den doseavhengige endring av andelen av tumorceller gir en in vitro indikasjon for spesifisitet av stoffet, vil denne genetiske og cellebasert in vitro analyse sannsynligvis ha anvendelse potensial i drug discovery. Videre, for personlig kreft-behandling, kan dette genetic- og celle-basert verktøy bidra til å optimalisere adjuvant kjemoterapi ved hjelp av testing effekt og spesifisitet av kandidat narkotika ved hjelp av primærkulturer av enkelte svulster.
Protocol
1. Klar Mix Kultur inneholder både tumorceller og ikke-kreftceller
- Bruke tumorceller fra en etablert cellelinje MPNST S462 5. Bruk fibroblaster som de ikke-tumorceller 6,7
- Kultur både tumorceller og fibroblaster i standard DMEM-medium med 10% føtalt bovint serum (BSA), 3 mM glutamin, 0,1 mM 2-merkaptoetanol, 500 U / ml penicillin, 500 pg / ml streptomycin og 1 mM natriumpyruvat ved 37 ° C og 5% CO 2 5-7. På under samløpet, høste celler med 0,05% trypsin og telle dem ved hjelp av en hemocytometer.
- Bland 400 tumorceller og 1600 ikke-tumorceller sammen i hver brønn av en 96-brønners dyrkingsplate i 0,2 ml medium. Tatt i betraktning raskere vekst av tumorceller over behandlingsperioden på 5 dager, ble den første andelen av tumorceller satt til 25%. Sett opp fire gjentak for hver legemiddelkonsentrasjon. Inkuber cellene ved 37 ° C og 5% CO 2 O / N.
2. Drug Treatment
- Bruk nilotinib som test stoffet. Forbered lager løsninger på 0, 2, 4 og 20 mM nilotinib i DMSO. Fortynn hver av dem ved 200-fold i 5 ml DMEM-medium, noe som gir 2-gangers konsentrerte legemiddel oppløsninger av 0, 10, 20 og 100 uM 6,7.
- Fjern 0,1 ml medium fra hver brønn og tilsett 0,1 ml av medium inneholdende medikament. Sluttkonsentrasjonene er 0, 5, 10 og 50 uM. Fortsett å inkubere cellene i medium inneholdende stoffet i 5 dager.
- Ved slutten av behandlingen, inspisere de vedlagte celler ved anvendelse av et fasekontrastmikroskop, og ta bilder. Aspirer medium bort, vaske levde klebeceller en gang med 0,2 ml PBS.
3. Klar DNA for Digital PCR
- Lyse cellene ved hjelp av HotShot 8.
- Tilsett 50 ul alkalisk lyseringsoppløsning (25 mM NaOH, 0,2 mM EDTA) til hver brønn. Tett brønnene med folie. Inkuber platen ved 95 ° C i en ovn eller på en varmeplate i 30 minutter. Sjekk under en microscope å sørge for at ikke mer intakte celler holdt seg på overflaten av brønnene. I tilfelle cellene ikke lysere helt, øke oppvarmingstiden eller legge vaskemiddel. Fryse dem en gang ved -20 ° C også forbedrer bryte celler.
- Tilsett 50 ul nøytraliserende oppløsning (40 mM Tris-HC, pH 4,0) til hver brønn. Overfør alle lysater inn i U-formede brønner i en PCR-platen, og tørk i en PCR-cycler ved 95 ° C i 10 til 30 min. Rekonstituer lysatene med 20 mL destillert vann.
- Avsalte ved hjelp av Drop-Dialyse 9
- bruke membranfiltre med midlere porestørrelse 0,025 mikrometer.
- Flyt filter på destillert vann med blanke siden opp i brønner på en 12-brønns plate. Fukt filter i 5 min. Vær oppmerksom for å unngå luftbobler mellom filteret og vann.
- Pipetter de rekonstituerte lysatene av hver prøve fra trinn 3.1.4 forsiktig inn på hver av de 4 deler av filteret. Dekk platen og dialyser i 30 til 60 min.
- Suge bort vannet under filteret uten å vippe over filteret eller forstyrre dråpene.
- Overfør lysatet-dråper inn i brønner i en ny PCR-plate. Tørk de DNA-dråper ved oppvarming ved 95 ° C i 10 til 30 minutter i en PCR cycler. Rekonstituere lysatene i 10 ul vann.
4. Digital PCR
- Tine frosne komponenter slik som DNA, buffer og analyseblandingen ved RT, spinne ned i 10 sekunder ved maksimal kraft i alle tilgjengelige sentrifuge (for eksempel, VWR mini-sentrifuge) og deretter holde dem på is.
- Forbered mester blanding som inneholder alle komponenter unntatt DNA (tabell 1). Tenk dødt volum og beregne mester blanding ca 10% mer enn det nødvendige beløpet.
MERK: Bruk primere og prober som brukes i kommersielle kit. - Vortex masterblandingen, spinne ned i 10 sekunder ved maksimal kraft i alle tilgjengelige sentrifuge (for eksempel, VWR mini-sentrifuge) og dispenser 15 ul til hver enkeltbrønn av en 96-PCR-plate. Legg alle lysat (som inneholder DNA) av hver prøve til brønnene som inneholdt masterblandingen. Overføring 20 pl av hver reaksjonsblanding inn i en brønn på prøvesiden av en patron ved RT.
- Tilsett 70 mL av dråpe generator olje i hver brønn på oljesiden av en patron. Lukk patron med pakningen og plassere hele innstillingen til en dråpe generator. Begynn dråpe generasjon.
- Overføre 40 ul dråpe-oppløsning inn i brønner på en 96-brønners PCR-plate. Tett plate med en folie og legg platen inn i en PCR cycler. Still lokk-temperatur på 105 ° C og rampehastigheten ved 2 ° C / sek. Utføre PCR med innstillingene i tabell 2. Etter PCR, overføre platen inn i en dråpe leser og begynne å lese. Alternativt lagre platen ved 4 ° C i opptil 24 timer.
5. Beregning Andel av tumorceller
- Legg den digitale PCR data og utføre automatiske analyser.
- Kontrollere resultatene av hver analyse manuelt ved å inspisere den en-dimensjonale og to-dimensjonale fordeling av de positive og negative dråper, og for at de er godt atskilt, og terskel linjene var i riktig posisjon. Utelate resultater som ikke oppfyller kriteriene, for eksempel ingen klart skille positive og negative dråper, fra videre analyse. Kopier den resulterende forholdet NF1 / RPP30 inn et Excel-ark.
- Beregn andelen av tumorceller som: 2 x (1- NF1 / RPP30).
6. Doseavhengig Endring av Andel av tumorceller
- For hvert medikament-konsentrasjon, beregne gjennomsnitt og standardavvik fra de 4 gjentak. Plott midlene og standardavvik mot narkotika-konsentrasjoner.
Representative Results
Kvaliteten på DNA utarbeidet etter den kombinerte HotShot / Drop-Dialyse er tilstrekkelig for tilfredsstillende digital PCR (figur 1B). For 2000 fibroblaster, ca 3000 ± 500 positive dråper ble oppnådd, tilsvarende 75% av de forventede 4000 eksemplarer (to eksemplarer i en celle). I denne studien svulstcellene var fra en etablert linje MPNST S462 som er kjent for å ha en heterozygote sletting av NF1-genet 5. Denne 50% genet dosereduksjon ble klart påvist ved de to digitale PCR-analyse (figur 1B). I motsetning til dette ble det gjennomført to kopier av dette genet målt i fibroblaster. Denne genetiske forskjell mellom tumor og ikke-tumorceller muliggjør beregning av andelen av tumorceller i blandede kulturer (figur 2). Ved å måle den relative genet dosering av NF1 til RPP30, kan andelen av tumorceller i en blandet kultur bestemmesved hver legemiddel-konsentrasjon (figur 3).
Figur 1. Digital PCR. (A) illustrasjon av prinsippet. (B) en dual-probe-analysen avslører redusert mengde av et mål (NF1) genet i tumorceller MPNST S462 i forhold til en referanse (RPP30) genet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Beregnet Andel av tumorceller. Tumorceller og ikke-tumorceller ble blandet i forskjellige forhold, og sådd ut i hver brønn av en 96-plate. Etter festing O / N, ble cellene lysert vetth HotShot / Drop-dialyse og avsaltes lysatene ble utsatt for digital PCR som ga forholdet NF1 / RPP30. Base på dette forhold, ble andelen av tumorceller i hver brønn beregnes. Gjennomsnitt og standardavvik av andelen av tumorceller ble beregnet fra 4 replikater på hver set-up andel. De beregnede andelen av tumorceller (Y-akse) ble plottet mot set-up proporsjoner (X-aksen). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Doseavhengig Endring av Andel av tumorceller. (A) doseavhengig reduksjon av synlige vitale celler. (B) andelen av tumorceller (gjennomsnitt og standardavvik av 4 replikater) beregnet fra forhold på NF1: RPP30, redusert i området fra 0 - 10 uM. Ved høyeste dose 50 M, ble noen viktige celler igjen, sannsynligvis på grunn av giftig effekt til alle celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 4. Skille Reaksjon av tumorceller fra den i ikke-tumorceller (A) levedyktighet og / eller proliferasjon av totale celler kan måles ved hjelp av konvensjonelle analyser; Andelen av tumorceller kan bestemmes ved å bruke fremgangsmåten vist i denne studien. (B) ved hjelp av de to parametere, kan responsen av totale celler i en blandet kultur til en medikament deles i respons av tumorcellene og respons hos den ikke-tumorceller..com / filer / ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| en reaksjon | ||
| 2 x ddPCR SuperMix | 12 | |
| Analyseblanding for NF1 | 1.2 | |
| Analyseblanding for RPP30 | 1.2 | |
| HaeIII | 0.6 | |
| delsum | 15 | Master blanding |
| DNA | 9 | |
| Total | 24 | Endelig PCR Blanding |
Tabell 1 Klar Dual ddPCR Reaction
| Skritt | Handling | Temperatur | Tid | Cycles |
| 1 | Polymslette aktivering | 95 ° C | 10 min | 1 |
| 2 | DNA denaturering | 94 ° C | 30 sek | 40 |
| 3 | Gløding / exetension | 60 ° C | 1 min | |
| 4 | polymerase deaktivering | 98 ° C | 10 min | 1 |
| 5 | Hold (valgfritt) | 4 ° C |
Tabell 2 PCR cycler Innstillinger
Discussion
Nøkkeltrinnet i denne genetic- og celle-baserte verktøy for å vurdere medikament spesifisitet in vitro er bestemmelse av andelen av tumorceller ved hjelp av en eller flere av tumor-spesifikke genetiske trekk. I motsetning til konvensjonelle fenotypiske egenskaper 7, genetiske egenskaper er bestemt, stabil og lett å kvantifisere. For eksempel, er en tumor-spesifikk mutasjon eller kopitall variasjon til stede utelukkende i tumorceller, men ikke i ikke-tumorceller. En slik genetisk stigma kan bli pålitelig og nøyaktig kvantifisert, for eksempel ved hjelp av digital PCR som vist i denne studien.
For digital PCR, er høy renhet av DNA ikke avgjørende. Imidlertid avsalting og fjerning av inhiberende molekyler er nødvendig, som kan oppnås ved en rulle dialyse ved bruk av et passende filter. Den kombinerte lysis og drop-dialyse er enkel og rask, krever ingen spesielle instrumenter og kan derfor utføres på en hvilken som helst standard laboratorium. Dersom cellene ikke Break godt, kan ytterligere behandling betraktes som frysing av cellene ved -20 ° C, tilsetning av vaskemiddel og / eller ved hjelp av protease.
I denne studien ble heterozygot sletting av NF1-genet brukes som tumor spesifikk funksjon for kvantifisering. På samme måte kan delesjoner av andre gener eller loci også anvendes. Videre kan mutasjoner også brukes til å kvantifisere tumorceller. I et slikt tilfelle digitale PCR-analyser for mutanten og de normale alleler må være stor utstrekning valideres for å sikre deres spesifisitet for hver av dem.
Doseavhengig andel av tumorceller gir en indikasjon for narkotika-spesifisitet eller selektivitet. I tillegg gjør det også ekstrahere responsen av tumorceller fra responsen av totale celler i en blandet kultur til en medikament (figur 4). Dette utvinning strategien gir en løsning for den tekniske problem i å bruke primærkulturer (som inneholder både svulsten og ingenn-tumor celler) for narkotika-testing.
Den genetic- og cellebasert in vitro verktøy demonstrert i denne studien kan derfor ha anvendelsespotensial (1) i narkotika-funn hvor det gir en plattform for å vurdere stoffet spesifisitet eller selektivitet in vitro og (2) i personlig kreftomsorgen der det muliggjør testing narkotika i primærkulturer og dermed kan bidra til narkotika-utvalget i adjuvant kjemoterapi 4. Videre kan farmakologiske mekanismen av et medikament bli studert ved hjelp av dette verktøyet, siden viss genetisk endring eller flere genetiske forandringer kan følges under legemiddelbehandling.
En vanskelighet i å bruke individuelle primære kulturer er mangelen en universell genetisk funksjon for kvantifisering av tumorcellene. Men med dagens forhånd whole-genomet sekvensering, er de hyppigst forandres gener og regioner er kjent for vanlige tumorer. For eksempel, blant hode og nakketumorer, 71%, 23% og 22% har mutasjoner i TP53, FAT1 og CDKN2A gener, og 60%, 34% og 26% har delesjoner i genet regioner av CDKN2A, STK11 og PTEN, henholdsvis 10. Screening 5 til 10 slike gener eller / og regioner ved hjelp av målrettet-sekvensering og / eller digital PCR vil derfor sannsynligvis identifisere en eller flere genetiske endringer som kan anvendes for kvantifisering av tumorceller i den utledede primærkulturen. En annen begrensning er ofte utilstrekkelig mengde resected svulster for å sette opp primærkulturer.
Til tross for de fordelaktige egenskaper og lovende anvendelsespotensial for den genetic- og cellebasert in vitro verktøy, bør sine begrensninger holdes i bakhodet og dens in vitro natur bør vektlegges. For eksempel, den differensielle effekter eller cytotoksisitet av et medikament for tumorceller kan snarere på grunn av forskjell i celletyper (fibroblaster vs Schwannske celler) eller sinulikt opphav (fra forskjellige individer). Den sterkere effekt av et legemiddel på tumorceller enn på ikke-tumorceller, kan også forklares ved det faktum at de førstnevnte vokser hurtigere enn den sistnevnte. Viktigst, celler in vitro oppførsel avviker enn celler i menneskekroppen og dermed resultater av in vitro-evaluering ofte ikke eller bare delvis gjenspeiler den reelle kliniske situasjon. Derfor, effekt, cytotoksisitet og spesifisitet av medikamenter som oppnås for dyrkede celler er heller fra biomarkør naturen, men har ikke påliteligheten av preklinisk målte effekt av antibiotika. Likevel flytter fra cellelinjer til blandede kulturer og / eller primærkulturer er et skritt fremover i å vurdere legemiddeleffekt og spesifisitet / selektivitet in vitro. Med omfattende innsats, in vitro forhold kan bli funnet som gjør rimelig korrelasjon av in vitro data med ekte reaksjoner fra pasienter, i hvert fall for noen stoffer.
Acknowledgments
Mrs. Alster, Mr. Honrath og Dr. Jiang er verdsatt for sine fremragende teknisk assistanse. Også pris er Dr. Volz og forskergruppen av Dr. Dandri for å gi tilgang til sine digitale PCR-enhet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Membrane filter of 25 mm diameter | Merk-Millipore | VSWP 02500 | For drop-dialysis |
| ddPCR assay for NF1 | BioRad | dHsaCP1000177 | FAM-labelled |
| ddPCR assay for RPP30 | BioRad | dHsaCP2500350 | HEX-labelled |
| QX200 | BioRad | 186-4001 | The previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200 |
| Droplet oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartriges | BioRad | 186-3004 | |
| Gaskets | BioRad | 186-3009 | |
| Cartrige holder | BioRad | 186-3051 | |
| Pierceble foil | BioRad | 181-4040 |
References
- Caponigro, G., Sellers, W. R. Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 179-187 (2011).
- McMillin, D. W., Negri, J. M., Mitsiades, C. S. The role of tumour-stromal interactions in modifying drug response: challenges and opportunities. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 217-228 (2013).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).
- Edwards, A. M., et al. Preclinical target validation using patient-derived cells. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 149-150 (2015).
- Frahm, S., et al. Genetic and phenotypic characterization of tumor cells derived from malignant peripheral nerve sheath tumors of neurofibromatosis type 1 patients. Neurobiol Dis. 16 (1), 85-91 (2004).
- Jiang, W., et al. Efficacy and selectivity of nilotinib on NF1-associated tumors in vitro. J Neurooncol. 116 (2), 231-236 (2014).
- Jiang, W., Mautner, V. F., Friedrich, R. E., Kluwe, L. Preclinical assessment of the anticancer drug response of plexiform neurofibroma tissue using primary cultures. J Clin Neurol. 11 (2), 172-177 (2015).
- Montero-Pau, J., Gomez, A., Munoz, J. Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extraction method for the molecular ecology of zooplanktonic diapausing eggs. Limnology and Oceanography-Methods. 6, 218-222 (2008).
- Saraswat, M., Grand, R. S., Patrick, W. M. Desalting DNA by drop dialysis increases library size upon transformation. Biosci Biotechnol Biochem. 77 (2), 402-404 (2013).
- Iglesias-Bartolome, R., Martin, D., Gutkind, J. S. Exploiting the head and neck cancer oncogenome: widespread PI3K-mTOR pathway alterations and novel molecular targets. Cancer Discov. 3, 722-725 (2013).
