Fisyon mayası cinsel yaşam döngüsünün uzun süreli mikroskobu için tekrarlanabilir bir temel yöntem sunuyoruz. Açıklanan küçük ayarlamalarla, sunulan protokol, araştırmanın üreme sürecinin farklı adımlarına odaklanmasına izin verir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bölünme Maya Cinsel Yaşam Döngüsü Mikroskopi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe, mitotik hücre döngüsü ilerlemesinin düzenlenmesini, hücre bölünmesinin mekaniğini ve hücre polaritesini incelemede paha biçilmez bir model sistem olmuştur. Ayrıca, eşeyli üreme üzerine yapılan klasik deneyler, DNA rekombinasyonu ve mayozun mevcut anlayışı için çok önemli sonuçlar vermiştir. Fisyon mayası çiftleşmesinin daha yeni analizi, dışsal uyaran tepki mekanizmaları, polarize hücre büyümesi ve hücre-hücre füzyonu hakkında ilginç sorular ortaya çıkarmıştır. Bu konuları ayrıntılı olarak incelemek için, tüm cinsel yaşam döngüsünün mikroskobu için basit bir protokol geliştirdik. Burada açıklanan yöntem, belirli çiftleşme aşamalarını incelemek için kolayca ayarlanabilir. Kısaca, azot açısından zengin bir ortamda üstel faza büyütüldükten sonra, hücre kültürleri, keşfedilecek cinsel yaşam döngüsünün aşamasına uygun süreler boyunca azottan yoksun bir ortama kaydırılır. Hücreler daha sonra görüntüleme için özel, kolayca inşa edilen agaroz ped odalarına monte edilir. Bu yaklaşım, hücrelerin çiftleşmenin başlangıcından sporların son oluşumuna kadar izlenmesini sağlar.
Giriş
İki hücre arasındaki genetik değişim eşeyli üreme merkezi olay olmasına rağmen, hücre farklılaşmasını teşvik ortağı seçimi için izin hücre-hücre füzyonu yürütmek ve genomik istikrarı korumak olaylar zincirinin dayanmaktadır. Böylece cinsel yaşam döngüsü gelişimsel anahtarları ile ilgili biyolojik bir dizi soru incelemek için bir model sistem olarak kendini göstermektedir, fisyon maya bu olguları incelemek için cinsel döngüsü keşfetmek vb dışsal uyaranlara, plazma membran füzyon, kromozom ayrımı, yanıt faydalarını getirir Model sisteminin güçlü genetik, yüksek verimli yaklaşımları ve sofistike mikroskopi köklü. fisyon maya Sex P-hücre ve farklı çiftleşme tipl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
fizyon maya eşeyli üreme Mikroskopi analizi
1. Medya Hazırlık
- Glukoz: 10 g / L, KH 2 PO 4: 1 g / L, NaCl: birbirine karıştırılmasıyla az sporlaşma ortamının (MSL-H) 15 Hazırlama 0.1 g / L, MgSO 4 · 7H 2 A: 0.2 g / L. Ekleme Eser elementler (10,000X): 100 ul / L, vitaminler (1,000x): 1 ml / l ve 0.1 M CaCl2 mL / L. oda sıcaklığında (RT) 0.22 mikron gözenek boyutu filtre ve mağaza kullanarak Filtre sterilize.
- Aşağıdaki Vitaminler kullanarak (1,000x) hazır: Pantotenat: 1 g / L nikotinik asit: 10 g / L, inozitol: 10 g / L, Biyotin: 10 mg / l. 4 ° C de 0.22 mikr....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bir Azot Kaynak çıkarması üzerine Fisyon Maya Büyüme ve Çiftleşme Dinamikleri
Azot açlık füzyon maya cinsel üreme başlatılması için bir ön koşul olarak, vahşi tip homothallic H90 suşu, Şekil 1 'de tarif edilen protokol izlenerek, azot bakımından zengin azot yoksun ortama (Şekil 2) kayması üzerine izlenmiştir. Kısaca açıklamak gerekirse hücreler MSL + N ortam içerisinde üstel faz (OD = 0.5 600) O / N yetiştirilen toplandı, y.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Çevresel koşullar, ve besin kullanılabilirlik, özellikle güçlü fisyon maya fizyolojisini etkiler. Azot açlık eşeyli üreme bağlılık için gerekli olan ve başlangıçta mitoz hücre döngüsü ilerlemesinde çarpıcı değişiklikler (Ref. 21 ve Şekil 2) yol açar. Katlanarak büyüyen nüfus azot giderimi üzerine, bölünme sırasında hücre boyutu hızla (Şekil 2C) azalır ve hücrelerin çoğunluğu yeni doğmuş katlanarak büyüdü hücreleri (Ref. 21 ve Şekil 2B) uzunluğundan.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
AV bir EMBO uzun vadeli doktora sonrası burs tarafından desteklenmiştir. Martin laboratuarda araştırma bir ERC Başlangıç hibe (GeometryCellCycle) ve SGM bir İsviçre Ulusal Bilim Vakfı hibe (31003A_155944) tarafından finanse edilmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Glikoz | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4• 7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Pantotenat | AppliChem | A2088,0025 | |
| Nikotinik Asit | AppliChem | A0963,0100 | |
| İnositol | AppliChem | A1716,0100 | |
| Biotin | AppliChem | A0967,0250 | |
| Borik Asit | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4• 7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | |
| FeCl2• 6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| Molibden oksit (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4• 5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| Sitrik Asit | AppliChem | A2344,0500 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | Merck | 1.01217.1000 | |
| L-Lösin | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| Adenin Hemisülfat Tuzu, mini %99 | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| Urasil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| Vazelin | Reactolab | 92045-74-4 | |
| Parafin | Reactolab | 7005600 |
Kaynaklar
- Mata, J., Bahler, J. Global roles of Ste11p, cell type, and pheromone in the control of gene expression during early sexual differentiation in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (42), 15517-15522 (2006).
- Xue-Franzen, Y., Kjaerulff, S., Holmberg, C., Wright, A., Nielsen, O.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
