Dit werk beschrijft een in vitro differentiatie protocol bij gepigmenteerde, volwassen melanocyten uit menselijke pluripotente stamcellen te produceren via een neurale en melanoblast tussenstap met behulp van een feeder-vrij, 25 dagen protocol.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Feeder-vrij Afleiding van melanocyten uit menselijke pluripotente stamcellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) vormen een platform om menselijke ontwikkeling in vitro te bestuderen onder zowel normale als ziektecondities. Onderzoekers kunnen de differentiatie van hPSC's richten naar het celtype van belang door de kweekomstandigheden te manipuleren om signalen na te bootsen die tijdens de ontwikkeling worden gezien. Een van deze celtypen is de melanocyt, een pigmentproducerende cel van neurale-kam (NC) oorsprong die verantwoordelijk is voor de bescherming van de huid tegen UV-straling. Dit protocol presenteert een uitbreiding van een momenteel beschikbaar in vitro Neurale-kam differentiatieprotocol van hPSC's om NC verder te differentiëren in volledig gepigmenteerde melanocyten. Melanocyt-precursors kunnen worden verrijkt uit het Neurale-kam protocol via een getimede blootstelling aan activatoren van WNT-, BMP- en EDN3-signalering onder dubbel-SMAD-remmingscondities. De resulterende melanocyt-precursors worden vervolgens gezuiverd en gerijpt tot volledig gepigmenteerde melanocyten door cultuur in een selectief medium. De resulterende melanocyten zijn volledig gepigmenteerd en kleuren op de juiste manier voor eiwitten die kenmerkend zijn voor rijpe melanocyten.
Inleiding
Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) bieden een platform om de normale differentiatie na te bootsen in een schaalbare manier voor de ziekte modelleren, drug discovery, en cel vervangende therapieën 1-6. Van bijzonder belang, hPSCs openstellen van mogelijkheden voor het bestuderen van moeilijk te isoleren of zeldzame / transient types cel waar de patiënt monsters zijn schaars. Bovendien, geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) onderzoekers in staat om ontwikkeling en ziekte modelleren studeren in een patiënt specifieke manier om unieke mechanismen 1,2,7-11 ontrafelen. De eerder gepubliceerde protocol voor differentiatie van melanocyten....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
LET OP: De melanocyten protocol hier beschreven werd voor het eerst gedemonstreerd door Mica et al.
1. Voorbereiding van Cultuur Medium, Coated Schotels en onderhoud van hPSCs
- mediumbereiding
Opmerking: Bewaar alle bij 4 ° C in het donker gedurende maximaal 2 weken. Filter alle medium voor sterilisatie.- Bereid DMEM / 10% FBS. Meng 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep en 5 ml L-glutamine. Filter voor sterilisatie.
- Bereid hESC-medium. Meng 800 ml DMEM / F12, 200 ml KSR, 5 ml L-Glutamine, 10 ml MEM minimale essentiële aminozuren oplossing, 1 ml β-mercaptoethanol en 5 ml Pen / Strep. Na affiltreren v....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol verschaft een werkwijze voor het afleiden volledig gepigmenteerde volwassen melanocyten uit hPSCs in een in vitro voedingsvrije, kostenefficiënt en reproduceerbare wijze. In tegenstelling tot de eerder vastgestelde Fang et al. Protocol HPSC-afgeleide melanocyten, heeft de geschetste protocol niet geconditioneerd medium vereist en vermindert de vereiste tijd. Fang et al. Protocol gebruikt geconditioneerd medium van een Wnt3a-producerende cellijn van.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Voor de succesvolle differentiatie van melanocyten uit hPSCs de volgende suggesties in overweging moeten worden genomen. Allereerst is het noodzakelijk om onder steriele kweekomstandigheden te allen tijde. Daarnaast is aangevangen met pluripotente volledig ongedifferentieerde hPSCs; indien de startpopulatie gedifferentieerde cellen bevat zal de opbrengst steeds dalen als de verontreinigingen niet kunnen worden gericht op melanocyten en kunnen verder verstoren de juiste differentiërende cellen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen conflicterende belangen te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een beurs voor melanoom onderzoekers van de Joanna M. Nicolay Foundation en door de National Institutes of Health onder Ruth L. Kirschstein National Research Service Award F31. Dit werk werd verder ondersteund door middel van subsidies uit NYSTEM en de Tri-institutionele stamcel-initiatief (Starr Foundation).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Ascorbic Acid (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
| B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
| BMP4 | R&D Systems | 314-bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
| cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
| Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | 50 μM |
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
| DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133--032 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3 (Endothelin-3, human) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | 200 μg/ml |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | 0.1% in PBS | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Human insulin | Sigma | I2643 | |
| ITS+ Universal Culture Supplement Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
| Low glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | Dissolve 1:20 in DMEM/F12 |
| MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-8105M | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
| Progesterone | Sigma | P8783 | 0.032 g in 100 ml 100% ethanol |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| FGF2 (Recombinant human FGF basic) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μg/ml |
| TYRP1 (G-17) Antibody | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
| TYRP2 Antibody | Abcam | 74073 | 1:200 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | 10 mM |
Referenties
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
