Questo lavoro descrive un protocollo in vitro la differenziazione di produrre pigmentate, i melanociti maturi da cellule staminali pluripotenti umane tramite una cresta neurale e melanoblast fase intermedia utilizzando un protocollo senza alimentatore 25 giorni.
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Articolo metodologico
Derivazione senza alimentatore di melanociti da cellule staminali umane pluripotenti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) rappresentano una piattaforma per studiare lo sviluppo umano in vitro sia in condizioni normali che di malattia. I ricercatori possono dirigere la differenziazione delle hPSC nel tipo di cellula di interesse manipolando le condizioni di coltura per ricapitolare i segnali osservati durante lo sviluppo. Uno di questi tipi di cellule è il melanocita, una cellula produttrice di pigmenti di origine cresta neurale (NC) responsabile della protezione della pelle dall'irradiazione UV. Questo protocollo rappresenta un'estensione di un protocollo di differenziazione in vitro delle creste neurali attualmente disponibile dalle hPSC per differenziare ulteriormente le NC in melanociti completamente pigmentati. I precursori dei melanociti possono essere arricchiti dal protocollo Neural Crest tramite un'esposizione temporizzata agli attivatori della segnalazione WNT, BMP e EDN3 in condizioni di doppia inibizione SMAD. I precursori dei melanociti risultanti vengono quindi purificati e maturati in melanociti completamente pigmentati mediante coltura in un mezzo selettivo. I melanociti risultanti sono completamente pigmentati e si colorano in modo appropriato per le proteine caratteristiche dei melanociti maturi.
Introduzione
Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) forniscono una piattaforma per imitare la differenziazione normale in un modo scalabile per la modellazione della malattia, lo screening di stupefacenti, e le terapie di sostituzione cellulare 1-6. Di particolare interesse, hPSCs aprono strade per studiare difficili da isolare o tipi di cellule rare / transitori in cui i campioni dei pazienti sono scarse. Cellule staminali pluripotenti Inoltre, indotte (iPSCs) permettono ai ricercatori di studiare lo sviluppo e la modellazione della malattia in modo specifico paziente a svelare i meccanismi unici 1,2,7-11. Il protocollo precedentemente pubblicato p....
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Protocollo
NOTA: Il protocollo di melanociti qui delineato è stato dimostrato da Mica et al.
1. Preparazione del terreno di coltura, patinata Piatti e manutenzione di hPSCs
- Media Preparazione
Nota: Conservare tutto media a 4 ° C al buio fino a 2 settimane. Filtro di medie per la sterilizzazione.- Preparare DMEM / 10% FBS. Mescolare 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep e 5 ml di L-glutammina. Filtro per la sterilizzazione.
- Preparare hESC-media. Mescolare 800 ml DMEM / F12, 200 ml KSR, 5 ml di L-glutammina, 10 ml minimo indispensabile soluzione MEM aminoacidi, 1 ml di beta-mercaptoetanolo, e 5 ml Pen / Strep. ....
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Risultati
Questo protocollo fornisce un metodo per derivare completamente pigmentate, melanociti adulte hPSCs in un alimentatore-libera, economicamente efficiente e riproducibile modo in vitro. In contrasto con il precedentemente stabilito Fang et al. Protocollo per melanociti HPSC-derivati, il protocollo descritto non richiede terreno condizionato e diminuisce il tempo richiesto. Il protocollo Fang et al. Utilizzato mezzo condizionato da una linea di cellule murine Wnt3.......
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Discussione
Per la differenziazione di successo dei melanociti da hPSCs i seguenti suggerimenti dovrebbero essere presi in considerazione. Innanzitutto, è essenziale lavorare in condizioni di coltura sterili in ogni momento. Inoltre, è importante iniziare con pluripotenti, hPSCs completamente indifferenziate; se la popolazione di partenza contiene cellule differenziate del rendimento invariabilmente cadere come gli agenti inquinanti non possono essere indirizzate verso i melanociti e può anche distruggere ulteriormente le celle cor.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi in conflitto di rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio per i ricercatori di melanoma dal Joanna M. Nicolay Foundation e dal National Institutes of Health sotto Ruth L. Kirschstein Nazionale Premio Research Service F31. Questo lavoro è stato ulteriormente supportato attraverso sovvenzioni dal NYSTEM e l'iniziativa di cellule staminali Tri-istituzionale (Starr Foundation).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| apo transferrina umana | Sigma | T1147 | |
| Acido ascorbico (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
| B27 (integratore B27) | Invitrogen | 17504044 | |
| β-Mercaptoetanolo | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
| BMP4 | R& D Systems | 314-bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R& D Systems | 4423 | 6 mM |
| Tossina colera | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
| cAMP (AMP ciclico) | Sigma | D0627 | 100 mM |
| Desametasone | Sigma | D2915-100MG | 50 μ M |
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
| DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Miscela di nutrienti F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133--032 | |
| DMEM/F12 polvere | Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3 (Endotelina-3, umana) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μ M |
| Fibronectina | BD Biosciences | 356008 | 200 μ g/ml |
| di gelatina (PBS senza Mg/Ca) | in casa | 0,1% in PBS | |
| Glucosio | Sigma | G7021 | |
| Insulina umana | Sigma | I2643 | |
| ITS+ Universal Culture Supplement Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| KSR (sostituzione del siero knockout) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-glutammina | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
| DMEM a basso contenuto di glucosio | Invitrogen | 11885-084 | |
| Matrice Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Dissolvenza 1:20 in DMEM/F12 |
| MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
| MEM soluzione minima di aminoacidi essenziali | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| Fibroblasti embrionali di topo (7 milioni di cellule/fiala) | GlobalStem | GSC-8105M | |
| Laminina-I di topo | R& D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
| Mezzo neurobasale | Invitrogen | 21103049 | |
| Penicilina/Streptomicina | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10.000 U/ml |
| Poly-L Omithin bromidrato | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
| Progesterone | Sigma | P8783 | 0,032 g in 100 ml 100% etanolo |
| Putrescina dicloridrato | Sigma | P5780 | |
| FGF2 (FGF umano ricombinante basico) | R& D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
| SB431542 | Tocris-R& D Systems | 1814 | 10 mM |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Bicarbonato di sodio | Sigma | S5761 | |
| SCF (Fattore di cellule staminali, umano ricombinante) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μ g/ml |
| TYRP1 (G-17) Anticorpo | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
| TYRP2 Anticorpo | Abcam | 74073 | 1:200 |
| Tripsina-EDTA (0,05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dicloridrato | Tocris-R& D Systems | 1254 | 10 mM |
Riferimenti
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature.
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Ristampe e permessi
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