Nötrofiller en bol bulunan beyaz kan hücresi türüdür. Nötrofillerin insan kanından yoğunluk gradyan ayırma yöntemi ile izolasyonu ve insan promiyelositik (HL60) hücrelerinin granülositik yol boyunca farklılaşması burada açıklanmaktadır; lenfoma hücrelerinin anti-lenfoma ajanlarına duyarlılığı üzerindeki rolünü test etmek.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme
Bu makalede
Özet
Özet
Nötrofiller, en bol bulunan (%40 ila %75) beyaz kan hücresi türüdür ve iltihap bölgesine doğru göç eden ilk enflamatuar hücreler arasındadır. Doğuştan gelen bağışıklık sisteminde kilit oyunculardır ve kanser biyolojisinde önemli roller oynarlar. Nötrofiller, malign transformasyon, tümör progresyonu, anjiyogenez ve antitümör bağışıklığının modülasyonunda anahtar mediatörler olarak önerilmiştir; çözünür faktörlerin salınması veya tümör hücreleri ile etkileşimleri yoluyla. Nötrofillerin spesifik fonksiyonlarını karakterize etmek için, nötrofillerin insan kanından in vitro izolasyonu için hızlı ve güvenilir bir yöntem rağbet görmektedir. Burada, nötrofillerin yanı sıra mononükleer hücreleri kandan izole etmek için bir yoğunluk gradyan ayırma yöntemi gösterilmiştir. Prosedür, kronik lenfositik lösemi (KLL) tanısı konan hastalardan elde edilen seyreltilmiş kanın üzerine Ficoll gibi yoğunluk gradyan solüsyonunun dikkatlice katmanlanması, ardından santrifüjleme, mononükleer tabakanın izolasyonu, nötrofillerin eritrositlerden dekstran ile ayrılması ve ardından rezidüel eritrositlerin parçalanmasından oluşur. Bu yöntemin nötrofilleri %90 saflıkta izole ≥ gösterilmiştir. Tümör mikroçevresini taklit etmek için, Matrigel gibi bazal membran matrisi kullanılarak 3 boyutlu (3D) deneyler yapıldı. Nötrofillerin in vitro kısa yarı ömrü göz önüne alındığında, taze insan nötrofilleri ile 3D deneyler yapılamaz. Bu nedenle promiyelositik HL60 hücreleri, dimetil sülfoksit (DMSO) ve retinoik asit (RA) farklılaşma indükleyicileri kullanılarak granülositik yol boyunca farklılaşır. Deneylerimizin amacı, nötrofillerin lenfoma hücrelerinin anti-lenfoma ajanlarına duyarlılığı üzerindeki rolünü incelemektir. Bununla birlikte, bu yöntemler, nötrofillerin veya nötrofil benzeri hücrelerin farklı durumlarda çok çeşitli hücre tipleri ile etkileşimlerini incelemek için genelleştirilebilir.
Giriş
Doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, tümör mikro içindeki hücrelerin önemli bir kısmını oluşturmaktadır ve hastalar ve kanser 1 hayvan modellerinde tümör kanser ile ilişkilidir. Son zamanlarda, daha yaygın kronik immün yanıtları kemoterapiler 2 tümör ilerlemesi, metastaz ve direnç teşvik kritik bir rol oynayan takdir haline gelmiştir. Makrofajlar ile doğrudan kemoterapi 3,4 tümör hücresi yanıtı düzenleyen gösterilmiştir önemli doğuştan gelen bağışıklık hücrelerdir. Bununla birlikte, anti-kanser tedavisine, tümör yanıtı düzenleyen nötrofillerin, doğuştan gelen bağışıklık sisteminde anahtar oyuncular rolü bilinmemektedir. Bu protokoller....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Primer lösemik hücreler ile 1. Nötrofil İzolasyon ve Co-kültür
NOT: Prosedürler bilgilendirilmiş onam imzalanması tüm hastalarda Lyon Hastane Etik kurul onayı altında gerçekleştirilmiştir.
- Birincil lösemik hücreler ve nötrofillerin izolasyonu
- Kronik lenfositik lösemi (KLL) tanısı hastaların EDTA (kan mililitrede 1.8 mg EDTA) periferik kan tüpleri toplamak.
- Bir steril 50 ml tüp kan her biri 15 ml ilave edilir ve 15 ml RPMI seyreltin (seyreltme 1: 1), daha sonra dikkatli bir şekilde yavaş yavaş fazlar karıştırılmadan tüpün dibine yoğunluk gradyan çözeltisi 15 ml ilave ediniz. yoğunluk gradyan ç....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
, Beyaz bir halka tek-çekirdekli hücreleri temsil eder, trombositler ve plazma. Burada tarif edilen yoğunluk gradyan ayırma yöntemi CLL hasta kanından izole primer lösemik hücreler ve uyarılmamış nötrofiller Şekil 1A, yukarıdan aşağıya doğru (yoğunluk gradyanlı santrifüj işlemi sonrasında elde edilen farklı kan katmanları temsil içerir yoğunluk gradyan çözeltisi, granülositler ve eritrositler). Şekil 1B ve 1C, sırasıyla nötrofil (çok loblu çekirdek hücre.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
yoğunluk gradyanlı santrifüj yaklaşımı kullanarak yüksek saflıkta insan kanından nötrofıller izolasyonu için ve aynı kademe tek çekirdekli hücreler içinde, burada etkili, basit, hızlı ve ucuz bir protokol açıklanan, aynı zamanda ayrılmakta ve geri kazanılmaktadır. izole edilmiş hücre popülasyonları ≥90% saftır.
Çeşitli yöntemler insan kanından nötrofil izolasyonu için kullanılabilir. Bu süreksiz gradyanlar 11,12 kullanarak veya nötrofiller immüno-manyetik bu daha sonra CD16- bağla.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma Institute National du Cancer (INCa-DGOS-4664) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Gibco Invitrogen | 21875-034 | |
| Fetal sığır serumu (FBS) | Gibco Invitrogen | 10270-106 | |
| Fosfat tamponlu salin (PBS kalsiyum ve magnezyum içerir) | Gibco Invitrogen | 14040-091 | |
| N-asetil-L-alanil-L-glutamin (L-Glutamin) | Yaşam teknolojileri | 25030-024 | |
| Penisilin streptomisin (Pen Strep) | Yaşam teknolojileri | 15140-122 | |
| Bruton tirozin kinaz (Btk) inhibitörü (Ibrutinib) | CliniSciences | A3001 | |
| Vincristine | EG labo | ||
| BD Matrigel bazal membran matrisi | BD Biosciences | 354234 | Deney gününden önce gece boyunca (O>N) gece boyunca (C'ye koyun |
| . Kırmızı hücre lizis tamponu | BD Biosciences | 555899 | |
| Ficoll (Pancoll) | PAN Biotech | P04-60500 | |
| Dekstran | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Dimetil sülfoksit (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Retinoik asit | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Sığır serum albümini (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Sodyum klorür (NaCl) | Euromedex | S3014 | |
| Ek V-FLOUS boyama kiti ve nbsp; | Roche | 11 988 549 001 | |
| Kiti RAL 555 Modifiye Giemsa boyama kiti | Cosmos Biyomedikal | CB361550-0000 | |
| LSRII akış sitometrisi | BD Biosciences | ||
| Sitosantrifüj | Thermo Scientific | ||
| Leica DMR-XA mikroskobu | Leica Microsystems | ||
| Cellometer Otomatik T4 Hücre Canlılık Sayacı | Nexcelom Bioscience |
Kaynaklar
- Gocheva, V., et al. IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion. Genes Dev. 24, 241-255 (2010).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, Inflammation, and Cancer. Cell. ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
