Abstract
चिकन भ्रूण भ्रूण के विकास के अध्ययन के रूप में जीन समारोह की जोड़तोड़ ओवो में रिश्तेदार आसानी से किया जा सकता है के लिए आदर्श मॉडल प्रणालियों रहे हैं। भीतरी कान श्रवण संवेदी अंग हमारे सुनने की क्षमता के लिए महत्वपूर्ण है। यह एक अति विशिष्ट संवेदी उपकला कि mechano-transducing बालों की कोशिकाओं की (एचसीएस) होते हैं और आसपास के समर्थन कोशिकाओं (एससी) glial की तरह घरों। श्रवण अंगों में संरचनात्मक मतभेदों के बावजूद, आणविक श्रवण अंग के विकास के विनियमन तंत्र evolutionarily स्तनधारियों और एविस के बीच संरक्षित कर रहे हैं ओवो electroporation में काफी हद तक E1 पर प्रारंभिक दौर तक ही सीमित है। - E3। E5 पर श्रवण अंग के रिश्तेदार देर से विकास के कारण, पिछले E3 ओवो electroporation में से श्रवण अंग की जोड़तोड़ बाद के चरणों में चिकन भ्रूण के उन्नत विकास की वजह से मुश्किल हो जाता है। यहाँ प्रस्तुत विधि पर ब्याज की जीन को निशाना बनाने के लिए एक क्षणिक जीन स्थानांतरण विधि हैमंच इ 4 - ओवो सूक्ष्म electroporation में के माध्यम से विकासशील चिकन श्रवण संवेदी अंग में E4.5। इस विधि gain- और हानि के कार्यों पारंपरिक प्लास्मिड डीएनए आधारित अभिव्यक्ति वैक्टर के साथ के लिए लागू है और कम से पूरे भ्रूण को edu (5-ethynyl 2'- deoxyuridine) जोड़कर ओवो सेल प्रसार परख के साथ जोड़ा जा सकता है electroporation का समय है। हरे या लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP या आरएफपी) अभिव्यक्ति plasmids के उपयोग के प्रयोगकर्ता जल्दी से निर्धारित करने के लिए electroporation सफलतापूर्वक विकसित भीतरी कान की श्रवण हिस्से को निशाना बनाया या नहीं। इस विधि पत्र में, GFP electroporated नमूनों के प्रतिनिधि उदाहरण सचित्र हैं; electroporation के बाद 96 घंटा और श्रवण अंग के समर्थक संवेदी क्षेत्र के लिए GFP के लक्षित कर सीटू संकरण में शाही सेना द्वारा पुष्टि की गई - भ्रूण 18 काटा गया। विधि कागज भी अनुरूप edu सेल prolif का विश्लेषण करने के thymidine के उपयोग के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करता हैeration; कि इम्युनो-लेबलिंग को जोड़ती है और edu रसायन शास्त्र क्लिक एक edu आधारित सेल प्रसार परख का एक उदाहरण प्रदान की जाती है।
Introduction
और स्तनधारी और एवियन श्रवण संवेदी अंग के बीच सेलुलर patterning आकृति विज्ञान में मतभेद के बावजूद, आणविक कारकों और संवेदी कोर्ट विकास के लिए जिम्मेदार रास्ते evolutionarily 1-3 संरक्षित करने लगा रहे हैं। आधारी अंकुरक, जो श्रवण HCS और उनके आसपास के घरों में अनुसूचित जाति, भीतरी कान otocyst के एक outpocketing के रूप में विकसित करता है। प्रारंभिक कोर्ट और सुप्रीम कोर्ट पूर्वज का एक पूल पर कान का placode / कान कप तंत्रिका-संवेदी सक्षम डोमेन (एनएसडी) के भीतर निर्दिष्ट किया जाता है। किस्मत मानचित्रण डेटा सबूत है कि neuronal और संवेदी प्रजातियों जुड़ा हुआ है और एनएसडी कान कप के Antero उदर क्षेत्र में स्थित या चूहों और चिकन 4,5 में otocyst से उत्पन्न होती हैं प्रदान करते हैं। सबसे पहले, neuroblasts एनएसडी से delaminate श्रवण-vestibular नाड़ीग्रन्थि, जो अंततः श्रवण और vestibular गैन्ग्लिया में विभाजित के न्यूरॉन्स को जन्म देने के लिए। इन न्यूरॉन्स भीतरी कान और मस्तिष्क में नाभिक का संवेदी HCS अंदर आना। कोशिकाओं वेंपर एनएसडी में रहने mechano-transducing संवेदी HCS और उनके संबद्ध अनुसूचित जाति से मिलकर, श्रवण संवेदी अंग सहित विभिन्न संवेदी पैच, को जन्म देने के लिए लगा रहे हैं।
दोनों लड़की और murine में, श्रवण अंग संवेदी पूर्वज सेल चक्र से बाहर निकलें और कोर्ट भेदभाव ढ़ाल के विरोध में होते हैं। लड़की में, श्रवण पूर्वज सेल चक्र से बाहर निकलें ~ E5 के आसपास शुरू होता है और शीर्ष करने के लिए आधार से प्रगति, और केंद्र से परिधि से 6। एक दिन बाद, कोर्ट भेदभाव सर्वोच्च में शुरू होता है और बेस से 7 प्रगति। चिकन में भीतरी कान के विकास का अध्ययन कर के रूप में कार्य तंत्र ओवो के रूप में अन्य मॉडल प्रणाली में गर्भाशय, जो जटिल सर्जरी की आवश्यकता है में भ्रूण से छेड़छाड़ के लिए विरोध के रूप में रिश्तेदार आसानी से जांच की जा सकती है कई तकनीकी लाभ प्रदान करता है। विधि यहाँ वर्णित ओवो सूक्ष्म electroporation में उपयोग करता प्रकल्पित basila में ब्याज की जीन को लक्षित करने केविशेष रूप से E4 पर कान पुटिका में आर अंकुरक क्षेत्र पूर्वकाल पेट के बल।
ओवो electroporation में एक तकनीक है कि अच्छी तरह से स्थापित है और आमतौर पर 8-14 प्रयोग किया जाता है। Electroporation तकनीक के सिद्धांत तथ्य यह है कि न्यूक्लियोटाइड (जैसे, प्लास्मिड डीएनए, सिंथेटिक डीएनए, आरएनए या ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स) नकारात्मक आरोप लगाया जाता है पर आधारित है। डीएनए हित के ऊतकों में इंजेक्ट किया जाता है। एक विद्युत प्रवाह ऊतक भर में रखा जाता है, वर्तमान सेल दीवारों में क्षणिक pores खुल जाता है और के रूप में नकारात्मक आरोप लगाया डीएनए सकारात्मक इलेक्ट्रोड (एनोड) की ओर बहती है, डीएनए के तेज के लिए अनुमति देता है। लाभ के समारोह के प्रयोगों के लिए, ब्याज की जीन सामान्यतः अभिव्यक्ति plasmids कि हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) या लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) के लिए उपयुक्त अभिव्यक्ति कैसेट रोकने में subcloned रहे हैं। नुकसान के समारोह प्रयोगों प्लाज्मिड आधारित प्रमुख नकारात्मक repressor निर्माणों, या आरएनएआई, या morpholino निर्माणों के लिए ग रहे हैंommonly 15,16 इस्तेमाल किया। MicroRNA (miRNA) समारोह miRNAs स्पंज निर्माणों, जो आम तौर पर कर रहे हैं प्लाज्मिड आधारित बाधित करने के लिए, 17 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। के रूप में ओवो सूक्ष्म electroporation विधि में आसानी से पूरे भ्रूण को edu जोड़कर ओवो सेल प्रसार परख के साथ जोड़ा जा सकता है यहाँ वर्णित विधि, आणविक तंत्र है कि श्रवण अंग में प्रसार और भेदभाव पर नियंत्रण की जांच के लिए अनुमति देता है।
electroporation और edu के अलावा कान पुटिका, जो श्रवण अंग में सेल चक्र से बाहर निकलें की शुरुआत से पहले एक दिन में E4 पर किया जाता है। श्रवण अंग आम तौर पर 18 से प्रदर्शन किया है का विश्लेषण - E5 (संवेदी पूर्वज सेल चक्र से बाहर निकलें की शुरुआत), E6 (एचसी भेदभाव की शुरुआत), और E7 में electroporation के बाद 96 घंटा (एचसी भेदभाव के दौरान); और बाद में ~ E9 (एचसी भेदभाव के अंत में) करने के लिए। जीन स्थानांतरण के इस electroporation विधि, क्षणिक लगभग स्थायी ~ 4 दिनों का है becauएसई ब्याज की जीन जीनोम में एकीकृत नहीं है, लेकिन विधि उचित प्लास्मिड डीएनए आधारित अभिव्यक्ति वैक्टर, जो इस तरह के Tol2 की मध्यस्थता जीन स्थानांतरण के रूप में 11, जीनोम में एकीकृत करने की क्षमता है के साथ प्रयोग के लिए लागू है। कोक्लीअ में 4 दिनों के लिए, जिसके बाद संकेतों बिंदु हो पाती है, अभी तक श्रवण अंग के जटिल विकास का अध्ययन करने के लिए एक पर्याप्त समय खिड़की प्रदान इस विधि मजबूत GFP या आरएफपी अभिव्यक्ति रहता है ~ के साथ। ओवो जीन स्थानांतरण विधि में इस उपन्यास है और विशेष रूप से E4 पर प्रकल्पित श्रवण अंग है, जो कि जांच श्रवण अंग में कोर्ट विकास पर ध्यान केंद्रित करने के लिए इष्टतम है लक्षित करने की अनुमति देता है। यह वैकल्पिक तरीकों, जो बहुत छोटी विकास के चरणों 11,12 या इन विट्रो आधारी papillae explant संस्कृतियों 18 के उपयोग की तुलना में electroporate करने के लिए एक अच्छा इसके अतिरिक्त है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
अंडे और unhatched भ्रूण के लिए परवाह है और नैतिकता की दृष्टि से और मानवता का व्यवहार कर रहे हैं। unhatched भ्रूण उपयोग के लिए सभी प्रोटोकॉल चिकित्सा, बाल्टीमोर, मैरीलैंड के जॉन्स हॉपकिन्स स्कूल में पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।
1. अंडे और अभिव्यक्ति निर्माणों के तैयारी
- अंडे:
- सेते 3 - 4 दर्जन निषेचित अंडे चिकन (Gallus Gallus) 37 डिग्री सेल्सियस पर झूठ बोल रही है अपने पक्ष पर फ्लैट।
- ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद, अंडे का दौर पीछे के अंत से एक सिरिंज के साथ अंडे की सफ़ेदी के 3 सीसी खींचने के लिए और स्पष्ट टेप के साथ छेद सील। यह भ्रूण और खोल के बीच एक हवा चैम्बर बनाता है, भ्रूण जब अंडा 19 की चोटी पर पहुँच के लिए खिड़की खोल काटने से चिपके हुए बिना भ्रूण के लिए उपयोग में आसानी के लिए अनुमति देता है।
- ऊष्मायन समय की 117 घंटा पर, हैम्बर्गर और हैमिल्टन 20 विकास के चरणों के अनुसार भ्रूण मंचइ 4 (HH24-25) पर (चित्रा -1 देखें)।
- सेते 3 - 4 दर्जन निषेचित अंडे चिकन (Gallus Gallus) 37 डिग्री सेल्सियस पर झूठ बोल रही है अपने पक्ष पर फ्लैट।
- अभिव्यक्ति निर्माणों:
- प्लास्मिड डीएनए अभिकर्मकों का उपयोग और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तैयारी किट के निर्माता द्वारा प्रदान प्रोटोकॉल तैयार करें। तैयारी के अंतिम चरण में, 500 μl ते (Tris-EDTA) एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में किट में दिए गए बफर में डीएनए elute।
- इथेनॉल डीएनए 3 एम सोडियम एसीटेट के 50 μl और ट्यूब के लिए 100% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़कर इसे ध्यान केंद्रित करने का वेग। -20 डिग्री सीओ / एन पर ट्यूब रखें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 14,000 rpm पर 30 मिनट के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र। तैरनेवाला निकालें और आरटी पर 10 मिनट के लिए गोली हवा सूखी। 15 μl ते बफर में गोली है, जो ~ 4 माइक्रोग्राम / μl की एकाग्रता भंग उपज चाहिए।
नोट: नियंत्रण अभिव्यक्ति यहां इस्तेमाल निर्माणों pMES-IRES-GFP 10 है, जो एक चिकन β-actin प्रमोटर द्वारा संचालित किया जाता है, या पीसीआई-H2B-IRES आरएफपी हैं
2. चिकन Ovo माइक्रो electroporation में और Ovo सेल प्रसार परख में
- अभिव्यक्ति का निर्माण और माइक्रो electroporation की Ovo माइक्रो इंजेक्शन में:
- एक 2.5 x 2.5 मिमी बॉक्स प्लेटिनम ताप फिलामेंट के लिए निम्नलिखित अनुकूलित मानकों के साथ एक सूक्ष्म पिपेट खींचने का उपयोग ठीक सुइयों में कांच केशिका ट्यूब खींचो: दबाव = 500, हीट = 600 डिग्री सेल्सियस, = 64 खींचो वेग = 105, और समय = 150 मिसे (1 टेबल देखें)।
- (चित्रा 1 ए देखें) बाएँ और दाएँ हाथ के सूक्ष्म जोड़तोड़ चरणों माइक्रोस्कोप flanking सेट करें। दाएं हाथ के सूक्ष्म जोड़तोड़ गिलास केशिका सुई और बाएँ हाथ सूक्ष्म जोड़तोड़ इलेक्ट्रोड (चित्रा 1 ए) रखती रखती है।
- सूक्ष्म इंजेक्शन काटने से पतले के लिए खींच लिया गिलास केशिका सुई तैयारएक संदंश के साथ सुई की नोक जबकि माइक्रोस्कोप के तहत काम कर रहे।
- माइक्रोस्कोप के तहत काम करते हुए 0.1% फास्ट ग्रीन से रंगा हुआ प्लास्मिड डीएनए के 2.5 μl के साथ सूक्ष्म जोड़तोड़ का उपयोग हाथ से मैन्युअल सुई भरें।
- अंडा अपने पक्ष पर झूठ बोल रही है एक फफूंदी / अंडा होल्डिंग डिवाइस के भीतर जगह (चित्रा 1 ए देखें)। अंडा कैंची 19 (चित्रा 1 ए) का उपयोग कर के शीर्ष पर एक दौर खिड़की में कटौती।
- माइक्रोस्कोप के तहत काम करते हैं, ध्यान से भ्रूण संदंश का उपयोग overlaying दो झिल्ली खुला।
- माइक्रोस्कोप के तहत काम करते हैं, मैन्युअल सूक्ष्म जोड़तोड़ का उपयोग करके और सूक्ष्म electroporation द्वारा दाहिने हाथ का उपयोग सूक्ष्म इंजेक्शन द्वारा सही कान पुटिका लुमेन के लिए प्लास्मिड डीएनए के लगभग ~ 0.5 μl उद्धार।
- ऐसा करने के लिए, सही कान पुटिका लुमेन राइट-हाथ सूक्ष्म जोड़तोड़ (चित्रा 1 बी-डी) के साथ डीएनए के साथ, जबकि एक ही समय में बाएं हाथ का उपयोग कर Holdin सूक्ष्म इंजेक्षनगा forcep, भ्रूण के सिर स्थिर करने के लिए भ्रूण के सिर चरण E4 में गिरावट की वजह से। पिछले कान पुटिका लुमेन सूक्ष्म इंजेक्षन मत करो, क्योंकि इस कान पुटिका को नुकसान होगा।
- इसके तत्काल बाद सूक्ष्म इंजेक्शन के बाद, जबकि माइक्रोस्कोप के तहत काम कर, सकारात्मक (एनोड) 2 मिमी प्लैटिनम इलेक्ट्रोड पूर्वकाल उदर सही कान पुटिका और नकारात्मक 2 मिमी इलेक्ट्रोड (कैथोड) समानांतर में जगह करने के लिए बाएँ हाथ सूक्ष्म जोड़तोड़ का उपयोग 1 मिमी के अलावा (चित्रा 1 देखें सी)। 100 मिसे अवधि और 200 मिसे अंतर के साथ 12 वी में 4 दालों देने। छोड़ कान पुटिका एक आंतरिक अनुपचारित नियंत्रण के रूप में कार्य करता है।
नोट: एक कपास इत्तला दे दी झाड़ू 1x पीबीएस में डूबा साथ electroporations के बीच में इलेक्ट्रोड को साफ करें।
- Ovo सेल प्रसार परख में:
- इसके तत्काल बाद electroporation के बाद 0.25 मिलीग्राम की 50 μl जोड़ने / एमएल 1x पीबीएस में edu मैन्युअल पूरे पर 50 μl edu समाधान छोड़ने के द्वाराओवो में भ्रूण एक पिपेट का उपयोग। टेप के साथ अंडे को सील करने और 18 के लिए इनक्यूबेटर पर लौटने - 96 घंटा।
- ध्यान से टेप को हटाने और 18 के बाद कान पुटिका के भीतर फ्लोरोसेंट GFP या आरएफपी संकेत के लिए भ्रूण की जांच - (चित्रा 1 देखें ईई ') एक मानक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर 24 घंटा। अगर फ्लोरोसेंट संकेत मौजूद है, इस बिंदु पर विश्लेषण के लिए भ्रूण फसल या टेप के साथ reseal और यह फसल कटाई के लिए इनक्यूबेटर में लौटने और बाद के चरणों में विश्लेषण करती है (चित्रा 1 देखें एफपी '')।
नोट: - electroporation 10 के बाद 7 घंटा pMES-IRES GFP के निर्माण के साथ GFP संकेत की अभिव्यक्ति 6 स्पष्ट है।
3. भ्रूण कटाई और आरएनए बगल में संकरण और immunohistochemistry में लिए ऊतक प्रसंस्करण
- संदंश का उपयोग भ्रूण हार्वेस्ट। ठंड 1x पीबीएस में भ्रूण कुल्ला। भ्रूण के सिर निकालें, अपनी गर्दन से सिर काटने से4% paraformaldehyde हे / एन में संदंश का उपयोग, और जगह सिर 4 डिग्री सेल्सियस पर। एक forcep का उपयोग कर सिर के अंदर 4% paraformaldehyde के प्रवेश की अनुमति देने के मस्तिष्क पंचर।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 30% sucrose में सिर में (1x पीबीएस) हे / एन निर्जलीकरण।
- सूखी बर्फ और methylbutane (2-Methylbutane) के एक घोल में तेजी से ठंड से cryoprotective माध्यम में सिर माउंट। वैकल्पिक रूप से, तेजी से तरल नाइट्रोजन के साथ cryoprotective माध्यम में सिर फ्रीज। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर मुहिम शुरू की अध्यक्ष हैं।
- 12 माइक्रोन मोटी ऊतक वर्गों में सिर cryosection और superfrosted माइक्रोस्कोप गिलास स्लाइड पर सभी भीतरी कान युक्त ऊतक वर्गों इकट्ठा।
- सीटू संकरण और immunohistochemistry में मानक आरएनए के रूप में पहले से वर्णित 4,21 प्रदर्शन, और किट के निर्माता द्वारा प्रदान प्रोटोकॉल के बाद edu सेल प्रसार के लिए विश्लेषण।
नोट: बाल कोशिकाओं खरगोश पॉलीक्लोनल का उपयोग कर पहचाना जा सकता है α-MyosinVIIa (Myo7a) एकtibody (1: 1000, बदलनेवाला बायोसाइंसेज) और fluorescently लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 250, बकरी विरोधी खरगोश AlexaFluor 488; Invitrogen)।
4. छवि पर कब्जा और प्रसंस्करण
- डिजिटल इमेजिंग उपकरणों के साथ छवियों को ले लो। एक मानक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप और एक मानक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप (5x से बढ़ाई में 40x को लेकर) का उपयोग करते हुए सीटू के परिणामों के साथ छवि immunohistochemistry का परिणाम है।
- इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों की प्रक्रिया।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
इस विधि कागज प्लाज्मिड हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन से मिलकर डीएनए में (GFP) अभिव्यक्ति कैसेट विकासशील चिकन आधारी अंकुरक (बीपी) 100 मिसे नाड़ी की अवधि के साथ 12 वी और 4 दालों और 200 मिसे के अंतराल के अनुकूलित मापदंडों के साथ में निशाना बनाया गया था, एक उपज ~ 50% भ्रूण जीवित रहने की दर और प्लाज्मिड डीएनए बीपी में लक्षित करने की दक्षता। भ्रूण के विकास में देशी GFP अभिव्यक्ति की फ्लोरोसेंट इमेजिंग दिखाया electroporation की इस विधि preferentially कि बीपी को जन्म देता है पूर्वकाल उदर otocyst के पहलू, लक्ष्य (चित्रा 1 ईई '; सफेद तीर) और GFP अभिव्यक्ति एक समय के पाठ्यक्रम पर पीछा किया जा सकता के लगभग ~ 4 दिनों के लिए (चित्रा 1 एह)। सीटू संकरण (ISH) में शाही सेना का निर्धारण करने के electroporation सफलतापूर्वक विकसित भीतरी कान की श्रवण हिस्से को निशाना बनाया है कि क्या इस्तेमाल किया गया था। निर्धारित करें कि क्या GFP श्रवण द्वारा लिया गया थासंवेदी पूर्वज, ईश प्रयोगों आसन्न बीपी वर्गों पर प्रदर्शन किया गया। भीतर विकसित बीपी संवेदी पूर्वज Sox2 (चित्रा 1 कश्मीर और एन) और पागल फ्रिंज (Lfng) (चित्रा 1 जे) की उनकी अभिव्यक्ति द्वारा की पहचान की गई। इन प्रयोगों दिखाना है कि विकासशील बीपी भर संवेदी पूर्वज, के रूप में आधार (चित्रा 1 मैं, काले ब्रैकेट) के लिए दिखाया गया है और शीर्ष (चित्रा 1 एल, काले ब्रैकेट), सफलतापूर्वक लक्षित और electroporation की 68 घंटा (चित्रा 1 मैं के बाद व्यक्त GFP थे और एल, काले कोष्ठक)। इसके अलावा, GFP गैर-संवेदी उपकला कोशिकाओं में संवेदी डोमेन के बाहर व्यक्त की गई थी (चित्रा 1 मैं और एल, लाल तीर) और श्रवण नाड़ीग्रन्थि (चित्रा 1 मैं और एल; एजी, पीले तीर) में Neurod1 अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित (चित्रा 1 मी) । एक ठेठ प्रयोग GFP में (चित्रा 1 एच) के लिए बनी; इस अन्वेषक विकासशील बी.पी. में संवेदी पूर्वज सेल चक्र वापसी और भेदभाव के स्थानिक और लौकिक पैटर्न का विश्लेषण करने की अनुमति देता है। संवेदी progenitors के proliferative व्यवहार का निर्धारण करने के लिए, thymidine अनुरूप edu E4 पर electroporation के समय में जोड़ा गया है। चार दिन बाद, विकासशील बी.पी. में edu समावेश का उपयोग कर "क्लिक" रसायन शास्त्र ऊतक वर्गों में विश्लेषण किया गया था। HC-विशिष्ट प्रोटीन MyosinVIIa (Myo7a) के लिए इम्यूनो-लेबलिंग के विकास बी.पी. में फर्क एचसीएस की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। है, जबकि बेस में केवल कुछ Myo7a + HCS शामिल किया था edu (चित्रा 1 ऊ; बीपी Myo7a के शिखर हिस्से में + HCS थे अक्सर edu (+ ', सफेद तीर चित्रा 1 पीपी' पी ')'; हे ', सफेद तीर), E4 पर edu अलावा के समय में सुझाव है कि, संवेदी समर्थकबेस में genitors पहले से ही काफी हद तक mitotic पोस्ट कर रहे हैं। इन परिणामों लड़की बीपी 6.7 में सेल चक्र से बाहर निकलें और कोर्ट भेदभाव की ढ़ाल के विरोध के पिछले अध्ययनों की पुष्टि करें।
चित्रा 1. ओवो electroporation में और Ovo सेल प्रसार परख में। (एडी) Brightfield में पूर्वकाल उदर क्षेत्र को लक्षित सूक्ष्म इंजेक्शन के बाद सही कान पुटिका (बी) और इलेक्ट्रोड के प्लेसमेंट में electroporation विधि की छवियों। ओवो माइक्रो इंजेक्शन में कान पुटिका (सी)। सूक्ष्म इंजेक्शन और electroporation (; हरी कान पुटिका, काला तीर डी) के बाद मंच HH24-25 पर भ्रूण। (एह) हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) electroporation के बाद अभिव्यक्ति। (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ओवो सूक्ष्म electroporation में की यहाँ वर्णित विधि को विकसित करने श्रवण अंग में जीन स्थानांतरण के लिए अनुकूलित है। यह प्लास्मिड डीएनए आधारित अभिव्यक्ति वैक्टर आमतौर पर जीन समारोह / अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल के साथ संगत है। E4 पर electroporation के समय जांच कि श्रवण अंग में कोर्ट विकास पर ध्यान केंद्रित करने के लिए इष्टतम है। सबसे महत्वपूर्ण कदम सुई के साथ भी गहरी जा रहा है और कान पुटिका को नुकसान पहुँचाए बिना कान पुटिका लुमेन में डीएनए सूक्ष्म इंजेक्शन हैं (छवि। 1 ए डी देखें), द्वारा कान पुटिका के पूर्वकाल उदर डोमेन में डीएनए को निशाना तदनुसार इलेक्ट्रोड रखने (चित्र देखें 1 सी।), और इन electroporation मापदंडों अनुकूलित और अनुकूलित प्लास्मिड डीएनए की एकाग्रता रहे हैं 12 वी में 4 दालों के अनुकूलित electroporation मापदंडों को पहुंचाने - विशेष रूप से प्रकल्पित श्रवण को निशाना बनाने के लिए (~ 3.5 4 माइक्रोग्राम / μl) E4 पर अंग। शुरू में हम शुरू कर दिया हेकेन्द्र शासित प्रदेशों के 6 वी, जो कोई फ्लोरोसेंट संकेतों झुकेंगे पर electroporations का आयोजन। वोल्टेज संवर्द्धित, 8 वी और 10 वी का उपयोग कर की वृद्धि हुई थी 12 वी इष्टतम जा रहा है। इसी तरह, दालों की संख्या वितरित करने के लिए और नाड़ी durations और दालों की रिक्ति अनुकूलित किया गया। 12 वी में 100 मिसे अवधि और 200 मिसे अंतर के साथ 4 दालों आदर्श है। इन मानकों न केवल E4 पर कुशल जीन स्थानांतरण प्राप्त करने के लिए आदर्श होते हैं, लेकिन यह भी लगभग ~ 50% की एक भ्रूण जीवित रहने की दर के लिए आदर्श होते हैं। कोई फ्लोरोसेंट संकेत electroporation की 24 घंटा के भीतर प्राप्त है, तो निम्न विचार किया जाना चाहिए: 1.) सुनिश्चित करें कि डीएनए एकाग्रता कम से कम 3.5 माइक्रोग्राम / μl है। 2.) electroporation पैरामीटर 2 वी द्वारा, उदाहरण के लिए 10 या 14 वी करने के लिए ऊष्मायन समय की 117 घंटा के भीतर इ 4 (HH24-25) चरण भ्रूण प्राप्त करने के लिए के रूप में समायोजित (चित्र देखें। 1 डी), अंडे के लिए इनक्यूबेटर तापमान चाहिए incu के अधिक या कम घंटे के साथ 39 डिग्री सेल्सियस - 37 के बीच अनुकूलित कियाbation समय का इस्तेमाल किया, तापमान के आधार पर 117 मानव संसाधन से अधिक की जरूरत है क्योंकि वहाँ पकड़ रहा है और विभिन्न प्रयोगशालाओं के बीच अलग अलग इन्क्यूबेटरों का उपयोग करते हुए चल रहे तापमान में बदलाव कर रहे हैं। BrdU (5 ब्रोमो 2'- डिऑक्सीयूरिडीन) या edu सहित विभिन्न thymidine analogs ओवो सेल प्रसार में अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, या तो परिसर के उपयोग के परिसर के बहुत ज्यादा के रूप में सेल / भ्रूण व्यवहार्यता के लिए विषाक्त साबित होता है और परिसर के बहुत कम अप्रभावी साबित होता है प्रत्येक विकास मंच के लिए अनुकूलित किया जाना है। इस विधि 0.25 मिलीग्राम / एमएल विशेष रूप से आगे E4 से सेल प्रसार और सेल चक्र से बाहर निकलने के अध्ययन के लिए ओवो में पूरे भ्रूण पर 50 μl के रूप में लागू की एकाग्रता में edu के अनुकूलित उपयोग का वर्णन करता है।
ओवो electroporation में जीन में गड़बड़ी की एक विधि के रूप में कुछ सीमाएं हैं। अंडे की एक रिश्तेदार बड़ी संख्या में उचित नियंत्रण निर्माणों के साथ E4 पर electroporations के लिए और Experimenta के लिए आवश्यक हैंएल की स्थिति। यह लगभग अंडे की एक अनुपात की वजह से है, ~ 27%, निषेचन की कमी, विकास दोष, और भ्रूण मौत का एक संयोजन के कारण electroporation के लिए व्यर्थ जा रहा है। एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू पर विचार करने के लिए electroporation के बाद भ्रूण की जीवित रहने की दर है। जीवित रहने की दर लगभग 50% है। यह सच है कि E4 पर पुराने भ्रूण हेरफेर किया जा रहा करने के बाद अच्छी तरह से जीवित नहीं है की वजह से है; युवा भ्रूण अधिक लचीला कर रहे हैं और बेहतर हेरफेर किया जा रहा सहन। E4 पर electroporation के बाद ब्याज की जीन का भाव फोकल और गैर-संवेदी और संवेदी ऊतकों के रूप में अच्छी तरह से श्रवण नाड़ीग्रन्थि सहित पूरे कर्णावत वाहिनी के दौरान स्थानीय कर रहे हैं। क्योंकि electroporation का लक्ष्य E4 पर प्रकल्पित, अविकसित श्रवण अंग है और अधिक फोकल और स्थानीय अभिव्यक्ति के लिए कारण है, पहले चिकन श्रवण अंग E5 पर बाहर विकसित करने के लिए शुरू होता है और ~ E9 1 से इसकी विशेषता दरांती के आकार का फार्म में elongates । अन्त में, धई विधि क्षणिक जहां अभिव्यक्ति संकेतों केवल ~ 4 दिनों के लिए बने हुए हैं, क्योंकि ब्याज की जीन यहां इस्तेमाल जीनोम में एकीकृत नहीं है। हालांकि, विधि उचित प्लाज्मिड आधारित अभिव्यक्ति निर्माणों कि जीनोम में एकीकृत करने के लिए क्षमता है के साथ प्रयोग किया जा सकता है।
electroporation विधि माहिर कुछ अभ्यास, प्रशिक्षित आंखों और हाथों, और चिकन भ्रूण के साथ काम करने में विशेषज्ञता की आवश्यकता है। भीतरी कान विकास और चिकन विकासात्मक एटलस के लिए प्रदान की संदर्भों एक नौसिखिया के लिए के रूप में अच्छा गाइड अच्छी शुरुआत अंक की सेवा और कर रहे हैं। इन अनुकूलित electroporation मापदंडों के साथ विधि माहिर के बाद, विधि ~ E4.5 को E2 से बंद कान पुटिका में जोड़तोड़ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि E2 और E3 पर electroporating के लिए, 10 वी के बजाय electroporation के लिए 12 वी की E1 पर कान का placode और कान का प्याला, संशोधित electroporation मापदंडों के साथ अनुकूलित प्लैटिनम इलेक्ट्रोड को लक्षित किया जाना चाहिए इस्तेमाल किया जा सकता
इसके अलावा, कुछ संशोधनों के साथ vestibular अंगों प्रस्तुत विधि के साथ लक्षित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, प्रकल्पित पूर्वकाल शिखा E3, जो पूर्वकाल उदर एनएसडी 9 के पृष्ठीय पूर्वकाल टिप पर झूठ पर लक्षित किया जा सकता है। लक्षित कर पूर्वकाल उदर कान पुटिका पैदावार संवेदी vestibular अंगों, अर्थात् cristae, और utricluar और saccular maculae के सभी में संवेदी और गैर-संवेदी ऊतक के भीतर अभी तक मजबूत GFP प्रतिलेख भाव फोकल E4 पर electroporating (डेटा) नहीं दिखाया।
अंत में, में ओवो यहाँ प्रस्तुत विधि के संचालन के लिए विशिष्ट है लाभ और E4 पर शुरू कार्यों और विकासशील चिकन श्रवण अंग में प्रसार और भेदभाव के अध्ययन के लिए-की हानि। इसके अलावा, इस विधि में आसानी से अन्य अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकतानेर कान भीतरी कान न्यूरोजेनेसिस और vestibular अंगों के विकास सहित विकास की घटना।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
हम अभिव्यक्ति plasmids के लिए और सीटू जांच में डॉ डोरिस लालकृष्ण वू धन्यवाद, संवेदी जीवविज्ञान इमेजिंग सुविधा के लिए जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय केंद्र और सुनवाई और संतुलन के लिए केंद्र। इस काम के लिए ले NIDCD अनुदान T32 DC000023 द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile 1x PBS pH 7.4 | gibco | 10010-023 | |
| Fast Green FCF Powder | Sigma | F7252-5G | |
| EdU Powder | Invitrogen | E10187 | |
| Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit | Invitrogen | C10338 | |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) | Qiagen | 12643 | |
| ECM 830 ElectroSquarePorator | BTX Harvard Apparatus | ||
| Banana to Micrograbber Cable Kit | BTX Harvard Apparatus | 45-0216 | |
| Right Handed & Left Handed Micromanipulators | World Precision Instruments Inc. | M3301R & M3301L | |
| Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts | World Precision Instruments Inc. | M10 | |
| Metal Steel Base Plate 12x24 inch | World Precision Instruments Inc. | 5479 | |
| Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors | World Precision Instruments Inc. | 14120 | |
| Micropippette Puller for pulling needles | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| 2.5x2.5 mm Box Platinum Heating Filament | Sutter Instrument Co. | ||
| Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm | FHC | 27-30-0 | |
| Hamilton Glass Syringe 100 μl | Hamilton | 80601 Model 710LT | |
| Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe | Fisher Scientific | O122-1 | |
| Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic | Becton Dickinson and Company (BD) | 427420 Intramedic Clay Adams Brand | |
| 3 cc Disposable Syringes | Becton Dickinson and Company (BD) | 309657 | |
| Disposable 21 Gauge Needles | Becton Dickinson and Company (BD) | 305122 | |
| One pair of 2 mm Platinum Electrodes | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY611P3-2 | |
| Electrode Holder | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY580 | |
| One pair of Dumont fine forceps number 5 | Fine Science Tools (FST) | ||
| Matte finish invisible tape for sealing eggs | Office Depot | 520-928 | |
| Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Sterile filter tips |
References
- Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).
- Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. Patterning of the mammalian cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).
- Whitfield, T. T. Development of the inner ear. Current opinion in genetics & development. 32, 112-118 (2015).
- Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134, 4405-4415 (2007).
- Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132, 1687-1697 (2005).
- Katayama, A., Corwin, J. T. Cell production in the chicken cochlea. The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).
- Cotanche, D. A., Sulik, K. K. The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos. Brain Res. 318, 181-193 (1984).
- Alsina, B., et al. FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo. Developmental biology. 267, 119-134 (2004).
- Chang, W., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. PLoS genetics. 4, e1000050 (2008).
- Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).
- Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear. Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).
- Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).
- Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick. The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).
- Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1. PLoS One. 7, 30871 (2012).
- Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental biology. 294, 554-563 (2006).
- Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation. Developmental biology. 392, 295-307 (2014).
- Kumar, M. S., et al. Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).
- Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla. Hearing research. 289, 27-39 (2012).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of visualized experiments: JoVE. , e306 (2007).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).
- Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).
- Bell, D., et al. Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode. Developmental biology. 322, 109-120 (2008).
