Séparation immunomagnétique de Sca1 Fat Depot spécifique<sup&gt; haute</sup&gt; Cellules souches adipeuses (CSA)

Résumé

Nous présentons les techniques nécessaires pour isoler la fraction vasculaire stromale (SVF) des dépôts de tissu adipeux inguinal (sous-cutané) et périgonadique (viscéral) de souris afin d’évaluer leur expression génique et leur activité collagénolytique. Cette méthode comprend l’enrichissement de cellules souches dérivées du tissu adipeux (ASC)^{Sca1 à haute} teneur en utilisant la séparation cellulaire immunomagnétique.

Résumé

L’isolement des cellules souches dérivées du tissu adipeux (ASC) est une méthode importante dans le domaine de la biologie du tissu adipeux, de l’adipogenèse et du remodelage de la matrice extracellulaire (MEC). In vivo, l’environnement riche en MEC composé de collagènes fibrillaires fournit un soutien structurel aux tissus adipeux pendant la progression et la régression de l’obésité. Le remodelage physiologique de la MEC médié par les métalloprotéinases matricielles (MMP) joue un rôle majeur dans la régulation de la taille et de la fonction du tissu adipeux^1,2. La perte de remodelage physiologique de la MEC collagénolytique peut entraîner une accumulation excessive de collagène (fibrose tissulaire), une infiltration de macrophages et, finalement, une perte d’homéostasie métabolique, y compris la résistance à l’insuline^3,4. Lorsqu’un changement phénotypique du tissu adipeux est observé dans des modèles murins ciblés par un gène, l’isolement des ASC primaires des dépôts de graisse pour les études in vitro est une approche efficace pour définir le rôle du gène spécifique dans la régulation de la fonction des ASC. Dans ce qui suit, nous définissons une séparation immunomagnétique des ASC^élevés de Sca1.

Introduction

La tige antigène de cellule 1 (SCA1 ou Ly6A / E) a d' abord été identifié comme un marqueur de surface cellulaire exprimée par hématopoïétiques et les cellules souches mésenchymateuses ^5,6. La fraction stroma vasculaire (FSV) du tissu adipeux obtenu à partir de dépôts de graisse de la souris est une population hétérogène de cellules comprenant des macrophages, des fibroblastes, des cellules endothéliales vasculaires, les cellules neuronales et les cellules progénitrices adipocytaires ^7. Les cellules progénitrices d'adipocytes ou cellules souches dérivées de tissu adipeux (ASC) sont des cellules non-lipidiques chargées qui résident dans l....

Protocole

Déclaration éthique: L'Université du Michigan Comité sur l'utilisation et l'entretien des animaux (UCUCA) a approuvé toutes les méthodes et protocoles en conformité avec le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (Institute for Laboratory Animal Research, Conseil national de recherches). Les souris sont maintenues dans une Université du Michigan vivarium et bénéficient d'un accès libre à la nourriture et de l'eau et maintenus sur un cycle de 12 heures foncé / lumière.

1. Préparatifs

1. Préparer les milieux de culture primaire avec DMEM, 10% de FBS, 1x P / S / G, et 1x antibiotiques / ....

Résultats

Enrichissement de ASCs ^élevés SCA1 de différents Pads Fat.

Les cellules stromales vasculaires isolées à partir de l' affichage de la graisse SQ fibroblaste, étirées la forme des cellules , indépendamment du niveau d'expression Sca1 (figure 1A). D'autre part, le VIS (EWAT-dérivée) des cellules à ^faible SCA1 ^élevé et SCA1 démontrent nette différence dans la forme de l.......

Discussion

Ici , nous démontrons l'isolement et la séparation cellulaire immunomagnétique de ASCs souris provenant de différents tampons de graisse et leur utilisation pour des expériences in vitro. La méthode présentée est efficace pour l'isolement rapide d' un grand nombre de ASCs de SCA1 positif, ce qui est avantageux par rapport à l'isolement techniquement complexe et coûteux FACS médiée par des ASCs ^9,14. A la différence FACS, la séparation cellulaire immunomagnétique ne permet pas l'ut.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Type 3 Collagénase	Worthington LS004182 biochimique		Digestion tissulaire
DMEM	Gibco	11965-092	Milieu de culture à haute teneur en glucose
Pen/Strep/Glutamine (100x)	Gibco	10378-016	Antibiotique de milieu
Anti-anti (100x)	Gibco	15240-062	Antifongique
de milieu FBS	Gibco	16000-044
PBS (1x, pH 7,4)	Gibco	10010-023
Trypsine (0,05 %)	Gibco	25300-054
Passoire cellulaire	BD Bioscience	352360	100-&mu ; Crépine à cellules m
Plaques de 60 mm	BD Falcon	353004
Ciseaux	FST	14001-12	Grands
ciseaux	FST	14091-11	Pointe fine et incurvée
Grande pince	FST	11000-12
Pince fine	Tout fournisseur
25G 5/8" aiguilles	BD	305122
Aiguilles 22G 1,5"	BD	305159
tubes coniques de 15 ml	BD Falcon	352097
tubes coniques de 50 ml Colonnes	BD Falcon	352098
MACS	Miltenyi Biotec	130-042-201
Kit de microbilles anti-Sca1 (FITC)	Miltenyi Biotec	130-092-529	FITC-anti-Sca1 1º ; Microbilles Ab et anti-FITC 2º ;
Tampon de roulement Ab AutoMACS	Miltenyi Biotec	130-091-221
Séparateur MiniMACS	Miltenyi Biotec	130-042-102
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Tampons chux bleus	Fisher	276-12424
Tampons absorbants	Fisher	19-165-621
Panneau de polystyrène			Utilisation à partir de tubes de 50
ml 70 % d’éthanol
Isoflurane	Tout fournisseur
Rat IgG2a Alexa Fluor 647	Invitrogen	R2a21
Rat IgG2a anti-souris Sca1 Alexa Fluor 647	Invitrogen	MSCA21
Rat IgG2a R-PE	Invitrogen	R2a04
Rat IgG2a anti-souris F4/80 R-PE	Invitrogen	MF48004
Tube à fond rond	BD Falcon	352058
HBSS (&ndash ; Ca, &ndash ; Mg)	Gibco	14175-095
HBSS (+Ca, +Mg)	Gibco	14025-092	Pour solution de collagénase
Collagène de type I (2,7 mg/ml dans 37mm d’acide acétique	Préparer en interne12
10x MEM	Gibco	11430-030
1 M HEPES	Gibco	15630-080
0.34 N NaOH	Préparer sur place
Lamelles de protection Corning		2870-22
Alexa Fluor 594 acide carboxylique, ester succinimidylique, mélange d’isomères	Invitrogen	A-20004
0,89 M NaHCO3  ;	Gibco	25080-094

de séparation